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    茵連化濁解毒湯對(duì)膽結(jié)石小鼠血生化指標(biāo)、膽汁代謝譜的影響及其機(jī)制分析

    2022-02-15 08:15:54張正偉吳佳玉
    光明中醫(yī) 2022年2期
    關(guān)鍵詞:膽汁酸膽結(jié)石膽汁

    張正偉 吳佳玉 李 斌

    膽結(jié)石是臨床常見(jiàn)的肝膽系統(tǒng)疾病,其中膽固醇結(jié)石是最常見(jiàn)的結(jié)石類型,目前尚缺乏有效的藥物治療手段,臨床上以外科手術(shù)切除膽囊為重要的治療方式。中醫(yī)理論認(rèn)為膽結(jié)石屬于“膽脹”“脅痛”“虛勞”范疇,濕濁和熱毒分別作為陰邪和陽(yáng)邪在膽結(jié)石的形成中起到重要作用,濁毒理論也是中醫(yī)理論中膽結(jié)石形成的重要理論[1,2]。鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院藥學(xué)部以濁毒理論為基礎(chǔ),將化濁解毒法作為治療大法,自擬茵連化濁解毒湯為基礎(chǔ)方用于膽結(jié)石的治療,為了明確該湯劑治療膽結(jié)石的效果,本研究通過(guò)高脂、高膽固醇、高熱量的導(dǎo)石飼料喂養(yǎng)的方式建立了膽結(jié)石小鼠模型,用茵連化濁解毒湯干預(yù)后分析了血生化指標(biāo)、膽汁代謝譜及肝臟內(nèi)膽汁酸代謝蛋白Abcb11、Abcc2的表達(dá),旨在為臨床實(shí)踐中應(yīng)用茵連化濁解毒湯治療膽結(jié)石提供參考和依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料選擇C57BL/6雄性小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,許可證號(hào):SCXK(豫)2020-0002,購(gòu)買于普萊柯生物工程有限公司。茵連化濁解毒湯(黃芩9 g,黃連6 g,蒲公英15 g,砂仁6 g,豆蔻9 g,茯苓15 g,白術(shù)10 g,半枝蓮9 g,白花蛇舌草15 g)由醫(yī)院藥劑科配制,濃縮得到含有0.72 g/ml生藥的藥液。超純RNA提取試劑盒(DNase I)、SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司。生化分析儀購(gòu)自Nova公司,熒光定量PCR儀購(gòu)自Bio-rad公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方法C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組。模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠按照下列方法建立膽結(jié)石模型:給予高脂、高熱量、高膽固醇(脂肪15%、膽固醇1%、膽酸0.5%)的飼料進(jìn)行喂養(yǎng)、連續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)組小鼠在高脂、高熱量、高膽固醇飼料喂養(yǎng)的過(guò)程中給予茵連化濁解毒湯10 ml/kg灌胃,每日1次;對(duì)照組及模型組小鼠給予生理鹽水10 ml/kg灌胃。

    1.2.2 血液指標(biāo)的測(cè)定造模8周,處死大鼠后采集血液標(biāo)本,在全自動(dòng)生化分析儀中測(cè)定總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量。

    1.2.3 膽汁代謝指標(biāo)的測(cè)定造模8周,處死大鼠后采集膽汁標(biāo)本,在全自動(dòng)生化分析儀中測(cè)定總膽汁酸(TBA)、丙氨酸(Gla)及TC、LDL-C的含量。

    1.2.4 肝臟中Abcb11、Abcc2表達(dá)的測(cè)定造模8周后,處死大鼠后采集肝臟組織,采用超純RNA提取試劑盒(DNase I)和SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分離肝臟中的RNA并合成為cDNA;取cDNA與UltraSYBR Mixture試劑混合為PCR反應(yīng)體系,通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增Abcb11、Abcc2,根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算mRNA表達(dá)水平。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件錄入數(shù)據(jù),3組間計(jì)量資料的分析采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 3組小鼠血生化指標(biāo)比較與對(duì)照組比較,模型組血液中TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、LDL-C的含量明顯升高,HDL的含量明顯減少(P<0.05);與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組血液中TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、LDL-C的含量明顯減少,HDL的含量明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2。

    表1 3組小鼠血液中肝功能相關(guān)生化指標(biāo)比較 (只,

    表2 3組小鼠血液中脂代謝相關(guān)生化指標(biāo)比較(只,

    2.2 3組小鼠膽汁代謝指標(biāo)比較與對(duì)照組比較,模型組膽汁中TBA、Gla、TC、LDL-C的含量明顯升高(P<0.05);與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組膽汁中TBA、Gla、TC、LDL-C的含量明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)表3。

    表3 3組小鼠膽汁代謝指標(biāo)比較 (只,

    2.3 3組小鼠肝臟中Abcb11、Abcc2表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較,模型組肝臟中Abcb11、Abcc2的mRNA表達(dá)水平明顯減少(P<0.05);與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組肝臟中Abcb11、Abcc2的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

    表4 3組小鼠肝臟中Abcb11、Abcc2表達(dá)水平比較 (只,

    3 討論

    中醫(yī)學(xué)中的濁毒理論是受到廣泛認(rèn)可的膽結(jié)石發(fā)病的中醫(yī)病機(jī),濕濁和熱毒分別屬于陰邪和陽(yáng)邪,能夠引起“膽脹”“脅痛”“虛勞”的發(fā)生,根據(jù)濁毒理論對(duì)膽結(jié)石進(jìn)行干預(yù)能夠起到確切效果[3]。本研究為了明確濁毒理論在膽結(jié)石治療中的價(jià)值,首先通過(guò)高脂肪、高膽固醇、高熱量飼料的飼養(yǎng)建立了膽結(jié)石動(dòng)物模型。膽固醇結(jié)石是最常見(jiàn)的膽結(jié)石類型,高脂肪、高膽固醇、高熱量飼料的飼養(yǎng)能夠引起體內(nèi)膽固醇代謝異常、引起膽固醇結(jié)晶形成,同時(shí)膽結(jié)石形成后造成肝內(nèi)膽汁淤積并出現(xiàn)肝功能損害[4,5]。在建立膽結(jié)石模型后分析血液中肝功能及脂代謝相關(guān)生化指標(biāo)的變化可知:模型組血液中TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、LDL-C的含量明顯升高,HDL的含量明顯減少,提示高脂肪、高膽固醇、高熱量飼料飼養(yǎng)所建立的膽結(jié)石小鼠模型存在脂代謝紊亂、肝功能異常。

    鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院藥學(xué)部以濁毒理論為基礎(chǔ),將化濁解毒法作為治療大法,自擬茵連化濁解毒湯用于膽結(jié)石的治療,該方劑中的黃芩、黃連、蒲公英、砂仁、豆蔻、茯苓、白術(shù)、半枝蓮、白花蛇舌草等中藥材能夠起到清熱解毒、通絡(luò)祛瘀的功效,能夠針對(duì)膽結(jié)石的中醫(yī)病機(jī)起到化濁解毒的作用[6]。近代藥理學(xué)研究證實(shí),茵連化濁解毒湯中的多種中藥材具有細(xì)胞保護(hù)作用,能夠起到穩(wěn)定細(xì)胞膜、抗炎抗氧化等作用[7,8]。本研究的實(shí)驗(yàn)組在高脂肪、高膽固醇、高熱量飼料的飼養(yǎng)過(guò)程中給予茵連化濁解毒湯進(jìn)行灌胃干預(yù),旨在發(fā)揮該湯劑的化濁解毒作用,通過(guò)分析干預(yù)后的血生化指標(biāo)可知:實(shí)驗(yàn)組血液中TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、LDL-C的含量明顯低于模型組,HDL的含量明顯高于模型組,提示茵連化濁解毒湯對(duì)膽結(jié)石模型小鼠的肝功能及脂代謝均具有改善作用。

    膽汁分泌及代謝的異常在膽固醇結(jié)石形成的過(guò)程中起到重要作用,膽汁中的主要成分為膽汁酸,同時(shí)還含有Gla、苯丙氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸等多種代謝產(chǎn)物[9]。膽汁分泌的異常及膽固醇結(jié)石的形成存在相互促進(jìn)、相互作用的關(guān)系,膽汁分泌的異常能夠誘導(dǎo)膽固醇結(jié)石的形成、膽固醇結(jié)石形成后對(duì)膽管的阻塞會(huì)加重膽汁分泌的異常[10]。本研究在造模后分析了膽結(jié)石模型小鼠膽汁中代謝指標(biāo)的變化并發(fā)現(xiàn):模型組膽汁中TBA、Gla、TC、LDL-C的含量明顯升高,提示膽結(jié)石模型小鼠的膽汁代謝發(fā)生了明顯的紊亂。在使用茵連化濁解毒湯灌胃干預(yù)后觀察到:實(shí)驗(yàn)組膽汁中TBA、Gla、TC、LDL-C的含量明顯低于模型組,提示茵連化濁解毒湯對(duì)膽結(jié)石模型小鼠的膽汁代謝具有改善作用。

    ATP結(jié)合盒超家族的成員Abcb11及Abcc2在膽汁酸的分泌、肝膽管細(xì)胞內(nèi)外膽汁酸的運(yùn)輸中起到重要調(diào)控作用。Abcb11作為肝細(xì)胞的膽汁酸輸出泵,參與?;撬帷ⅨZ去氧膽酸、熊去氧膽酸等膽汁酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn),能夠促進(jìn)肝膽管細(xì)胞內(nèi)外膽汁酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)[11];Abcc2主要參與有機(jī)陰離子從肝細(xì)胞向膽汁的分泌[12]。當(dāng)Abcb11及Abcc2表達(dá)發(fā)生異常時(shí),膽汁酸鹽及相應(yīng)陰離子的分泌發(fā)生障礙,進(jìn)而出現(xiàn)膽汁代謝的障礙及膽囊結(jié)石的形成。本研究對(duì)肝臟內(nèi)Abcb11及Abcc2表達(dá)的分析顯示:模型組肝臟內(nèi)Abcb11及Abcc2的表達(dá)水平明顯減少,而實(shí)驗(yàn)組肝臟內(nèi)Abcb11及Abcc2的表達(dá)水平明顯升高。由此表明茵連化濁解毒湯對(duì)膽結(jié)石模型小鼠肝臟內(nèi)Abcb11及Abcc2的表達(dá)具有促進(jìn)作用,這可能是茵連化濁解毒發(fā)揮膽結(jié)石治療作用的分子機(jī)制。

    綜上所述,茵連化濁解毒湯用于膽結(jié)石小鼠能夠通過(guò)增加Abcb11、Abcc2的表達(dá)來(lái)改善肝功能、調(diào)節(jié)膽汁代謝,該湯劑是治療膽結(jié)石的潛在藥物。

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