水稻OsMYB57基因表達(dá)的調(diào)控與其化感抑草作用*

楊陸可,王 浩,高鈺杰,嚴(yán) 雪,母 丹,林文雄**,方長(zhǎng)旬,2**

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所/福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州 350002;2.作物生態(tài)與分子生理學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福建農(nóng)林大學(xué)) 福州 350002)

植物化感作用是一種普遍的生態(tài)學(xué)現(xiàn)象,廣泛存在于農(nóng)田、森林、海洋等生態(tài)系統(tǒng)中,農(nóng)作物、林木、藻類(lèi)等不同類(lèi)型的植物均具有化感品種。在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng),化感水稻(L.)的根系分泌大量的酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、二萜類(lèi)等化感物質(zhì)抑制周?chē)s草的生長(zhǎng)。研究表明,化感水稻田間抑草率可達(dá)30%～40%,且對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的影響小。利用化感水稻控制雜草也是可持續(xù)生態(tài)農(nóng)業(yè)的一種發(fā)展趨勢(shì)。

酚酸類(lèi)化合物是一類(lèi)重要的水稻化感物質(zhì)?；兴尽甈I312777’的酚酸含量極顯著高于非化感水稻‘Lemont’,其中6 葉期‘PI312777’的酚酸含量達(dá)710 μg?株。這些化感物質(zhì)還能與土壤中特定的微生物相互作用,增強(qiáng)抑草能力。研究發(fā)現(xiàn),化感水稻分泌的阿魏酸與黏細(xì)菌相互作用對(duì)稗草[(L.) Beauv.]抑制率達(dá)64.82%,顯著高于單獨(dú)阿魏酸(34.64%)及單獨(dú)黏細(xì)菌(8.26%)的化感作用。酚酸類(lèi)化合物由苯丙烷代謝途徑合成,苯丙氨酸解氨酶(PAL)是該途徑的關(guān)鍵酶?；兴镜幕虮磉_(dá)水平顯著高于非化感水稻,這與兩種水稻中基因啟動(dòng)子的活性密切相關(guān)。李蘭蘭等比較了‘PI312777’和‘Lemont’中相同基因成員的啟動(dòng)子活性差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)‘PI312777’中第2 染色體的第3 個(gè)成員基因()啟動(dòng)子的活性高于 ‘Lemont’,并推測(cè)這是導(dǎo)致‘PI312777’中酚酸類(lèi)化合物含量高于非化感水稻‘Lemont’的原因之一; 過(guò)量表達(dá)后水稻的酚酸類(lèi)化合物總量增加,抑草能力提高。此外,茉莉酸甲酯(MeJA)和水楊酸甲酯(MeSA)等小分子物質(zhì)誘導(dǎo)可增強(qiáng)基因的表達(dá),促進(jìn)酚酸類(lèi)化合物的積累。

植物體內(nèi)酚酸等次生物質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用有關(guān)。MYB 是一類(lèi)能夠調(diào)控次生代謝的轉(zhuǎn)錄因子。植物中的MYB 轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)MYB 域內(nèi)相鄰重復(fù)序列的數(shù)量分為4 種類(lèi)型,分別為1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB 和4R-MYB,它們分別含有1 個(gè)、2 個(gè)、3 個(gè)和4 個(gè)MYB 重復(fù)序列。在這4種類(lèi)型中,R2R3-MYB 因子是MYB 家族的主要成員,參與調(diào)控次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明,組成型表達(dá)能促進(jìn)玉米(L.)中阿魏酸和綠原酸的積累; 在煙草(L.)、馬鈴薯(L.)、番茄(L.)和雪蓮[(Kar.et Kir).Sch.-Bip.] 4 種植物中分別組成型表達(dá)的馬鈴薯、、基因和擬南芥(L.)中的基因也促使綠原酸含量的增加。葡萄(L.)的也參與了苯丙烷代謝途徑。在擬南芥中,MYB11、MYB12、MYB111 等R2R3-MYB 類(lèi) 型 的MYB 轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控查耳酮異構(gòu)酶、黃烷酮3-羥化酶和黃酮醇合成酶1 的基因表達(dá),這些基因參與了類(lèi)黃酮的生物合成,從而調(diào)控植物黃酮類(lèi)化合物積累。利用轉(zhuǎn)錄激活因子VP64 增強(qiáng)水稻中的表達(dá)后,水稻苯丙烷途徑中、、和基因也上調(diào)表達(dá),L-苯丙氨酸含量增加,水稻對(duì)稗草的抑制率提高。對(duì)MYB57 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因進(jìn)行研究,結(jié)果顯示MYB57轉(zhuǎn)錄調(diào)控的表達(dá),MAPK11 可與PAL2;3相互作用從而調(diào)控水稻酚酸類(lèi)化感物質(zhì)的合成。在此基礎(chǔ)上,揭示調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子能夠進(jìn)一步明確水稻化感作用特性形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。據(jù)此,本文利用DNA-pull Down 分離了調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,并研究其外源調(diào)控方式,認(rèn)識(shí)MYB57 調(diào)控水稻化感作用的作用網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻材料為國(guó)際公認(rèn)的化感水稻品種 ‘PI312777’和非化感水稻品種‘Lemont’,供試受體材料為稗草。

1.2 供試水稻材料的種植

取‘PI312777’和‘Lemont’水稻種子,用25% NaClO表面消毒30 min 后清洗干凈,加入滅菌水于30 ℃培養(yǎng)箱中浸泡16 h。倒掉無(wú)菌水,在恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃催芽,期間保持種子濕潤(rùn)。待水稻長(zhǎng)至高度約5 cm時(shí)將其移栽至KT 板(4×8 孔)上,每板種植16 棵,后放置于培養(yǎng)盆(70 cm×40 cm×30 cm) 中進(jìn)行水培,光照強(qiáng)度360 μmol?m?s,相對(duì)濕度80%～85%,盆的外表均勻涂黑以防止產(chǎn)生綠藻,每周更換新鮮配制的完全營(yíng)養(yǎng)液。水稻長(zhǎng)至3 葉一心時(shí),將提前萌發(fā)好長(zhǎng)勢(shì)一致的稗草(長(zhǎng)出2～3 葉,株高4～5 cm 左右)種植在剩余的16 孔中,稗草與水稻在盆中對(duì)稱(chēng)種植,對(duì)照組種植32 株水稻,繼續(xù)在溫室中培養(yǎng)。處理和對(duì)照各4 個(gè)重復(fù)。

在與稗草共培處理1 d、3 d、5 d、7 d 后,分別取樣水稻的倒二片完全展開(kāi)的功能葉和根系,液氮速凍,用于基因組DNA、總RNA 以及葉片可溶性總蛋白的提取。

1.3 茉莉酸甲酯處理化感水稻‘PI312777’和非化感水稻‘Lemont’

將萌發(fā)的‘PI312777’和‘Lemont’種子種植于96孔板,每板種植30 棵,并置于1 L 黑色塑料盆中培養(yǎng),每周更換營(yíng)養(yǎng)液。待長(zhǎng)至3 葉一心時(shí),分別添加終濃度為0.01 mmol?L、0.02 mmol?L、0.05 mmol?L、0.1 mmol?L和0.2 mmol?L茉莉酸甲酯(MeJA)于水稻完全營(yíng)養(yǎng)液中作為處理組,以不添加MeJA 為對(duì)照組,處理組與對(duì)照組均設(shè)4 個(gè)重復(fù)。在處理1 d、3 d、5 d 和7 d 時(shí),分別取處理組和對(duì)照組水稻根系和倒二片完全展開(kāi)的功能葉,液氮速凍,用于提取總RNA 和蛋白。

1.4 OsMYB57 基因啟動(dòng)子克隆及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子分離

采用植物基因組DNA 提取試劑盒(CW0553S,北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取水稻‘PI312777’和‘Lemont’的基因組DNA。采用5′端帶生物素(biotin)標(biāo)記的引物-promoter-F:5′-GCAGTA ACAAGCTAACAGCAGCTGG-3′與-promoter-R:5′-CTTCTTTTGCTTCCTCCCTCCTGAG-3′分別從兩種水稻的基因組DNA 中擴(kuò)增基因啟動(dòng)子用于 DNA-pull down 獲得啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白。DNA-pull down 根據(jù)Fang 等方法,提取‘PI312777’和‘Lemont’葉片的可溶性蛋白,使用Dynabeads kilobaseBINDER? Kit (Invitrogen,Thermo Fisher Scientific)試劑盒收集DNA 片段中結(jié)合的蛋白質(zhì)并進(jìn)行SDS-PAGE,切取目標(biāo)蛋白條帶酶解,蛋白質(zhì)鑒定在質(zhì)譜儀器 Q-Exactive HF (Thermo Scientific)上進(jìn)行。

1.5 qPCR 檢測(cè)OsMYB57 基因啟動(dòng)子結(jié)合蛋白的基因表達(dá)量

采用TRIzol 法分別提取稗草共培以及茉莉酸甲酯處理1 d、3 d、5 d 和7 d 的‘PI312777’與‘Lemont’水稻葉片、根系的總 RNA 并純化,總RNA 經(jīng)Easy-Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以MYB57 啟動(dòng)子結(jié)合蛋白的編碼基因序列為模板設(shè)計(jì)qPCR 引物,并以肌動(dòng)蛋白(actin)基因?yàn)閮?nèi)參基因(表1)。按照TransStart Tip Green qPCR SuperMIX 試劑盒說(shuō)明書(shū)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)配置qPCR 反應(yīng)體系,qPCR 在realplex熒光定量PCR 儀(Eppendorf,Germany)中完成,根據(jù)生成的閾值(CT 值),運(yùn)用2法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 本研究中采用的qPCR 引物Table 1 qPCR primers used in this study

1.6 不同濃度茉莉酸甲酯處理下水稻的蛋白表達(dá)量檢測(cè)

采用TCA 丙酮法提取蛋白,并在10%/的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。采用濕轉(zhuǎn)(80 V,2 h)的方法將蛋白條帶固定于PVDF 膜上,5%脫脂牛奶封閉過(guò)夜后,分4 組與MYB57、MAPK11、PAL2;3 和Actin 的特異抗體分別孵育1.5 h。MYB57、MAPK11和PAL2;3 的二抗采用Goat Anti-Rabbit IgG (H+L),actin 的二抗使用Goat Anti-Mouse IgG (H+L),孵育1.5 h 后進(jìn)行ECL (electrochemiluminescence)顯色,并于ChemiDoc MP (Biorad)中進(jìn)行成像。

1.7 不同濃度茉莉酸甲酯處理下水稻分泌液的抑草率評(píng)價(jià)

將稗草種子萌發(fā),培養(yǎng)方式同1.3。分別將不同濃度茉莉酸甲酯處理的兩種水稻的根系液進(jìn)行過(guò)濾除雜后各收集1.5 L 濾液,然后將長(zhǎng)至兩葉一心的稗草分別種植于上述收集的水稻根系液中,每種處理種植25 棵稗草并添加500 mL 濾液,種植第14 d 后對(duì)各處理稗草根和葉的長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定。將根莖分開(kāi)殺青,烘干至恒重后測(cè)量其干重,并計(jì)算抑制率(%)。抑制率計(jì)算公式為 IR=(1?TR/CK)×100%。其中IR為抑制率(inhibitory ratio),TR 為處理組生長(zhǎng)指標(biāo)(treatment),CK 為對(duì)照組生長(zhǎng)指標(biāo)(control)。數(shù)據(jù)采用DPS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsMYB57 基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

通過(guò)DNA-pull down 獲得‘PI312777’和‘Lemont’的基因啟動(dòng)子所結(jié)合的蛋白,SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示,‘PI312777’和‘Lemont’的基因啟動(dòng)子DNA 上均含有結(jié)合蛋白,對(duì)照組未經(jīng)生物素標(biāo)記的基因啟動(dòng)子DNA 上未檢測(cè)到結(jié)合蛋白(圖1)。

圖1 ‘PI312777’和‘Lemont’水稻中OsMYB57 基因啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白Fig.1 Proteins binding on the promoter of OsMYB57 from rice varieties ‘PI312777’ and ‘Lemont’

對(duì)啟動(dòng)子上結(jié)合的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和分析,結(jié)果從‘PI312777’水稻的基因啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白中鑒定到具有結(jié)合DNA 功能的蛋白,包括轉(zhuǎn)錄因子basic helix-loop-helix protein 009 (基因:)、LOC_Os04g32590.1 (基因:)、LOC_Os0 2g31160.1 (基因:)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LOC_Os03g25430.1 (基因:)和LOC_Os03g 50110.1 (基因:); 在‘Lemont’水稻的基因啟動(dòng)子鑒定到具有結(jié)合DNA 功能的蛋白,包括轉(zhuǎn)錄因子LOC_Os04g32590.1、LOC_Os0 2g31160.1 和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LOC_Os03g25430.1 (表2)。

表2 ‘PI312777’和‘Lemont’水稻中OsMYB57 基因啟動(dòng)子上的結(jié)合蛋白鑒定結(jié)果Table 2 Identification of the proteins binding on the OsMYB57 gene promoter from rice varieties ‘PI312777’ and ‘Lemont’

2.2 OsMYB57 基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)量

基因表達(dá)由生物體內(nèi)反式作用因子(轉(zhuǎn)錄因子)作用于順式作用原件(啟動(dòng)子區(qū)域)所決定。對(duì)稗草共培下的‘PI312777’和‘Lemont’中的基因啟動(dòng)子上結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),qPCR 結(jié)果顯示,稗草共培下的‘PI312777’水稻根系和葉片中的、、和基因表達(dá)都較其單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照組上調(diào),具體表現(xiàn)為先上升后下降,且在根中的上調(diào)表達(dá)量明顯高于葉。在根中,和在5 d 時(shí)上調(diào)表達(dá)量最高,分別上調(diào)100.19 倍、146.44 倍和23.98 倍; 其在相同處理下的‘Lemont’根系中分別上調(diào)4.95 倍、10.22 倍和9.36 倍。稗草脅迫下的‘Lemont’葉片中這3 個(gè)基因的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)較大,其在共培5 d 處理組中,表達(dá)量分別上調(diào)35.11 倍、50.53 倍和40.97 倍(圖2)。

圖2 稗草脅迫下‘PI312777’和‘Lemont’水稻中OsMYB57 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的動(dòng)態(tài)表達(dá)Fig.2 Dynamic gene expression levels of transcriptional regulators of OsMYB57 in rice varieties ‘PI312777’ and ‘Lemont’ co-cultured with barnyardgrass

2.3 茉莉酸甲酯處理下水稻根系中基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)

bHLH009 是茉莉酸(JA)信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)蛋白,在JA 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要作用。采用qPCR分別檢測(cè)了茉莉酸甲脂(MeJA)處理1 d、3 d、5 d 和7 d ‘PI312777’和‘Lemont’根系中的較其各自對(duì)照組的表達(dá)變化。在‘PI312777’根系中,不同濃度茉莉酸甲酯處理促進(jìn)了這5 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá),其中0.05 mmol?L、0.10 mmol?L和0.20 mmol?L的MeJA 對(duì)基因表達(dá)的促進(jìn)效果較為明顯,0.05 mmol?LMeJA 誘導(dǎo)7 d 的‘PI312777’中和基因的表達(dá)量為相同天數(shù)對(duì)照組的2.67 倍、5.66 倍、4.90 倍、3.18倍和3.21倍; 0.10 mmol?LMeJA 誘導(dǎo)7 d處理組分別為對(duì)照組的97.39 倍、378.72 倍、159.97 倍、243.59 倍和146.94倍; 0.20 mmol?LMeJA誘導(dǎo)組分別為對(duì)照組的28.36 倍、244.72 倍、54.95 倍、30.91 倍 和35.82 倍(圖3a-e)。

在‘Lemont’中,MeJA 對(duì)上述5 個(gè)基因的誘導(dǎo)作用不及相同處理下的‘PI312777’中上調(diào)表達(dá)程度,0.01 mmol?LMeJA 處理1 d 的‘Lemont’根系中基因上調(diào)表倍數(shù)最大,分別為對(duì)照組的39.01 倍、28.99 倍和36.69 倍; 0.20 mmol?LMeJA 處理3 d 的‘Lemont’根系中的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最大,為對(duì)照組的16.33 倍和53.26 倍(圖3f-j)。

圖3 不同濃度茉莉酸甲酯處理不同時(shí)間‘PI312777’和‘Lemont’水稻根系中基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)Fig.3 Dynamics of gene expression level in the root of ‘PI312777’ and ‘Lemont’ under treatments of different concentrations of methyl jasmonate

2.4 茉莉酸甲酯處理下水稻葉片中基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)

qPCR 同時(shí)檢測(cè)了MeJA 誘導(dǎo)下的‘PI312777’和 ‘Lemont’葉片中和基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)。結(jié)果顯示,葉片中的這些基因上調(diào)表達(dá)程度較其根系中低?！甈I312777’葉片中,MeJA 誘導(dǎo)7 d的基因上調(diào)表達(dá)程度相對(duì)較大,其中以0.02 mmol?LMeJA 處理的效果最明顯,5 個(gè)基因分別較對(duì)照組上調(diào)4.71 倍、3.33 倍、7.25 倍、3.67 倍和4.25 倍(圖4a-e)。

在‘Lemont’葉 片 中,在0.10 mmol?LMeJA 誘導(dǎo)5 d 的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最大,為對(duì)照組的4.94 倍;和基 因分 別在0.05 mmol?L和0.20 mmol?LMeJA 處理7 d 時(shí)的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最大,為對(duì)照組的14.70 倍和4.09 倍; 而0.05 mmol?LMeJA 處理3 d 對(duì)和基因表達(dá)的誘導(dǎo)效果最明顯,分別為對(duì)照組的18.06 倍和20.22 倍(圖4f-j)?？梢?jiàn),MeJA 處理后,‘Lemont’水稻葉片中的這5 個(gè)基因的響應(yīng)作用存在較大差異。

圖4 不同濃度茉莉酸甲酯處理不同時(shí)間‘PI312777’和‘Lemont’水稻葉片中基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)Fig.4 Dynamics of gene expression level in the leaves of ‘PI312777’ and ‘Lemont’ under treatments of different concentrations of methyl jasmonate

2.5 茉莉酸甲酯處理下MYB57、PAL2;3 及MAPK11的蛋白表達(dá)

進(jìn)一步檢測(cè)了MeJA 誘導(dǎo)處理下,bHLH009 等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游基因,以及MYB57 蛋白調(diào)控的和基因編碼的蛋白表達(dá)量。0.10 mmol?L和0.20 mmol?LMeJA 處理下,‘Lemont’中MYB57 和MAPK11 蛋白表達(dá)量均明顯提高; PAL2;3 在處理組的表達(dá)量也高于其在對(duì)照組中的表達(dá),但不明顯。在PI312777 中,0.05 mmol?LMeJA 處理下MYB57 和MAPK11 及0.10 mmol?LMeJA 處理下的PAL2;3 蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯提高。且‘PI312777’中的PAL2;3 和MYB57 的表達(dá)量均高于相同處理?xiàng)l件下的‘Lemont’。結(jié)果表明,MeJA 處理能夠誘導(dǎo)提高‘PI312777’和‘Lemont’中MYB57、PAL2;3 和MAPK11 蛋白的表達(dá)量,相同濃度的MeJA 對(duì)‘PI312777’的誘導(dǎo)作用大于對(duì)‘Lemont’的誘導(dǎo)作用(圖5)。

圖5 不同濃度茉莉酸處理不同時(shí)間‘PI312777’和‘Lemont’水稻中MYB57、PAL2;3 和MAPK11 蛋白的表達(dá)量Fig.5 Protein expression of MYB57,PAL2;3 and MAPK11 in ‘PI312777’ and ‘Lemont’ under treatments of different concentrations of methyl jasmonate for different days

2.6 不同濃度茉莉酸甲酯處理對(duì)兩水稻品種生長(zhǎng)的影響

比較MeJA 處理下‘PI312777’和‘Lemont’的生長(zhǎng)情況,結(jié)果顯示,隨著處理天數(shù)的增加,0.01 mmol?L、0.02 mmol?L和0.05 mmol?L濃度的MeJA 處理能促進(jìn)水稻的生長(zhǎng)。但0.1 mmol?L和0.2 mmol?L濃度處理3 d 開(kāi)始對(duì)兩品種水稻的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,即表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)而高濃度抑制的生理現(xiàn)象,外源添加MeJA 的濃度不高于0.05 mmol?L時(shí),對(duì)兩品種水稻的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用(圖6)。

圖6 不同濃度茉莉酸甲酯(MeJA)處理不同時(shí)間 ‘PI312777’和‘Lemont’水稻的生長(zhǎng)狀況Fig.6 Plant phenotype of ‘PI312777’ and ‘Lemont’ under treatmetns of different concentrations of methyl jasmonate (MeJA) for different days

2.7 茉莉酸甲酯處理下水稻根系分泌液的抑草率

進(jìn)一步測(cè)定了MeJA 對(duì)稗草生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示,與 未添加MeJA 的對(duì)照組相比,0.05 mmol?LMeJA 對(duì)稗草的根長(zhǎng)和株高均不產(chǎn)生影響; 0.10 mmol?LMeJA 對(duì)稗草的根長(zhǎng)不產(chǎn)生影響,但顯著抑制了稗草的株高; 0.20 mmol?LMeJA 對(duì)稗草的根長(zhǎng)和株高均具有顯著的抑制作用(圖7)。

圖7 不同濃度茉莉酸甲酯(MeJA)對(duì)稗草生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of different concentrations of methyl jasmonate (MeJA) on barnyardgrass growth

隨著MeJA 添加濃度的增大,‘PI312777’和‘Lemont’根系分泌液對(duì)稗草株高的抑制作用不斷增強(qiáng),并且都在0.20 mmol?LMeJA 處理下抑制稗草株高最明顯; 隨添加MeJA 濃度的提高,增強(qiáng)了‘PI312777’根系分泌液對(duì)稗草根長(zhǎng)的抑制效果,但對(duì)‘Lemont’根系分泌液抑制稗草根長(zhǎng)則作用不明顯(圖8)。

圖8 不同濃度茉莉酸甲酯處理下‘PI312777’ (PI)和‘Lemont’ (Le)水稻根系分泌液對(duì)稗草生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effect of root exudates of ‘PI312777’ (PI) and ‘Lemont’ (Le) rice induced by different concentrations of methyl jasmonate(MeJA) on barnyardgrass growth

圖9 結(jié)果可以看出,在化感水稻‘PI312777’中,0.05 mmol?L、0.10 mmol?L和0.20 mmol?LMeJA處理的根系分泌液對(duì)稗草地上部分干重的抑制率為25.82%、30.52%和32.59%,表現(xiàn)出隨添加 MeJA 濃度的提高抑制率增強(qiáng)的趨勢(shì); 對(duì)稗草地下部分干重的抑制率分別為17.01%、30.65 %、30.02%。在非化感水稻‘Lemont’中,上述3 種MeJA 濃度處理的根系分泌液對(duì)稗草地上部分干重的抑制率為5.30%、27.85%、35.50%,對(duì)稗草地下部分干重的抑制率分別為15.36%、15.13%、?6.44% (圖9)。上述結(jié)果表明,MeJA 能夠誘導(dǎo)增強(qiáng)水稻的化感作用,提高兩種水稻對(duì)稗草的抑制率。

圖9 不同濃度茉莉酸甲酯添加下的‘PI312777’和‘Lemont’水稻根系分泌液對(duì)稗草干重的抑制率Fig.9 Inhibitory rates of root exudates of ‘PI312777’ and ‘Lemont’ rice induced by different concentrations of methyl jasmonate(MeJA) to the dry weight of barnyardgrass

3 討論與結(jié)論

植物化感物質(zhì)合成與分泌作用是決定化感潛力的關(guān)鍵因素。化感水稻能夠通過(guò)苯丙氨酸代謝途徑合成酚酸類(lèi)化合物對(duì)鄰近稗草產(chǎn)生化感抑制作用。苯丙氨酸解氨酶是苯丙氨酸代謝途徑的限速酶,其活性高低決定了水稻對(duì)酚酸類(lèi)化感物質(zhì)的生物合成能力。植物體內(nèi)次生代謝物的合成受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。前期研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)一個(gè)R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)能夠使苯丙氨酸途徑中上調(diào)表達(dá);染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示MYB57 能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達(dá),MAPK11 再與PAL2;3蛋白發(fā)生相互作用,間接調(diào)控水稻的苯丙烷代謝,表明了有效調(diào)控水稻的化感抑草能力。

化感作用關(guān)聯(lián)基因表達(dá)的強(qiáng)度與其啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控密切相關(guān)。對(duì)‘PI312777’和‘Lemont’的基因啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行研究,在 ‘PI312777’的基因啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白中鑒定到LOC_Os04g32590.1、LOC_Os02g31160.1、LOC_Os03g25430.1、bHLH009 等具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的蛋

白,在‘Lemont’的基因啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白中鑒定到LOC_Os04g32590.1、LOC_Os02g31160.1、LOC_Os03g25430.1 等具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的蛋白。其中,bHLH009 屬bHLH-TFs 轉(zhuǎn)錄因子家族,是茉莉酸(JA)信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)蛋白,參與多種生物以及非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程。大量研究表明,JA 能通過(guò)與其他激素或轉(zhuǎn)錄因子間的互作完成很多發(fā)育過(guò)程的調(diào)控。MYC 參與調(diào)控大量JA 響應(yīng)基因,能夠與JAZ 蛋白結(jié)合,是JAZ 抑制劑的靶點(diǎn)。MYC2 是第一個(gè)被報(bào)道的家族成員,它與MYC3、MYC4 和MYC5 共同作用,響應(yīng)JA 并介導(dǎo)調(diào)控植物生理過(guò)程,如根系生長(zhǎng)抑制、肥力以及對(duì)病原體和昆蟲(chóng)的抗性,MYCs 因而被認(rèn)為是連結(jié)環(huán)境和植物反應(yīng)的重要樞紐。稗草脅迫下,‘PI312777’和‘Lemont’水稻中的基因表達(dá)均上調(diào),表明稗草作為環(huán)境脅迫因子能夠觸發(fā)水稻的JA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑; 與‘Lemont’相比,‘PI312777’根系中基因的上調(diào)表達(dá)增加倍數(shù)更為顯著,可見(jiàn)‘PI312777’對(duì)稗草脅迫的響應(yīng)作用更加靈敏,有利于‘PI312777’化感抑草作用的形成。此外,‘PI312777’與‘Lemont’相比,其基因的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)更高,使得bHLH009 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因在‘PI312777’中的表達(dá)豐度也高于其在‘Lemont’中的表達(dá),這也從一方面解釋了化感水稻 ‘PI312777’中基因表達(dá)水平較高的原因。

外源添加MeJA 處理下,‘PI312777’和‘Lemont’中的基因上調(diào)表達(dá),其在根系中的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)高于葉片中的上調(diào)倍數(shù),且隨著MeJA 添加濃度的提高,基因上調(diào)表達(dá)倍數(shù)增加,并以0.10 mmol?L濃度處理的誘導(dǎo)效果最為顯著,bHLH009 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游基因以及與MYB57 相互作用的MAPK11 的基因和蛋白表達(dá)水平也隨著上調(diào)。外源MeJA 處理下及MAPK11 的表達(dá)變化表明了化感水稻中基因?qū)A 信號(hào)的有效響應(yīng)以及JA 信號(hào)分子誘發(fā)的調(diào)控作用。MeJA 誘導(dǎo)也促進(jìn)了水稻根系分泌化感物質(zhì),其中0.20 mmol?L的MeJA 誘導(dǎo)使得‘PI312777’的化感抑草能力提高效果最為顯著,但該濃度對(duì)水稻的生長(zhǎng)也產(chǎn)生一定的抑制作用; 0.05 mmol?LMeJA 對(duì)水稻生長(zhǎng)還有一定的促進(jìn)作用。Bi 等研究了外源分別施用MeJA 和水楊酸甲酯(MeSA)對(duì)水稻化感作用的影響,結(jié)果也顯示MeJA 和MeSA 處理均提高了水稻PAL 酶和肉桂酸4-羥化酶(C4H)的基因表達(dá)豐度和酶活,促進(jìn)了水稻酚類(lèi)物質(zhì)的積累,且水稻葉片提取液對(duì)稗草的抑制作用也增強(qiáng)。Fang等采用RNA 干擾和基因過(guò)量表達(dá)技術(shù)分別抑制和增強(qiáng)了‘PI312777’的JA 合成關(guān)鍵基因(allene oxide cyclase)表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)基因使得水稻的內(nèi)源JA 含量增加,、、等苯丙烷代謝相關(guān)基因上調(diào)表達(dá),水稻中原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸等酚酸類(lèi)化合物含量增加,水稻化感抑制稗草作用提高; 抑制表達(dá)則結(jié)果相反。這些結(jié)果也證實(shí)了JA 及其合成對(duì)水稻化感抑草能力的調(diào)控作用。本研究在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步揭示了化感水稻響應(yīng)JA 的受體蛋白bHLH009 及其下游調(diào)控基因,從而促進(jìn)酚酸類(lèi)化感物質(zhì)合成的分子機(jī)制。此外,已有的研究表明,MeJA 或JA 處理能夠提高水稻抗蟲(chóng)性和抗機(jī)械損傷等,但對(duì)水稻的產(chǎn)量則具有抑制作用; 因此,如何合理噴施MeJA 提高水稻抗性并盡量降低其對(duì)水稻產(chǎn)量的影響,是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中值得進(jìn)一步深入探索的問(wèn)題。

綜上所述,基因的表達(dá)受bHLH009 轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控; 稗草脅迫下,‘PI312777’中基因上調(diào)表達(dá)且高于‘Lemont’,體現(xiàn)了‘Lemont’和‘PI312777’對(duì)稗草脅迫信號(hào)響應(yīng)的靈敏性差異。bHLH009 是JA 信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)蛋白,外源添加MeJA 能夠提高基因的表達(dá),MYB57、MAPK11 和PAL2;3 蛋白的表達(dá)水平也提高,有利于促進(jìn)水稻根系分泌酚酸類(lèi)化感物質(zhì),提高水稻對(duì)稗草的化感抑制作用; 其中添加0.05 mmol?LMeJA 不會(huì)抑制水稻生長(zhǎng)，且有效提高水稻化感抑草能力。上述結(jié)果揭示了稗草脅迫下,化感水稻通過(guò)JA 途徑調(diào)控MYB57 表達(dá),促進(jìn)水稻合成酚酸類(lèi)化感物質(zhì)抑制稗草生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程與機(jī)制。