二肽基肽酶-4在瘢痕疙瘩中的表達情況研究

梁仲堯　岑瑛

[摘要]目的：探討二肽基肽酶-4（DPP4）在瘢痕疙瘩中的表達情況。方法：分別獲取切除術后的瘢痕疙瘩組織及正常皮膚組織，然后通過蛋白免疫印跡方法、定量聚合酶鏈反應，比較二者DPP4基因在蛋白和mRNA水平上表達的差異。結果：與正常皮膚組織相比，DPP4蛋白在瘢痕疙瘩組織中的表達高于正常皮膚，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），DPP4基因在mRNA水平上的表達高于正常皮膚（P<0.05）。結論：DPP4在瘢痕疙瘩中的表達上升，DPP4可能在促進成纖維細胞活化、纖維化形成方面有一定作用。

[關鍵詞]瘢痕疙瘩;纖維化;二肽基肽酶-4;實時聚合酶鏈反應;蛋白免疫印跡;基因表達;成纖維細胞

[中圖分類號]R619+.6? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）01-0087-03

Study on the Expression of Dipeptidyl Peptidase-4 in Keloids

LIANG Zhongyao1，CEN Ying2

（1.West China Clinical Medical College of Sichuan University，Sichuan University，Chengdu 610000，Sichuan，China;2.Department of Plastic and Aesthetic Surgery，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610000，Sichuan，China）

Abstract： Objective To explore the expression of dipeptidyl peptidase-4 in keloids. Methods The keloid tissue and normal skin tissue after resection were obtained， and then the differences in the expression of DPP4 gene between the two were compared by Western blotting and quantitative polymerase chain reaction. Results Compared with normal skin tissue， the expression of DPP4 protein in keloid tissue was higher than that in normal skin， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression of DPP4 gene at mRNA level was higher than that in normal skin （P<0.05）. Conclusion The expression of DPP4 in keloids is increased. DPP4 may play a role in promoting fibroblast activation and fibrosis formation.

Key words： keloid; fibrosis; Dipeptidyl Peptidase-4; real-time polymerase chain reaction; blotting western; gene expression; fibroblast

瘢痕疙瘩（keloid）是整形外科中一類常見的皮膚纖維化疾病，發(fā)病機制大多與膠原纖維過度修復增生有關，其主要特征表現為高出于皮膚表面、侵襲性生長和容易復發(fā)。有研究表明，在各種上皮細胞表面廣泛分布著一類T細胞表面抗原——二肽基肽酶-4（Dipeptidyl peptidase 4，DPP4）即CD26，是一種細胞膜表面的絲氨酸蛋白酶，其在成纖維細胞表面也有分布[1]。有研究表明DPP4陽性成纖維細胞是一類功能更加活躍的細胞亞群，其主要參與形成細胞外基質的過度纖維化[2]。因此，臨床醫(yī)生很難不將瘢痕疙瘩的形成與DPP4的表達聯(lián)系在一起。本文中，筆者使用了蛋白免疫印跡、定量聚合酶鏈反應兩種方法，以探討瘢痕疙瘩中DPP4在蛋白和mRNA水平上的表達情況，進一步說明瘢痕疙瘩的形成與DPP4表達的相關性，現報道如下。

1? 材料和方法

1.1 材料來源：10例瘢痕疙瘩組織和10例正常皮膚組織分別來源于四川大學華西醫(yī)院整形美容外科瘢痕疙瘩切除術后的多余組織和腹壁整形術、巨乳切除術后的多余皮膚組織。取得患者知情同意，然后分別獲取切除術后的瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織?；颊吆喜⒂旭：鄹泶瘛⒃錾择：奂膊?、其他皮膚疾病或癌癥不納入采納范圍。本研究符合倫理學要求。

1.2 蛋白免疫印跡法：將正常皮膚和瘢痕疙瘩組織剪碎后，加入RIPA裂解液，裂解完成后在4℃，12 000 g條件下離心5 min，測定蛋白質濃度后用5×上樣緩沖液稀釋5倍，然后按照電泳（先80 V條件下電泳30 min，然后調整電壓至120 V繼續(xù)電泳使maker條帶明顯分離）、轉膜（4 ℃條件下過夜）、封閉（用5%脫脂奶粉TBST溶室溫封閉1 h）、孵育（一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h）的順序進行蛋白免疫印跡實驗。實驗目的：確定DPP4蛋白在正常皮膚和瘢痕疙瘩中的表達情況。

1.3 定量聚合酶鏈式反應法（Quantitative polymerase chain reaction，QPCR）：在液氮中將正常皮膚和瘢痕疙瘩組織研磨成粉末，按照離心柱法進行組織總RNA提取，然后按照逆轉錄方法將RNA轉錄為cDNA，最后利用SYBR法進行熒光定量PCR，以確定DPP4基因在正常皮膚和瘢痕疙瘩組織mRNA上的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學分析：由Graphpad Prim 8.0.2軟件和SPSS 26.0完成。

2? 結果

2.1 蛋白免疫印跡實驗結果：如圖1～2所示，DPP4蛋白在瘢痕疙瘩中的表達量高于正常皮膚，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 QPCR結果：如圖3所示，與正常皮膚組織相比，在瘢痕疙瘩組織上DPP4基因的mRNA表達水平更高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3? 討論

瘢痕疙瘩的主要發(fā)生原因為外傷刺激，是一種組織修復過度，纖維化無法正常受控的疾病。皮膚發(fā)生外傷后，成纖維細胞在損傷皮膚修復方面發(fā)揮著舉足輕重的作用，且修復的早中晚期發(fā)揮的作用也各不相同。修復早期：成纖維細胞分泌各種細胞因子參與炎癥反應[3];分泌細胞外基質參與肉芽組織形成，為其他細胞進行生物學功能提供結構支撐。修復晚期：成纖維細胞參與細胞外基質的降解與組織結構重塑，在外源性因素作用下，成纖維細胞功能發(fā)生紊亂，主要表現出以下3點能力：①“活化”的瘢痕疙瘩成纖維細胞表現出更強的遷移力和收縮力，從而導致瘢痕疙瘩向皮損區(qū)外侵襲;②瘢痕疙瘩成纖維細胞表現出更多的分泌膠原和細胞因子的能力，從而合成過多的細胞外基質;③向肌成纖維細胞的表型轉化以及平滑肌肌動蛋白的表達上升會導致組織收縮。修復后期：瘢痕疙瘩成纖維細胞降解細胞外基質與組織結構重塑的功能發(fā)生紊亂，從而導致細胞外基質的堆積[4]。由此可見，成纖維細胞在瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展過程中起著主要作用，但成纖維細胞并不是由單一一群細胞亞群組成的。有文獻[5]表明，成纖維細胞由一大類有著不同細胞表面抗原的成纖維細胞組成，其不僅會在增殖分化以及機體不同的生長階段發(fā)生表型及功能的改變，而且在不同部位成纖維細胞表達細胞因子、增殖能力以及細胞表型方面都有一定差異，在皮膚、真皮層和表皮層的成纖維細胞組成上也表現出明顯的異質性。

在臨床實踐中，筆者發(fā)現不同患者以及不同部位來源的瘢痕疙瘩其治療效果有差異。這種治療上的異質性促使筆者思考其是否與瘢痕疙瘩的異質性有關。瘢痕疙瘩不能精準化治療以及復發(fā)問題一直是治療的重點難點[6]，而對瘢痕疙瘩進行更加準確的靶向治療的方法就是定位關鍵的致病亞群。目前不少的文獻表明，DPP4陽性成纖維細胞可能是纖維化疾病中一類關鍵的細胞亞群。從小鼠動物模型里分選出來的成纖維細胞顯示，表達En1基因的成纖維細胞是合成分泌細胞外基質，參與各種纖維化過程的主要效應細胞。而DPP4分子是一類可以作為區(qū)分En1表達情況的細胞表面標記物，在皮膚纖維化模型動物中，DPP4陽性成纖維細胞被認為是參與形成導致細胞外基質纖維化的主要細胞亞群[7]。在皮膚損傷過程中，活化的MAPK途徑可以增加表皮IL-1α的分泌，從而誘導真皮成纖維細胞DPP4表達上升，抑制DPP4表達可以抑制損傷導致腫瘤發(fā)生的過程。DPP4在其他疾病中也起著作用，例如人們發(fā)現在淋巴瘤、黑素瘤等腫瘤疾病中，DPP4陽性與腫瘤細胞侵襲性增加有一定關系。在其他一些由外傷刺激誘發(fā)的腫瘤如宮頸癌等疾病中，DPP4分子在其中的真皮細胞與表皮細胞的表達都有顯著的上調[8]。另外有文獻表明，DPP4陽性細胞亞群在結直腸癌、Ewing肉瘤、間皮瘤以及血液系統(tǒng)腫瘤中有著更高的侵襲性、增殖力以及腫瘤惡性。有文獻[9]表明，DPP4陽性成纖維細胞不僅在瘢痕疙瘩中比例增加，DPP4陽性成纖維細胞的TGF-β1、IGF-1、IL-6、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達也比DPP4陰性成纖維細胞要高。而抑制DPP4活性可以降低成纖維細胞增殖能力和TGF-β1分泌水平。

本研究通過蛋白免疫印跡和定量PCR法發(fā)現DPP4在瘢痕疙瘩中的表達上升，結合目前發(fā)現的DPP4陽性成纖維細胞亞群的功能活躍情況，進一步表明DPP4陽性成纖維細胞可能是導致瘢痕疙瘩形成的主要細胞亞群，為今后對瘢痕疙瘩進行精準治療做了一些基礎鋪墊。

[參考文獻]

[1]Hu M S，Moore A L，Longaker M T.A fibroblast is not a fibroblast is not a fibroblast[J].Invest Dermatol，2018，138（4）：729-730. doi：10.1016/j.jid.2017.10.012

[2]Worthen C A，Cui Y，Orringer J S，et al.CD26 identifies a subpopulation of fibroblasts that produce the majority of collagen during wound healing in human skin[J].J Invest Dermatol，2020，140（12）：2515-2524. doi： 10.1016/j.jid.2020.04.010.

[3]鄧雨萌，雷霞.炎性反應在瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究[J].中國美容醫(yī)學，2020，29（4）：167-169.doi：CNKI：SUN：MRYX.0.2020-04-054

[4]Tsai C H，Ogawa R.Keloid research：current status and future directions[J].Scars Burn Heal，2019，5：1-8. doi：10.1177/2059513119868659.

[5]Rippa A L，Kalabusheva E P，Vorotelyak E A.Regeneration of dermis：scarring and cells involved[J].Cells，2019，8（6）：607-637.doi： 10.3390/cells8060607.

[6]羊乃康，孫琦.A型肉毒毒素與曲安奈德治療瘢痕疙瘩的療效和安全性比較[J].中國美容醫(yī)學，2020，29（5）：66-69.doi：CNKI：SUN：MRYX.0.2020-05-023

[7]Soare A，Gy?rfi H A，Matei A E，et al.Dipeptidylpeptidase 4 as a marker of activated fibroblasts and a potential target for the treatment of fibrosis in systemic sclerosis[J].Arthritis Rheumatol，2020，72（1）：137-149.doi： 10.1002/art.41058.

[8]Shaw T J，Rognoni E.Dissecting fibroblast heterogeneity in health and fibrotic disease[J].Curr Rheumatol Rep，2020，22（8）：33.doi：10.1007/s11926-020-00903-w.

[9]Suwanai H，Watanabe R，Sato M，et al.Dipeptidyl peptidase-4 inhibitor reduces the risk of developing hypertrophic scars and keloids following median sternotomy in diabetic patients：a nationwide retrospective cohort study using the national database of health insurance claims of japan[J].Plast Reconstr Surg，2020，146（1）：83-89.doi： 10.1097/PRS.0000000000007935.

[收稿日期]2020-03-12

本文引用格式：梁仲堯，岑瑛.二肽基肽酶-4在瘢痕疙瘩中的表達情況研究[J].中國美容醫(yī)學，2022，31（1）：87-89.