白粉菌脅迫下苦荬菜生理指標和差異表達蛋白分析

胡遠彬 梁小玉 季楊 易軍 張靚

摘要：研究白粉菌脅迫對苦荬菜葉片生理指標及蛋白組的影響，為揭示苦荬菜響應白粉菌脅迫的分子機制奠定基礎。以龍牧苦荬菜（Lactuca indica L. cv. Longmu）為試驗材料，測定其接種白粉菌72 h后葉片生理指標的變化，并利用同位素相對和絕對定量標記技術聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質譜技術（iTRAQ-LC-MS/MS）結合生物信息學方法分析葉片差異表達蛋白及其富集情況。結果表明，接種白粉菌后過氧化物酶活性較對照極顯著增加（P<0.01），丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性均顯著增加（P<0.05），總葉綠素、葉綠素a和葉綠素b含量均下降。共篩選出200個差異表達蛋白，其中上調表達的蛋白有161個，下調表達的蛋白有39個。經(jīng)過蛋白注釋和富集分析，篩選出含Bet v 1結構域蛋白、含幾丁質結合1型結構域蛋白、過氧化物酶、細胞色素P450、4-香豆酸-輔酶A連接酶-7、咖啡酸3-O-甲基轉移酶和大根香葉烯A羥化酶7種差異表達蛋白與苦荬菜響應白粉菌脅迫有關?？噍げ嗽诎追劬{迫下，次生代謝和病程相關等蛋白顯著上調表達以響應白粉病侵染，推測過氧化物酶可能在機體響應白粉菌脅迫的調控中發(fā)揮了重要作用。

關鍵詞：苦荬菜;蒼耳單囊殼白粉菌;同位素相對和絕對定量標記（iTRAQ）;差異表達蛋白

中圖分類號： S435.4? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0147-07

收稿日期：2021-04-26

基金項目：四川省畜牧科學研究院基本科研業(yè)務費專項（編號：SASA2018A04）;國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系四川肉羊創(chuàng)新團隊（編號：sccxtd-2021-14）;四川省“十四五”牧草育種攻關項目（編號：2021YFYZ0013）。

作者簡介：胡遠彬（1988—），女，河南信陽人，碩士，助理研究員，主要從事牧草育種與栽培研究。E-mail：595368128@qq.com。

通信作者：梁小玉，博士，研究員，主要從事草種質資源評價與育種研究。E-mail：liangxiaoyucao@ 163.com。

苦荬菜（Lactuca indica）為菊科（Compositae）萵苣屬（Lactuca）一年生或越年生草本植物，具有適應性強、產草量高、營養(yǎng)豐富及藥用功能[1-2]等優(yōu)點，是多種畜禽及魚類喜食的優(yōu)質青綠多汁飼草[3]，也可作為功能性飼料添加劑[4]。隨著草牧業(yè)的發(fā)展及種草養(yǎng)畜觀念的增強，苦荬菜已在我國南北多省推廣種植，因連作、密植及氣候條件等因素，白粉病的危害日益突顯，已經(jīng)成為苦荬菜生產中的常見病害，在我國黑龍江[5]、四川[6]和貴州[7]等苦荬菜種植區(qū)多次報道，而防治該病害最為有效的措施是種植抗性品種，但尚未見免疫或高抗苦荬菜品種的報道。因此，研究白粉病病菌與苦荬菜之間的相互作用，篩選苦荬菜響應白粉病病菌侵染的防御相關蛋白，對深入研究苦荬菜響應白粉病脅迫的分子機制及選育高抗白粉病的苦荬菜品種具有重要意義。目前，關于苦荬菜白粉病的研究較少，僅在田間發(fā)病規(guī)律、防治及病原菌鑒定等方面有少量報道。研究發(fā)現(xiàn)，苦荬菜白粉病是由蒼耳單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）[7]或菊科高氏白粉菌（Golovinomyces cichoracearum）[8]引起的，主要危害葉片，導致葉片和植株早枯，對苦荬菜產量及飼用價值都有很大影響。目前，蛋白質組學技術已被廣泛應用于植物與病原真菌的互作研究中[9]，已鑒定出病程相關（pathogenesis-related，PR）蛋白家族、次生代謝途徑蛋白及其他防御相關蛋白等[10]。植物與白粉病病菌互作的研究主要集中在小麥（Triticum aestivum）、黃瓜（Cucumis sativus）和葡萄（Vitis vinifera）上，研究者多采用雙向凝膠電泳（2-DE）分離技術，但其分離精確度低，獲得的差異蛋白數(shù)量偏少[11]，而同位素相對和絕對定量標記（iTRAQ）是一種新型定量蛋白質組學技術，彌補了2-DE技術的不足。國內外未見苦荬菜響應白粉病病菌脅迫蛋白組學研究的報道，本研究結合生理指標，利用iTRAQ標記結合液相色譜與串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）技術，研究苦荬菜在白粉菌侵染后蛋白質組學的變化，以期為揭示苦荬菜響應白粉菌脅迫的分子機制及挖掘苦荬菜抗白粉病基因奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料龍牧苦荬菜由黑龍江省畜牧研究所提供。白粉菌為蒼耳單囊殼白粉菌（P. xanthii），采自四川省崇州市白頭鎮(zhèn)高筧村牧草試驗基地田間自然感病的龍牧苦荬菜葉片，純化后人工擴繁。

1.2 試驗設計

2018年7月在四川省畜牧科學研究院開展試驗，選取粒大飽滿的龍牧苦荬菜種子，用1% NaClO溶液浸泡10 min消毒后，用無菌水沖洗干凈，放入培養(yǎng)皿中保溫催芽1～2 d，挑選露白一致的種子，種在裝有滅菌營養(yǎng)土的花盆（上徑29 cm，下徑19 cm，高17 cm）中，每盆20株，共播種6盆，分為對照組和處理組。待幼苗長至2葉1心期時，接種組（TR）將濃度為5×104個/mL的白粉病病菌分生孢子懸浮液采用噴霧接種法進行接種;對照組（CK）噴施等量蒸餾水，保濕24 h后，置于晝/夜溫度周期為 25 ℃/20 ℃、相對濕度為70%～80%、光/暗周期為16 h/8 h的人工氣候箱中培養(yǎng)。接種72 h[12]后分別采集對照組、接種組的第2張真葉，每組設3次重復，用液氮冷凍后于-80 ℃保存，備用。

1.3 生理指標的測定

過氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、總葉綠素含量、葉綠素a和葉綠素b含量均參照郝再彬等的方法[13]進行測定。

1.4 葉片總蛋白質的提取

稱取適量的冷凍葉片至預冷的研缽中，加液氮研磨成粉，具體按照郭偉等的方法[14]進行總蛋白質的提取，用二奎啉甲酸 （BCA） 法測定蛋白質濃度。

1.5 iTRAQ標記和液質檢測

蛋白質樣品經(jīng)胰酶酶解成肽段，用Phenomenex StrataX C18除鹽后真空冷凍干燥。參照iTRAQ-4plex試劑盒說明標記肽段，混合標記后的肽段用Agilent 300Extend C18進行分級（分級梯度為8%～32%乙腈，pH值為9），合并為9個組分后進行真空冷凍干燥。然后采用EASY-nLC 1200超高效液相色譜儀、Q Exactive HF-X質譜儀進行液相分離和質譜分析。

1.6 質譜數(shù)據(jù)分析

用MaxQuant（v1.5.2.8）軟件進行質譜數(shù)據(jù)解析。檢索數(shù)據(jù)庫為Uniprot Lactuca_ sativa_4236_PR_20190118（37 927條序列），蛋白質鑒定、肽匹配圖譜鑒定的假陽性率均設置為1%。設定蛋白質的差異倍數(shù)>1.2或<1/1.2，P<0.05表示差異表達。

1.7 數(shù)據(jù)處理及生物信息學分析

用Excel 2010和SPSS 17.0 軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。對鑒定到的蛋白質進行COG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫注釋，并對篩選出的差異表達蛋白進行GO、KEGG和結構域富集分析。

2 結果與分析

2.1 生理生化指標的測定

由圖1可知，接種P. xanthii后，苦荬菜葉片中的MDA含量呈顯著上升趨勢（P<0.05），是對照組的1.25倍，說明此時細胞膜脂過氧化程度增加;POD活性呈極顯著上升趨勢（P<0.01），是對照組的1.72倍;SOD活性呈顯著上升趨勢（P<0.05），較對照組增加了11.34%。POD、SOD這2種抗氧化酶通過清除活性氧（ROS）維持機體的氧化還原平衡。此外，接種組總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b含量均呈下降趨勢，較對照組降低了6.66%～7.06%，表明機體的光合作用受到了一定影響。

2.2 差異表達蛋白的篩選

利用iTRAQ-LC-MS/MS技術在龍牧苦荬菜的處理組、對照組中共鑒定到6 758個蛋白質，其中6 104個蛋白質具有定量信息。在白粉菌脅迫下共有200個差異表達蛋白發(fā)生顯著變化，其中顯著上調表達的蛋白質有161個，顯著下調表達的蛋白質有39個，顯著上調表達的蛋白質數(shù)量明顯多于下調表達的蛋白質（圖2）。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達蛋白主要位于葉綠體、細胞質和細胞核中（圖3）。

2.3 差異表達蛋白的COG功能分類

200個差異表達蛋白經(jīng)COG數(shù)據(jù)庫比對后，有140個被注釋并進行了功能分類。從圖4可以看出，被注釋的差異表達蛋白共分為21類，其中次生代謝物的生物合成、運輸和分解代謝類蛋白數(shù)量最多（18個），還有16個細胞內運輸、分泌和囊泡運輸類蛋白質，14個翻譯后修飾、蛋白質折疊、分子伴侶類蛋白質，10個能量生產和轉化類蛋白質，10個碳水化合物的運輸和代謝翻譯類蛋白質，此外還有細胞骨架類、防御機制類等，這些類別的蛋白質可能在植物與病原菌的互作中發(fā)揮著不同作用。

2.4 差異表達蛋白的GO注釋與富集分析

將差異表達蛋白進行GO注釋和功能富集分析，以確定差異表達蛋白參與的生物學過程、行使的分子功能及所處的細胞環(huán)境。由圖5可以看出，GO注釋到差異表達蛋白有130個，顯著富集條目有19個（P<0.05），細胞組分中有3個條目顯著富集（P<0.05），其中極顯著富集（P<0.01）的有2個條目，為細胞壁和胞間連絲，均富集上調蛋白;分子功能中有8個條目顯著富集（P<0.05），主要有細胞骨架蛋白結合、氧化還原酶活性-作用于配對供體、水解酶活性-作用于酯鍵、過氧化物酶活性和熱激蛋白結合、單加氧酶活性、跨膜轉運體活性、磷酸酶活性等，主要富集上調蛋白，其中前2個條目極顯著富集（P<0.01）;生物過程有8個條目顯著富集（P<0.05），主要有次生代謝產物的生物合成過程、創(chuàng)傷反應、免疫系統(tǒng)發(fā)育、水分運輸、脫磷酸作用、離子跨膜運輸、細胞骨架組織、對細胞外刺激的反應等，主要富集上調蛋白，其中前4個條目為極顯著富集（P<0.01）。

2.5 差異表達蛋白的KEGG富集分析

通過KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達蛋白進行代謝通路顯著性富集分析，確定差異蛋白可能參與的生化代謝途徑。如圖6所示，接種后差異表達蛋白顯著富集到4條生化代謝途徑，分別為苯丙烷類生物合成，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，ABC轉運蛋白和酪氨酸代謝，其中前2條代謝途徑為極顯著富集（P<0.01），其包含的差異表達蛋白數(shù)量分別為6、5個，這4條生化代謝途徑均富集上調表達蛋白。

2.6 差異表達蛋白的結構域富集分析

蛋白質結構域是具有相似的序列、結構和功能的蛋白質進化單元。對鑒定到的差異表達蛋白進行結構域富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達蛋白被富集到18個類別中，其中達到顯著富集水平的有14類（P<0.05），達到極顯著富集水平的有4類（P<0.01），分別為病程相關蛋白Bet v 1家族、幾丁質酶Ⅰ類、幾丁質識別蛋白和微管蛋白C末端結構域（圖7）。此外，細胞色素P450、病程相關蛋白Bet v 1家族和幾丁質酶Ⅰ類差異表達蛋白數(shù)量分別為6、4、2個，均為富集上調表達蛋白。

2.7 目標差異蛋白

根據(jù)差異表達蛋白GO富集、KEGG富集及結構域富集結果，從參與苦荬菜響應白粉菌脅迫的次生代謝產物生物合成過程、病原相關蛋白Bet v 1家族、過氧化物酶和幾丁質酶Ⅰ類4個途徑或類別中篩選出7種共16個目標差異蛋白。其中參與次生代謝產物生物合成過程有7個差異表達蛋白，均為上調表達;POD包含3個上調表達的差異蛋白;病原相關蛋白Bet v 1家族包含4個含Bet v 1結構域蛋白， 除A0A2J6L9I3外，其余3個差異表達蛋白均上調表達;幾丁質酶Ⅰ類包含 2個上調表達的含幾丁質結合1型結構域蛋白（表1）。

3 討論與結論

病原真菌侵入植物體后可引起寄主體內發(fā)生復雜的生理變化。葉綠素與植物的光合作用密切相關，能客觀反映植物抗病性的強弱。周夢韓等研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜感染白粉病初期葉片葉綠素含量明顯降低[15]。在本研究中，接種P. xanthii 72 h后苦荬菜葉片中的總葉綠素、葉綠素a和葉綠素b含量均下降。MDA含量主要反映細胞膜脂過氧化的程度，其含量越高，說明細胞膜穩(wěn)定性越差[16]。SOD、POD在植物體內活性氧清除過程中起重要作用。蘋果感病品種接種白粉菌后，SOD、POD等相關酶活性增強，MDA含量增加，葉綠素含量下降[17]。在本研究中，苦荬菜接種P. xanthii后，POD活性、SOD活性及MDA含量均極顯著或顯著上升，這與前人研究結果[17]一致，且POD活性的變化規(guī)律與其相關蛋白A0A2J6JJ85、A0A2J6JJ68、A0A2J6JJ94的表達情況一致，在接種后均呈上調表達。

本研究利用iTRAQ-LC-MS/MS技術對苦荬菜接種P. xanthii 72 h后差異表達蛋白進行分析，共發(fā)現(xiàn)200個差異表達蛋白發(fā)生顯著變化，其中上調表達的蛋白質有161個，下調表達的蛋白質有39個，上調表達蛋白的數(shù)量明顯多于下調表達蛋白，主要有PR蛋白和次生代謝相關蛋白等，其中PR蛋白在宿主響應病原菌侵染的防御反應機制中起關鍵作用[18]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)4個含Bet v 1結構域蛋白、2個含幾丁質結合1型結構域蛋白及3個POD蛋白，除1個含Bet v 1結構域蛋白（A0A2J6L9I3）下調外，其余均上調表達。病程相關蛋白Bet v 1家族含Bet v 1結構域蛋白，屬于PR10[19]，葡萄接種白粉菌后，鑒定出PR10及與PR10具有相同保守結構域Bet v 1-like蛋白[20-21]，推測PR10與葡萄的白粉病抗性有關，可能通過降解病原體RNA和誘導宿主細胞程序性死亡發(fā)揮雙重作用[22]。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，幾丁質酶通過水解真菌菌絲細胞壁中的幾丁質聚合物影響真菌的生長[23]，同時產生的幾丁質產物，可作為信號分子誘發(fā)進一步的防御反應。葡萄敏感品種受葡萄鉤絲殼（Uncinula necator）感染后，葉片中幾丁質酶等病程相關蛋白基因被強烈誘導，其中幾丁質酶Ⅰ類在嚴重感染的葉片中被檢測到[24]。POD屬于 PR-9，可由真菌誘導產生，通過建立結構屏障或產生高毒性環(huán)境來限制感染擴散，同時作為一種植物保護酶，在后期負責清除H2O2以減輕植物所受損害[25]。李杰對高感病小麥品種西農979接種白粉菌72 h后的蛋白組表達分析發(fā)現(xiàn)，POD大量表達[26]。因此可見，含Bet v 1結構域蛋白、含幾丁質結合1型結構域蛋白和POD這3類PR蛋白在白粉菌侵染后上調表達可能與其響應侵染有關。

另外，次生代謝物木質素、酚類、萜類等在植物抵御病原真菌中發(fā)揮著重要作用[27-28]。本研究在龍牧苦荬菜響應白粉菌脅迫中共獲得5種與次生代謝產物生物合成相關的差異蛋白，包括細胞色素P450（CYP450）、咖啡酸3-O-甲基轉移酶（COMT）、4-香豆酸-輔酶A連接酶-7（4-CLL7）、POD和大根香葉烯A羥化酶，均為上調表達蛋白。CYP450是一類多功能氧化酶，參與木質素、萜類等次生代謝產物的合成[29-30]。薛飛利用基因芯片分析小麥N9134在白粉菌生理小種E09脅迫下的表達譜，發(fā)現(xiàn)CYP450、POD等差異表達基因參與抗白粉病代謝調控[31];Li等利用轉錄組技術鑒定到CYP450等6個候選基因在大麥高抗品種鳳7中持續(xù)上調表達，增強了植株對白粉病的抗病性[32]。有研究發(fā)現(xiàn)，4-香豆酸-輔酶A連接酶（4CL）、COMT和POD均與木質素合成有關[33-35];Wang等研究發(fā)現(xiàn)，小麥COMT基因（TaCOMT-3D）可能通過促進木質素的積累來提高對紋枯病的抗性[36]。在本研究中，CYP450、COMT、4-CLL7和POD這4類差異蛋白的表達水平顯著升高，說明苦荬菜與白粉菌互作過程中苯丙烷生物合成活躍，木質素等代謝物質大量合成，可通過植物細胞壁木質化以抵御病原菌的侵染。這可能是植株被白粉菌侵染后，其粗纖維含量升高從而影響營養(yǎng)價值的原因。此外，大根香葉烯A羥化酶參與倍半萜內酯的生物合成[37]，該蛋白上調表達可能與響應白粉菌脅迫有關。

白粉病影響苦荬菜的正常生長發(fā)育，從而導致降質減產。接種P. xanthii后，苦荬菜葉片MDA含量增加使膜脂過氧化程度升高，葉綠素含量降低導致光合作用受影響，機體通過增加POD、SOD防御酶活性來維持動態(tài)平衡。同時，Bet v 1結構域蛋白、幾丁質結合1型結構域蛋白等PR蛋白和CYP450、COMT、4-CLL7等次生代謝相關蛋白出現(xiàn)顯著差異表達，它們主要通過上調表達以響應白粉菌的脅迫。由此推測，POD可能在機體響應白粉菌脅迫的調控中發(fā)揮重要作用。

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