3種霍山產(chǎn)石斛莖HPLC指紋圖譜對比研究

楊秀容, 孟海濤, 李強明, 羅建平

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

安徽霍山主產(chǎn)霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)、細莖石斛(Dendrobiummoniliforme)3種石斛,均為蘭科石斛屬草本植物[1-2]。《本草綱目拾遺》中記載石斛“清胃除虛熱,生津已勞損”[3],石斛可用于陰傷津虧、口干煩渴、食少干嘔、病后虛熱、目暗不明,是一種名貴的中藥材,莖是石斛主要藥用部位[4-6]。石斛主要有多糖、生物堿、黃酮類、氨基酸、微量元素等多種活性成分[7-11],正是這些組分使其可以發(fā)揮保肝、降血糖、抗氧化、抗腫瘤等作用,但3種石斛的功效卻有明顯差異,其中霍山石斛最佳[12-17]。3種石斛的形態(tài)在新鮮莖上有差異,干燥后的楓斗制品形態(tài)相似,不易區(qū)分,因此市場上常出現(xiàn)使用鐵皮石斛、細莖石斛來冒充霍山石斛進行銷售的現(xiàn)象。為更好地區(qū)分3種霍山產(chǎn)石斛,本研究通過對全年12個月的3種霍山產(chǎn)石斛莖的甲醇提取物進行高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC)分析以建立指紋圖譜,通過對HPLC指紋圖譜進行對比研究以發(fā)現(xiàn)3種霍山產(chǎn)石斛莖的化學成分變化規(guī)律及差異,為區(qū)分和鑒別3種霍山產(chǎn)石斛提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(配有可變波長紫外檢測器、柱溫箱、四元泵),JK-300DVB型三頻數(shù)控超聲波清洗器(合肥金尼克機械制造有限公司),AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司),VAPML旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司),XT5118-OV140電熱鼓風干燥箱。

1.2 實驗材料

3種石斛采收于霍山縣太平畈鄉(xiāng)王家店村霍山石斛種植基地,由合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院羅建平教授鑒定,從1—12月份每月采收1次,霍山石斛樣品記為A1～A12,鐵皮石斛樣品記為B1～B12,細莖石斛樣品記為C1～C12。

色譜級乙腈、色譜級甲醇(美國 TEDIA 試劑公司),色譜級乙酸(上海凌峰化學試劑有限公司),超純水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 供試品溶液的制備

稱取不同月份3種石斛莖粉末(過80目篩)0.400 0 g,置于100 mL三角瓶中,加入 20 mL甲醇超聲溶解,上清液濃縮蒸干,加入甲醇溶解定容至 2 mL,搖勻過0.22 μm有機濾膜,備用。

1.3.2 色譜條件

色譜條件參考文獻[18],具體如下:色譜柱為Agilent C18(150×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈、0.1%乙酸,洗脫梯度(0～10 min、30%乙腈;10～20 min、35%乙腈; 20～40 min、55%乙腈;40～45 min、70%乙腈;45～90 min、100%乙腈);檢測波長為270 nm;流速為0.8 mL/min;柱溫為35 ℃;上樣量為20 μL。

2 結果與分析

2.1 3種石斛指紋圖譜的建立

將石斛樣品A1～A12、B1～B12、C1～C12按供試品溶液的制備方法制備,將制成的供試品進行色譜檢測分析,提取樣品在270 nm處的色譜圖?？梢缘玫交羯绞?、鐵皮石斛、細莖石斛3種石斛12個月的石斛莖指紋圖譜,如圖1所示。

圖1 3種石斛莖的12個月指紋圖譜比較

根據(jù)各樣品指紋圖譜中各色譜峰的保留時間,選取峰形較好且分離度較高的17個峰作為研究色譜的指紋峰。這17個峰在3種石斛相應位置均有出現(xiàn),各色譜峰的平均保留時間見表1所列。

表1 17個共有峰保留時間

2.2 相似度分析

本文分別將3種石斛樣品所得到的莖的色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A(國家藥典委員會),結果發(fā)現(xiàn)7月份指紋圖譜峰形較好、分離度較高、且較為穩(wěn)定,因此選擇作為參照。分別以A7、B7、C7樣品色譜圖作為對照,計算相應對照圖譜與樣品圖譜的相似度數(shù)據(jù),霍山石斛12個月的莖指紋圖譜相似度在0.979～0.999之間,鐵皮石斛12個月的莖指紋圖譜相似度在0.986～0.999之間,細莖石斛12個月的莖指紋圖譜相似度在0.457～0.992之間。結果表明,不同采收期的霍山石斛和鐵皮石斛莖化學成分均具有比較好的穩(wěn)定性,而不同采收期的細莖石斛莖所含的化學成分和質(zhì)量有一定的區(qū)別。

2.3 3種石斛莖指紋圖譜分析

3種石斛指紋圖譜標定了17個共有峰,為了比對3種石斛指紋圖譜在各個月份間的差異性,用色譜峰面積來表示峰強度,將3種石斛的17個色譜峰在各個月份間的色譜峰強度差異進行比較,如圖2所示。

圖2 3種石斛莖的12個月17個共有峰的強弱分析

從圖2可看出,1～3月份細莖石斛的1號峰含量很低,鐵皮石斛的16號峰含量很低。在4月份,霍山石斛的6、16號峰含量相對較高,而鐵皮石斛和細莖石斛的6、16號峰含量很低。在5月份,鐵皮石斛的6、16號峰含量依然很低,霍山石斛6號峰含量大于細莖石斛。在6月份,霍山石斛的2、6號峰含量相對較高,細莖石斛的16號峰含量較高。在8月份,霍山石斛2號峰含量很高,鐵皮石斛的8號峰含量很低,同時在16.55 min處細莖石斛出現(xiàn)了明顯的特征峰。在8月份,霍山石斛的2、6、16號峰的含量均高于另外2種石斛,同時鐵皮石斛的2、6號峰含量比細莖石斛高。在9月份,細莖石斛的1、2、6號峰峰值均高于鐵皮石斛,而霍山石斛的1號峰含量較低，而2、6號峰含量則相對較高。在10月份,細莖石斛1號峰含量很高,鐵皮石斛次之,霍山石斛的1號峰含量最低;霍山石斛的6號峰含量較高,鐵皮石斛次之,而細莖石斛6號峰的含量最低。在11月份,細莖石斛在8.12 min處存在特異性色譜峰,霍山石斛的6號峰含量比鐵皮石斛和細莖石斛高,鐵皮石斛16號峰含量比霍山石斛和細莖石斛高。在12月份,在1號峰的含量上,鐵皮石斛最高,細莖石斛次之,霍山石斛最低;在6號峰的含量上,霍山石斛最高,細莖石斛次之,鐵皮石斛最低;在16號峰的含量上,霍山石斛最高,細莖石斛次之,鐵皮石斛最低。根據(jù)3種石斛莖12個月指紋圖譜中17個共有峰的峰強度比較發(fā)現(xiàn)，3種石斛的1、2、6、8、16號共有峰峰強度差異顯著,細莖石斛在8.12、16.55 min 處存在特征色譜峰。

3 結 論

本實驗對3種石斛莖HPLC指紋圖譜進行對比研究,標定了17個共有峰,相似度分析表明，不同月份的霍山石斛和鐵皮石斛莖化學成分具有比較好的穩(wěn)定性,而不同月份的細莖石斛莖所含的化學成分和質(zhì)量有一定的區(qū)別。3種石斛莖指紋圖譜存在顯著差異,主要表現(xiàn)在共有峰峰強度和特征色譜峰上,將1、2、6、8、16號共有峰與8.12、16.55 min 處色譜峰組合可對3種石斛進行有效的鑒別,為3種石斛的區(qū)別和鑒定提供了新的方法和途徑。