基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接分析雙蓮方治療肝細(xì)胞癌的作用機(jī)制*

張 依 張玉峰 牛文輝 戚亞婷 趙永華 樊亞芳

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤，占肝臟疾病的3%～4%和原發(fā)性肝癌的70%～90%，其發(fā)病率居世界第5 位，病死率居第3 位[1，2]。雖然HCC 的診療水平日益提高，但患者癥狀較易反復(fù)，生存質(zhì)量較低。

雙蓮方由半邊蓮、半枝蓮、夏枯草組成，具有清熱解毒、活血化瘀的功效，在治療肝癌時(shí)應(yīng)用廣泛。但是雙蓮方治療HCC 的作用機(jī)制尚不明確，缺少?gòu)姆肿?、通路等方面進(jìn)行系統(tǒng)研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合了基因和蛋白組學(xué)、生物信息學(xué)等多種理論及方法，可用于研究“藥物、靶點(diǎn)、疾病”三者間復(fù)雜的交互作用關(guān)系[3]。本文通過(guò)使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從活性成分、靶點(diǎn)、通路、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等方面對(duì)雙蓮方治療HCC 的作用機(jī)制進(jìn)行研究，為雙蓮方治療HCC 提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 篩選雙蓮方活性成分及靶點(diǎn) 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中，輸入半邊蓮、半枝蓮、夏枯草，以藥物口服生物利用度（OB）≥30%和藥物相似性（DL）≥0.18 為條件進(jìn)行檢索，得到活性成分和靶蛋白。將靶蛋白輸入“Uniprot”和“NCBI”數(shù)據(jù)庫(kù)，得到對(duì)應(yīng)的基因名稱(chēng)。

1.2 篩選HCC 靶點(diǎn) 使用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)“HCC”和“hepatocellular carcinoma”進(jìn)行檢索，獲得HCC靶點(diǎn)。

1.3 獲取HCC 與雙蓮方共同靶點(diǎn) 使用Draw Venn Diagram 對(duì)雙蓮方靶點(diǎn)及HCC 靶點(diǎn)取交集，并繪制Venn 圖。

1.4 構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖 使用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，再使用Network Analyzer 插件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，滿足連接度（Degree）大于平均值的活性成分為核心活性成分。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò) 將交集靶點(diǎn)輸入STRING 11.0，得到PPI 數(shù)據(jù)。使用Cytoscape 3.7.2 的Network Analyzer 插件對(duì)PPI 數(shù)據(jù)進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取連接度（Degree）、中心介數(shù)（Betweenness Centrality）和中心度數(shù)（Closeness Centrality）大于平均值的關(guān)鍵靶點(diǎn)再進(jìn)行PPI 分析，并使用cytoHubba 插件中連接度（Degree）算法對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，選取前5 位為核心靶點(diǎn)。

1.6 分子對(duì)接 從ZINC 和RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載核心活性成分和核心靶蛋白結(jié)構(gòu)。使用Autodock 4 軟件對(duì)核心活性成分和核心靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，選擇算法為拉馬克遺傳算法（Genetic Algorithm），得到結(jié)合自由能（binding energy）。

1.7 GO及KEGG分析將關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入DAVID 6.8，篩選滿足P ＜0.05 的GO 和KEGG 條目為顯著富集條目，其中GO 分析包括生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞定位（CC）和分子功能（MF）分析。

2 結(jié)果

2.1 篩選活性成分及靶點(diǎn) 使用TCMSP 檢索出雙蓮方的活性成分，其中包括半邊蓮71 個(gè)、半枝蓮94 個(gè)、夏枯草60 個(gè)，符合OB≥30%、DL≥0.18 并對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的有48個(gè)活性成分，對(duì)應(yīng)243 個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 篩選HCC 靶點(diǎn) 通過(guò)Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)分析，得到6910 個(gè)HCC 靶點(diǎn)。

2.3 篩選雙蓮方和HCC 交集靶點(diǎn) 通過(guò)Draw Venn Diagram 分析，得到206 個(gè)交集靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 雙蓮方-肝細(xì)胞癌交集靶點(diǎn)

2.4 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖 在Cytoscape 中構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。使用Network Analyzer 對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，得到活性成分的平均連接度為25.82978723，其中7 個(gè)活性成分的連接度大于平均連接度為核心活性成分，包括槲皮素（quercetin，連接度=409）、木犀草素（luteolin，連接度=168）、山奈酚（kaempferol，連接度=107）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，連接度=50）、豆甾醇（stigmasterol，連接度=43）、漢黃芩素（wogonin，連接度=40）和黃芩素（baicalein，連接度=34）。見(jiàn)圖2。

圖2 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用Cytoscape 3.7.2 的Network Analyzer 插件分析交集靶點(diǎn)的PPI 數(shù)據(jù)，得到連接度平均值為40.42156866、中心介數(shù)平均值為0.00159226 和中心度數(shù)平均值為0.528280539，其中71 個(gè)靶點(diǎn)的連接度、中心介數(shù)和中心度數(shù)大于平均值為關(guān)鍵靶點(diǎn)。對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 分析，篩選出5 個(gè)核心靶點(diǎn)，分別為蛋白激酶Bα（protein kinase Bα，AKT1，連接度=70）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53，連接度=70）、血管內(nèi)皮生成因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA，連接度=70）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3，CASP3，連接度=68）、原癌 基因jun（jun proto-oncogene，JUN，連接度=68）。見(jiàn)圖3。

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對(duì)接結(jié)果 使用Autodock 4 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，得到結(jié)合自由能。當(dāng)結(jié)合自由能＜0 kcal/mol 時(shí)，表示活性成分可與靶點(diǎn)自發(fā)結(jié)合，結(jié)合自由能越小，兩者的結(jié)合能力越強(qiáng)。對(duì)接結(jié)果顯示，結(jié)合自由能均在（-4.13～-6.89）kcal/mol 之間，說(shuō)明核心靶蛋白均能與核心活性成分較好地結(jié)合。見(jiàn)表1。

表1 核心靶蛋白和核心活性成分的對(duì)接結(jié)果 (kcal/mol)

2.7 GO和KEGG分析GO和KEGG分析顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)顯著富集在RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)節(jié)等89 個(gè)BP 條目，分布在細(xì)胞外間隙、細(xì)胞核和胞漿等16 個(gè)CC 條目，參與蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性等27 種MF 條目，顯著富集在癌癥信號(hào)通路、乙肝（Hepatitis B）、腫瘤壞死因子（TNF）、蛋白聚糖癌癥通路、磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）、p53 等89 條KEGG 通路。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠從成分、靶點(diǎn)、通路等方面系統(tǒng)分析藥物治療疾病的作用機(jī)制，為研究中醫(yī)藥治療疾病提供新方法。

本文得到47 個(gè)雙蓮方治療HCC 的活性成分，其中包括7 個(gè)核心活性成分，分別為槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、漢黃芩素、黃芩素。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇和黃芩素均能降低肝癌細(xì)胞增殖能力、促進(jìn)其凋亡的發(fā)生和引起細(xì)胞周期阻滯[4-7]。木犀草素和漢黃芩素可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移和黏附能力，并且木犀草素可減少細(xì)胞增殖，漢黃芩素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8-10]。

通過(guò)PPI 分析得到71 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)和5 個(gè)核心靶點(diǎn)，包括AKT1、TP53、VEGFA、CASP3、JUN。研究發(fā)現(xiàn)AKT1及磷酸化AKT1 在大鼠肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，并與脫氧核糖核酸甲基轉(zhuǎn)移酶3B（DNMT3B）共同誘導(dǎo)肝癌的產(chǎn)生[11]。TP53，又名p53，在原發(fā)性肝癌組織中高表達(dá)且與低生存率、高TNM 分級(jí)、高病理分級(jí)呈正相關(guān)[12]。VEGFA 為血管生成因子，在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，其啟動(dòng)子單核酸多態(tài)性（SNPs）可能通過(guò)改變啟動(dòng)子活性導(dǎo)致HCC 的易感性[13]。Caspase3 在HCC 組織中表達(dá)降低并與低分化程度密切相關(guān)[14]。JUN 是編碼c-JUN 蛋白的致癌基因，過(guò)表達(dá)的c-JUN 可增加肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[15]。KEGG分析顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集在Hepatitis B、TNF、蛋白聚糖癌癥通路、PI3K-Akt、p53 等信號(hào)通路。

綜上所述，本文通過(guò)使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析出雙蓮方治療HCC 的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路，并使用分子對(duì)接方法驗(yàn)證了核心活性成分和核心靶點(diǎn)能夠相互作用，揭示了雙蓮方治療HCC 具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的機(jī)制特點(diǎn)，為實(shí)驗(yàn)或臨床研究提供基礎(chǔ)。