從葡萄籽中發(fā)現(xiàn)天然類(lèi)黃酮原花青素C1具有抗衰老活性可延長(zhǎng)小鼠壽命百分之六十四點(diǎn)二

衰老是包括心血管疾病、代謝性疾病、神經(jīng)退行性病理和各種惡性腫瘤在內(nèi)的慢性疾病的最大風(fēng)險(xiǎn)因素之一。衰老相關(guān)的器官功能衰退和與年齡相關(guān)的慢性疾病風(fēng)險(xiǎn)增加，部分是由衰老細(xì)胞的積累驅(qū)動(dòng)的。

近年來(lái)，細(xì)胞衰老受到了廣泛的關(guān)注，因?yàn)樗话l(fā)現(xiàn)是一種可被藥物靶向的過(guò)程。目前來(lái)看，通過(guò)抗衰老治療可以預(yù)防或延遲多種衰老相關(guān)疾病。

發(fā)表研究論文發(fā)現(xiàn)類(lèi)黃酮原花青素C1具有抗衰老活性并可顯著延長(zhǎng)小鼠健康壽命和平均壽命。

低濃度葡萄籽萃取物可以抑制衰老相關(guān)的分泌表型（SASP）

為了尋找能有效調(diào)節(jié)衰老細(xì)胞的新化合物，研究者利用由46種植物源性藥物組成的植物化學(xué)文庫(kù)（PDMA文庫(kù)）進(jìn)行了無(wú)偏倚篩選。

在該研究中，研究人員用博萊霉素誘導(dǎo)人類(lèi)原代前列腺間質(zhì)細(xì)胞系PSC27進(jìn)入衰老狀態(tài)并呈現(xiàn)出一種典型的表型，即SASP?；谒ダ螾SC27細(xì)胞進(jìn)行的PDMA文庫(kù)大規(guī)模篩選，鑒定出了幾種具有選擇性殺傷衰老細(xì)胞潛力的化合物，包括低濃度葡萄籽萃取物，槲皮素，非瑟素，姜黃素和胡椒龍胺。

因既往關(guān)于低濃度葡萄籽萃取物的研究較少，研究人員隨后對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步研究。他們發(fā)現(xiàn)在體外條件下，低濃度葡萄籽萃取物可以使SASP分子標(biāo)記的表達(dá)降低，并且發(fā)現(xiàn)p65的核易位在低濃度（如0.1875μgml?1）時(shí)可以被低濃度葡萄籽萃取物拮抗，在低濃度葡萄籽萃取物濃度較高時(shí)反而出現(xiàn)增強(qiáng)，可能是細(xì)胞凋亡造成的一種炎性表型。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，在不同低濃度葡萄籽萃取物處理?xiàng)l件下，衰老細(xì)胞的反應(yīng)不同。進(jìn)一步生信分析發(fā)現(xiàn)，低濃度葡萄籽萃取物在特定濃度范圍內(nèi)具有控制衰老細(xì)胞促炎性表型的作用。

低濃度葡萄籽萃取物在高濃度時(shí)具有抗衰老效應(yīng)

研究人員進(jìn)一步探索了高濃度低濃度葡萄籽萃取物對(duì)衰老細(xì)胞的殺傷作用。SA-β-Gal染色結(jié)果表明，在0.75μgml?1的低濃度葡萄籽萃取物濃度下，衰老細(xì)胞開(kāi)始被清除;在3.75μgml?1濃度時(shí)，衰老細(xì)胞存活率降低至20%的極限平臺(tái)階段。

重要的是，即使在高濃度條件下，低濃度葡萄籽萃取物對(duì)增殖細(xì)胞也幾乎不產(chǎn)生殺傷作用。機(jī)制方面研究顯示，低濃度葡萄籽萃取物對(duì)衰老細(xì)胞的殺傷作用主要是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡、促進(jìn)線粒體氧化應(yīng)激而實(shí)現(xiàn)。

低濃度葡萄籽萃取物中的類(lèi)黃酮原花青素C1（PCC1）具有抗衰老細(xì)胞作用

接下來(lái)，研究人員利用HPLC及QTOF-MS技術(shù)對(duì)低濃度葡萄籽萃取物的成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了三種主要的植物化學(xué)物質(zhì)：包括酚酸、類(lèi)黃酮（如黃烷-3-醇、原花青素）和其它化合物。其中，少數(shù)成分被鑒定為原花青素及其衍生物，這些物質(zhì)在以往的研究中被發(fā)現(xiàn)可以靶向線粒體蛋白并緩解多種人類(lèi)慢性疾病。

HPLC-QTOF-MS的初步分析表明，低濃度葡萄籽萃取物在特定的質(zhì)譜峰處的譜圖與PCC1的譜圖相互匹配。PCC1既往被證明可以誘導(dǎo)DNA損傷、導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和檢查點(diǎn)激酶表達(dá)增加，并且可能通過(guò)誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。研究人員推測(cè)：PCC1是否在靶向誘導(dǎo)衰老細(xì)胞凋亡方面具有某種優(yōu)勢(shì)呢？因此，他們對(duì)PCC1的選擇性抗衰老能力開(kāi)展了一系列深入研究。

數(shù)據(jù)表明，PCC1在體外濃度為50μM時(shí)開(kāi)始對(duì)衰老基質(zhì)細(xì)胞具有抗衰老作用，直到PCC1濃度增加至200μM對(duì)衰老細(xì)胞的殺傷作用達(dá)到平臺(tái)期時(shí)，增殖細(xì)胞也基本不受影響。

只有當(dāng)PCC1濃度為600μM或更高時(shí)，才對(duì)對(duì)照組，即正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。這說(shuō)明PCC1以劑量依賴(lài)性的方式選擇性清除衰老的人基質(zhì)細(xì)胞，但在適當(dāng)?shù)臐舛认聦?duì)未衰老的細(xì)胞卻無(wú)顯著作用。并且研究者們還在人類(lèi)胎兒肺成纖維細(xì)胞（WI38）、原始人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的衰老細(xì)胞中對(duì)PCC1的選擇性抗衰老能力進(jìn)行了擴(kuò)大驗(yàn)證，基本重復(fù)了之前在PSC27細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，泛半胱天冬氨酸酶凋亡抑制劑QVD-OPh可以明顯逆轉(zhuǎn)PCC1的抗衰老作用，而鐵死亡、焦亡或壞死相關(guān)的抑制劑分析卻對(duì)PCC1的作用沒(méi)有影響，這說(shuō)明PCC1主要是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)發(fā)揮抗衰老作用的。對(duì)低濃度葡萄籽萃取物中的其它組分進(jìn)行研究時(shí)，在PCC1的劑量范圍內(nèi)，大多數(shù)低濃度葡萄籽萃取物成分沒(méi)有表現(xiàn)出抗衰老作用。這些結(jié)果說(shuō)明，PCC1是低濃度葡萄籽萃取物抗衰老作用的主要成分。

PCC1引起衰老細(xì)胞線粒體功能障礙

在化學(xué)本質(zhì)上PCC1屬于類(lèi)黃酮超家族，可以清除自由基、螯合金屬離子、減少過(guò)氧化氫的形成，其抗氧化性能歸因于結(jié)構(gòu)中的“-OH”基團(tuán)及其在類(lèi)黃酮分子環(huán)上的位置。為了探索PCC1的作用機(jī)制，研究人員首先分析了PCC1對(duì)衰老細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的影響。

GSEA譜顯示SASP和NF-κB通路均被PCC1顯著抑制，其中表達(dá)差異最顯著的是一些分泌因子。逆向?qū)嶒?yàn)顯示PCC1可以部分通過(guò)促凋亡分子NOXA和PUMA來(lái)介導(dǎo)衰老細(xì)胞的凋亡。因?yàn)樵诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中，原花青素通常可以增加細(xì)胞活力，減少ROS的產(chǎn)生，并抑制氧化應(yīng)激。

接下來(lái)，研究人員想知道是否可以在暴露于PCC1的衰老細(xì)胞中觀察到類(lèi)似的抗氧化作用。令人驚訝的是，研究結(jié)果與預(yù)期恰恰相反，當(dāng)使用PCC1處理時(shí)，衰老的PSC27細(xì)胞顯示出更高的ROS水平，而HS-1793（一種穩(wěn)定的白藜蘆醇類(lèi)似物，具有自由基清除活性）可以有效地阻止PCC1治療的衰老細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生。

然而，在PCC1處理過(guò)的衰老細(xì)胞暴露于CCCP（一種原載體線粒體非偶聯(lián)劑）或ruxotemitide（LTX-315）（一種誘導(dǎo)線粒體外膜滲透的兩親性陽(yáng)離子肽）后，ROS水平進(jìn)一步升高。盡管使用CCCP或Ruxotemtide本身也會(huì)引起ROS產(chǎn)生的增強(qiáng)，但其效果弱于PCC1，提示PCC1可以引起衰老細(xì)胞線粒體功能障礙。研究同時(shí)顯示，PCC1治療促進(jìn)了細(xì)胞色素c從線粒體釋放到周?chē)?xì)胞質(zhì)空間，而這一過(guò)程通常直接驅(qū)動(dòng)凋亡的發(fā)生。

p53作為一種調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的因子，既可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活促凋亡基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可以通過(guò)轉(zhuǎn)位到線粒體以一種轉(zhuǎn)錄非依賴(lài)的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究人員發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞衰老時(shí)p53核易位明顯增加，而PCC1可以減p53核易位。由于p53的核排出是誘導(dǎo)衰老細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟，研究人員進(jìn)一步評(píng)估了PCC1對(duì)p53分布的影響。

結(jié)果顯示在PCC1處理的衰老細(xì)胞中，細(xì)胞核中p53水平降低，但線粒體中p53水平升高，說(shuō)明p53由細(xì)胞核向線粒體基質(zhì)的易位增強(qiáng)。同時(shí)，研究人員還發(fā)現(xiàn)PCC1處理后，線粒體膜電位在衰老細(xì)胞中顯著減少，而線粒體膜電位下降可以通過(guò)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在途徑觸發(fā)細(xì)胞凋亡。這說(shuō)明PCC1可以促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，觸發(fā)細(xì)胞色素C的釋放，并導(dǎo)致衰老細(xì)胞線粒體膜電位紊亂，最終導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)、驅(qū)動(dòng)細(xì)胞凋亡。

以上結(jié)果表明，PCC1一方面通過(guò)上調(diào)促凋亡因子NOXA和PUMA，另一方面通過(guò)活性氧生成增強(qiáng)和線粒體功能障礙來(lái)介導(dǎo)衰老細(xì)胞發(fā)生凋亡。

PCC1促進(jìn)腫瘤消退，減少化療耐藥性

在臨床中，耐藥限制了大多數(shù)抗癌治療的療效，而衰老細(xì)胞往往通過(guò)在藥物損傷的腫瘤微環(huán)境中形成SASP表型而導(dǎo)致治療耐藥的發(fā)生。因而研究人員進(jìn)一步探索PCC1是否可以通過(guò)減少原發(fā)腫瘤病灶中的衰老細(xì)胞來(lái)提高抗癌治療效果。

首先，研究人員將PC3前列腺癌細(xì)胞和原始PSC27基質(zhì)細(xì)胞混合接種到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞可以促進(jìn)前列腺癌的生長(zhǎng)。通過(guò)給藥實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，盡管PCC1單獨(dú)給藥不能使腫瘤體積縮小，但是其與化療藥物米托蒽醌聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，較米托蒽醌單藥治療的效果明顯增加。

對(duì)給藥后的腫瘤進(jìn)行免疫組化和轉(zhuǎn)錄測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，米托蒽醌治療可以明顯使腫瘤中的基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生衰老性變化，主要表現(xiàn)為SASP因子和衰老標(biāo)記分子p16INK4a的升高，而聯(lián)合PCC1治療后，這些衰老性變化則可以被明顯逆轉(zhuǎn)。

并且PCC1聯(lián)合米托蒽醌治療時(shí)，腫瘤細(xì)胞的DNA損傷和細(xì)胞凋亡顯著增強(qiáng)，這說(shuō)明PCC1可以增強(qiáng)米托蒽醌的細(xì)胞毒性。生存研究表明，PCC1單獨(dú)治療僅能略微延長(zhǎng)生存期，而接受米托蒽醌-PCC1聯(lián)合治療的小鼠中位生存期最長(zhǎng)，存活時(shí)間比單獨(dú)接受米托蒽醌治療的小鼠延長(zhǎng)了48.1%。

另外值得注意的是，PCC1的治療并沒(méi)有對(duì)小鼠的肝腎功能、免疫系統(tǒng)或其它關(guān)鍵器官造成明顯的損傷，這說(shuō)明PCC1聯(lián)合常規(guī)化療有可能增強(qiáng)腫瘤反應(yīng)而不引起嚴(yán)重的全身毒性。

以上數(shù)據(jù)表明，盡管單獨(dú)使用PCC1既不能抑制腫瘤生長(zhǎng)也不能促進(jìn)動(dòng)物生存，但PCC1與米托蒽醌聯(lián)合卻可以顯著增強(qiáng)化療效果，而不引起額外的毒副作用。

PCC1可以緩解身體功能障礙

既往研究顯示，即使少量的衰老細(xì)胞也能引起幼小動(dòng)物的身體機(jī)能障礙。那么PCC1是否可以在體內(nèi)選擇性地殺死衰老細(xì)胞，從而預(yù)防機(jī)體功能障礙？

為了回答這個(gè)問(wèn)題，研究人員利用帶熒光素酶的對(duì)照和衰老小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分別構(gòu)建皮下移植瘤模型，并給予PCC1治療。

結(jié)果顯示，對(duì)植入衰老細(xì)胞的小鼠進(jìn)行PCC1治療后，熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著降低，而植入帶熒光素酶對(duì)照細(xì)胞的小鼠的熒光信號(hào)強(qiáng)度沒(méi)有明顯改變，說(shuō)明PCC1在小鼠體內(nèi)具有選擇性抗衰老作用。將衰老細(xì)胞植入后的幼鼠用PCC1治療1周，可防止小鼠最大行走速度、吊掛耐力（吊掛試驗(yàn)）和握力（握力米）的下降，同時(shí)還可以預(yù)防幼鼠出現(xiàn)生理功能障礙。

接下來(lái)，研究者評(píng)估消除衰老細(xì)胞對(duì)中年動(dòng)物的益處。為此，研究人員在17月齡的C57BL/6J小鼠中分別植入對(duì)照和衰老的MEFs。

結(jié)果顯示，攜帶衰老細(xì)胞但只接受對(duì)照治療的動(dòng)物存活明顯低于接受PCC1治療組（死亡風(fēng)險(xiǎn)高出2.4倍）。但是兩組小鼠之間死亡相關(guān)的疾病、腫瘤負(fù)擔(dān)等沒(méi)有顯著差異。這說(shuō)明衰老細(xì)胞造成的負(fù)擔(dān)可以導(dǎo)致中年小鼠身體功能障礙、死亡率增加，但通過(guò)服用PCC1這種抗衰劑可以降低這些風(fēng)險(xiǎn)。

接著研究人員又選擇了兩種獨(dú)立的體內(nèi)衰老動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證PCC1的治療效果。值得注意的是，經(jīng)歷了全身放療的動(dòng)物表現(xiàn)出異常的身體外觀，包括明顯的灰白毛發(fā)，而PCC1在很大程度上逆轉(zhuǎn)了這一表型。同時(shí)PCC1治療后小鼠的最大步行速度、吊掛耐力、握力、跑步機(jī)耐力、日?；顒?dòng)和平衡性能都得到了改善。

解剖結(jié)果顯示，PCC1治療后的小鼠心臟、肺、腎臟等組織中SA-β-gal陽(yáng)性衰老細(xì)胞的百分比、衰老標(biāo)志物和關(guān)鍵SASP也明顯降低。

此外，研究人員還對(duì)老年小鼠（24個(gè)月～27個(gè)月的小鼠，大致相當(dāng)于75歲～90歲的人類(lèi)）給予了PCC1治療。結(jié)果顯示，PCC1治療組的中位生存時(shí)間延長(zhǎng)了64.2%（或總壽命延長(zhǎng)9.4%），而死亡率風(fēng)險(xiǎn)降低65.0%。這些數(shù)據(jù)表明PCC1可以顯著降低老年小鼠的年齡相關(guān)性死亡風(fēng)險(xiǎn)，但對(duì)小鼠生理機(jī)能并不造成明顯的負(fù)面影響。

總體而言，中科院孫宇團(tuán)隊(duì)的這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了低濃度葡萄籽萃取物中的提取物PCC1可以減輕衰老負(fù)擔(dān)和其它可能發(fā)展成促炎表型的細(xì)胞，促進(jìn)衰老細(xì)胞凋亡。同時(shí)在不引起小鼠發(fā)病率升高的情況下增加小鼠壽命。并且即使在老年動(dòng)物中使用，PCC1在延緩衰老相關(guān)功能障礙、減少衰老相關(guān)疾病和改善健康狀況方面仍具有十分突出的潛力，從而為未來(lái)老年醫(yī)學(xué)提高健康壽命和生存時(shí)間提供了新的希望。