電針“委中”穴對(duì)腰多裂肌損傷大鼠鐵代謝的調(diào)節(jié)

呂巧巧 李霞 田圓 徐菁 陳莉 張莉 霍則軍

〔摘要〕 目的 觀察多時(shí)間點(diǎn)大鼠多裂肌損傷后鐵代謝相關(guān)蛋白的變化規(guī)律，探討不同干預(yù)時(shí)間條件下電針“委中”穴對(duì)多裂肌損傷性腰痛的治療作用。方法 SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、電針組，每組30只，各組再分為1 d、2 d、3 d、5 d、7 d 5個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。采用注射0.5%布比卡因（bupivacaine， BPVC）的方法造模，電針組電針雙側(cè)“委中”穴（1次/d），正常組、模型組不進(jìn)行電針干預(yù)。分別于治療的1 d、2 d、3 d、5 d、7 d取材。采用HE染色觀察造模前后多裂肌形態(tài)變化;采用生化法檢測(cè)多裂肌組織總鐵含量變化;采用Western blot法檢測(cè)鐵蛋白重鏈（ferritin heavy chain1， FTH1）含量;采用Real-time PCR法檢測(cè)多裂肌膜蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1， Tfr1）、二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（divalent metal transporter 1， DMT1）mRNA的表達(dá)。結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，模型組相較于正常組可見(jiàn)肌纖維斷裂、壞死并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與同時(shí)間點(diǎn)模型組相比，電針組受損肌纖維可見(jiàn)明顯改善。生化法檢測(cè)結(jié)果顯示，與同時(shí)間點(diǎn)正常組相比，模型組、電針組總鐵含量升高（P<0.01）;Western blot、Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果提示模型組FTH1蛋白表達(dá)低于正常組（P<0.05或P<0.01），而Tfr1與DMT1 mRNA表達(dá)均高于正常組（P<0.05或P<0.01）;與同時(shí)間點(diǎn)模型組相比，電針1 d、2 d、3 d、5 d組FTH1蛋白表達(dá)升高（P<0.05或P<0.01），而電針2 d、3 d、5 d、7 d 組Tfr1 mRNA和電針1 d、2 d、3 d、5 d 組DMT1 mRNA表達(dá)均降低（P<0.05或P<0.01）;各模型組間比較發(fā)現(xiàn)，模型2 d組FTH1蛋白表達(dá)最低（P<0.05），而模型2 d、3 d組Tfr1 mRNA表達(dá)較高（P<0.05），模型3 d組DMT1 mRNA表達(dá)最高（P<0.05）;各電針組比較結(jié)果顯示，F(xiàn)TH1蛋白在電針2 d組最高（P<0.05），電針3 d、5 d、7 d組Tfr1 mRNA表達(dá)較低（P<0.05），電針3 d組DMT1 mRNA表達(dá)較高（P<0.05）。結(jié)論 在BPVC致多裂肌損傷模型中，局部受損多裂肌發(fā)生鐵代謝紊亂，且在急性損傷期較典型。電針“委中”穴能促進(jìn)損傷多裂肌的修復(fù)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)多裂肌鐵代謝、減輕組織過(guò)氧化損傷相關(guān)，并且在電針持續(xù)干預(yù)3 d后顯著促進(jìn)對(duì)鐵代謝紊亂水平的調(diào)節(jié)。

〔關(guān)鍵詞〕 多裂肌損傷;電針;鐵代謝;鐵蛋白;轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1;二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R245? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.02.014

Regulation of electroacupuncture at "Weizhong" （BL40） on iron metabolism in

rats with lumbar multifidus muscle injury

LU Qiaoqiao1， LI Xia1， TIAN Yuan1， XU Jing2， CHEN Li3， ZHANG Li1*， HUO Zejun4*

（1. School of Acupuncture and Massage， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China;

2. Department of Rehabilitation Medicine， People's Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou， Zhejiang 310014， China;

3. Beijing Byte Beat Network Technology Co.， Ltd.， Beijing 100086， China; 4. Department of Traditional Chinese

Medicine， The Third Hospital of Peking University， Beijing 100191， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the changes of iron metabolism related proteins after lumbar multifidus muscle injury （LMMI）， and to explore the therapeutic effect of electroacupuncture （EA） at "Weizhong" （BL40） on back pain caused by LMMI under different intervention time. Methods SD rats were randomly divided into normal group （n=30）， model group （n=30） and EA group （n=30）. Each group was further divided into five subgroups （1 d， 2 d， 3 d， 5 d， 7 d）， with 6 rats in each group. The LMMI model was made by injecting 0.5% bupivacaine （BPVC）. EA group was treated EA at both sides of "Weizhong" （BL40） points once a day， the normal group and model group were not intervened by EA. The samples were collected at 1， 2， 3， 5 and 7 days after treatment. HE staining was used to observe the morphological changes of multifidus muscle before and after modeling; biochemical method was used to detect the content of total iron in multifidus tissue; Western blot method was used to detect the content of ferritin heavy chain 1 （FTH1）; and Real-time PCR method was used to detect the expression of multifidus membrane protein transferrin receptor 1 （Tfr1） and divalent metal transporter 1 （DMT1） mRNA. Results The results of HE staining showed that the muscle fibers in the model group were broken， necrotic and accompanied with inflammatory cell infiltration compared with the normal group， and the damaged muscle fibers were significantly improved in the EA group compared with the model group at the same time. The results of biochemical method showed that the content of total iron in the model group and EA group was higher than that in the normal group at the same time （P<0.01）. Western blot and Real-time PCR showed， the expression of FTH1 protein in the model group was lower than that in the normal group （P<0.05 or P<0.01）， while the expression of Tfr1 and DMT1 mRNA in the model group was higher than that in the normal group （P<0.05 or P<0.01）. Compared with the model group at the same time， the expression of FTH1 protein increased in the EA 1 d， 2 d， 3 d and 5 d groups （P<0.05 or P<0.01）， while the Tfr1 mRNA expression decreased in the EA 2 d， 3 d， 5 d and 7 d groups and the DMT1 mRNA expression decreased in the EA 1 d， 2 d， 3 d and 5 d groups （P<0.05 or P<0.01）. Compared with each model group， it is found that the expression of FTH1 protein in model 2 d group was the lowest （P<0.05）， while the expression of Tfr1 mRNA in model 2 d and 3 d groups was higher （P<0.05）， the expression of DMT1 mRNA in model 3 d group was the highest （P<0.05）. Compared with each EA group， the results showed that the expression of FTH1 protein was the highest in the EA 2 d group （P<0.05）， the expression of Tfr1 mRNA was lower in the EA 3 d， 5 d and 7 d groups （P<0.05）， and the expression of DMT1 mRNA was higher in the EA 3 d group （P<0.05）. Conclusion In the model of LMMI induced by BPVC， the iron metabolism of local injured multifidus muscle is disordered， and it is typical in the time of acute injury. EA at "Weizhong" （BL40） can promote the repair of injured multifidus muscle， and its mechanism may be related to regulating iron metabolism of multifidus muscle and reducing tissue peroxidation injury， and significantly promote the regulation of iron metabolism disorder level after continuous EA intervention for 3 d.

〔Keywords〕 lumbar multifidus muscle injury; electroacupuncture; iron metabolism; ferritin; transferrin receptor 1; divalent metal transporter 1

“腰背委中求”是歷代醫(yī)者長(zhǎng)期治療腰背部疾患臨床經(jīng)驗(yàn)的凝縮，既符合了針灸取穴中“經(jīng)脈所過(guò)，主治所及”的原則，又體現(xiàn)了遠(yuǎn)部取穴理論的具象應(yīng)用[1]。慢性下腰痛（chronic low back pain， CLBP）是非常普遍的疼痛性肌肉骨骼疾病，是現(xiàn)在全球?qū)е職埣驳闹饕騕2-3]，在世界范圍內(nèi)造成了重大的流行病學(xué)負(fù)擔(dān)，其患病率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)[4]，并且長(zhǎng)期的病痛與治療，既降低了個(gè)人生活質(zhì)量，又給家庭、社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。臨床上電針治療腰痛由來(lái)已久且療效穩(wěn)定。腰多裂肌是腰椎旁肌的一部分，其形態(tài)、功能的正常與CLBP的發(fā)生密切相關(guān)[5]。所以，探索電針“委中”穴對(duì)損傷腰多裂肌的修復(fù)機(jī)制對(duì)臨床上治療CLBP有積極意義。鐵是機(jī)體重要的微量金屬元素，參與氧利用、酶促反應(yīng)、能量代謝等多種生理活動(dòng)，但體內(nèi)Fe2+可以通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生多種活性氧物質(zhì)，造成組織細(xì)胞氧化損傷，因此鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存、利用過(guò)程要受到嚴(yán)格的調(diào)控[6]。本課題組前期[7-10]制備了成熟的布比卡因（bupivacaine， BPVC）致腰多裂肌損傷大鼠模型，從炎癥反應(yīng)、自噬、氧化應(yīng)激、細(xì)胞微環(huán)境變化等多角度探討了電針“委中”穴促進(jìn)腰多裂肌損傷后修復(fù)的相關(guān)機(jī)制，但目前還沒(méi)有對(duì)鐵代謝調(diào)節(jié)這一層面的觀察。因此，本實(shí)驗(yàn)著眼于骨骼肌鐵代謝，設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)動(dòng)態(tài)觀察多裂肌損傷后鐵代謝相關(guān)蛋白的變化規(guī)律，探討不同電針干預(yù)時(shí)間對(duì)多裂肌損傷性腰痛治療的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量270～320 g，由北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[清潔級(jí)，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010]，在北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)校區(qū)動(dòng)物房分籠喂養(yǎng)，自由攝食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，明暗周期各12 h，環(huán)境溫度24 ℃，濕度40%～50%。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的各種處理均遵循科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的相關(guān)規(guī)定。

將動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、電針組，每組再分為1 d、2 d、3 d、5 d、7 d共5個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。

1.2? 主要儀器和試劑

韓氏電針儀（北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：HANS-200A）;華佗牌針灸針（北京中研太和醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：0.18 mm×13 mm）;半自動(dòng)化石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica，型號(hào)：RM2235）;生物顯微鏡及成像系統(tǒng)（日本OLYMPUS，型號(hào)：BX43）;酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Multiskan，型號(hào)：M2型）;Eppendorf離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf ，型號(hào)：5430R）;AriaMX 實(shí)時(shí)qPCR儀器與系統(tǒng)（美國(guó)Agilent，型號(hào)：G8830A）;電泳槽及其附件（型號(hào)：Mini-PROTEAN Tetra）、電泳儀電源（型號(hào)：PowerPac基礎(chǔ)）、全能型成像系統(tǒng)（型號(hào)：ChemiDoc MP）、T100TMPCR儀（型號(hào)：T100）均來(lái)自美國(guó)Bio-Rad公司。

布比卡因鹽酸鹽（美國(guó)Sigma，批號(hào)：80-477-DK）;10%水合氯醛（北京百諾威生物科技有限公司嗎，批號(hào)：rh32027-250g）;蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)：G1120）、組織鐵測(cè)定試劑盒（批號(hào)：A039-2-1）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：PC0020）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號(hào)：P1200）、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（批號(hào)：T1070）均來(lái)自北京Solarbio公司;高效RIPA裂解液（南京建成生物工程研究所有限公司，批號(hào)：A039-2-1）;快速轉(zhuǎn)膜液20X（批號(hào)：WB4600）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)：P10100）均來(lái)自蘇州新賽美生物科技有限公司;PVDF轉(zhuǎn)移膜（0.45 um，美國(guó)Millipore， 批號(hào)：IPVH00010）;GAPDH抗體（北京Bioss， 批號(hào)：bs-10900R）;山羊抗兔二抗（批號(hào)：ZB-2301）、山羊抗鼠二抗（批號(hào)：ZB-2305）均來(lái)自北京中杉金橋生物科技有限公司;FTH抗體（美國(guó)Affinity， 批號(hào)：DF6278）;組織細(xì)胞RNA提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司，批號(hào)：R4115）;RevertAid First Strand cDNA Synthes（批號(hào)：K1622）、SYBR Green PCR Master Mix（批號(hào)：4367659）均來(lái)自美國(guó)Thermo公司;引物（均購(gòu)自上海生工生物科技有限公司）。

1.3? 造模方法

模型的復(fù)制參照課題組前期研究，采用一次性注射BPVC建立大鼠多裂肌損傷模型[11]：除正常組外，每組以10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，剔除大鼠背部毛發(fā)，操作過(guò)程保持無(wú)菌。選擇雙側(cè)腰椎L4、L5（首先找到雙側(cè)髂棘最高點(diǎn)，定位為L(zhǎng)6棘突）水平棘突為進(jìn)針點(diǎn)，使用一次性4號(hào)針頭注射器抽取0.5% BPVC溶液，針頭緊貼棘突旁進(jìn)入肌肉，直到接觸關(guān)節(jié)突和乳突所在的骨面回抽套管1 mm無(wú)血，注射BPVC溶液400 μL（100 μL×4），單次時(shí)間不得小于3 s，以利于藥物的吸收。以HE染色結(jié)果顯示肌纖維大面積斷裂、肌間隙增大、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為模型成功標(biāo)志。

1.4? 干預(yù)方法

正常組不進(jìn)行任何處理。電針組在造模后進(jìn)行電針干預(yù)，將大鼠俯臥固定在操作臺(tái)上，暴露雙側(cè)后肢腘窩部位，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜，分別選取大鼠雙側(cè)“委中”穴（膝關(guān)節(jié)背面正中），用一次性針灸針直刺3 mm，不做任何手法，接電針儀，采用2 Hz/100 Hz的疏密波，電流強(qiáng)度1 mA，治療20 min，1次/d，直至取材。模型組在造模后與電針組同步束縛與固定，不做任何干預(yù)，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材。

1.5? 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

每組大鼠分別在電針1 d、2 d、3 d、5 d、7 d后進(jìn)行取材，用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，剔除大鼠背部毛發(fā)，操作過(guò)程保持無(wú)菌。待大鼠完全麻醉后，將其俯臥固定在解剖板上，充分暴露背部，剪開(kāi)皮膚，剝離開(kāi)筋膜、肌肉，銳性切取L4-L5水平的多裂肌。取左側(cè)多裂肌固定于4%多聚甲醛溶液中，用于觀察多裂肌形態(tài)變化，再將右側(cè)多裂肌分為3份放置于凍存管后迅速投入液氮中，之后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱凍存，用于分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.5.1? HE染色觀察多裂肌形態(tài)學(xué)變化? 左側(cè)多裂肌于4%多聚甲醛溶液固定48 h以上，常規(guī)梯度乙醇脫水后，進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為5 μm。然后將石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，再進(jìn)行蘇木素染色、自來(lái)水沖洗、分化液分化、自來(lái)水浸泡、伊紅染色、自來(lái)水沖洗浸泡，最后進(jìn)行脫水、透明、中性樹(shù)膠封固。顯微鏡下觀察切片組織形態(tài)。

1.5.2? 生化法檢測(cè)多裂肌鐵含量? 根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求配置相應(yīng)試劑。按重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，每1 mg肌肉加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件機(jī)械勻漿，2500 r/min，離心10 min（離心半徑為9.5 cm），取上清液待測(cè)。空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管先分別各加入500 μL雙蒸水、2 mg/L鐵標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液、待測(cè)樣本，再均加入1500 μL的鐵顯色劑，混勻后，沸水浴5 min，流水冷卻，3500 r/min，離心10 min（離心半徑為9.5 cm）后，取上清液300 μL于96孔板，設(shè)置酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為520 nm，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各樣本吸光度OD值。計(jì)算出樣本鐵含量，觀察造模后多裂肌組織鐵含量相對(duì)正常組的變化。

1.5.3? Western blot法檢測(cè)多裂肌FTH1蛋白的表達(dá)? 從-80 ℃冰箱中取出凍存的樣本，稱(chēng)取適量的組織，按樣本∶裂解液為1∶20的比例在EP管內(nèi)加入樣本、裂解液和鋼珠，置于快速勻漿機(jī)中碾磨5 min后，4 ℃，12 000 r/min，離心5 min（離心半徑為9.5 cm），取上清。采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)實(shí)際情況計(jì)算樣本最終上樣量，加入一定量的樣本、loading buffer、PBS緩沖液，放入95 ℃恒溫金屬浴內(nèi)變性5 min后用于上樣。制備10%分離膠和5%濃縮膠，上樣，以每塊膠濃縮膠60 V、分離膠80 V、恒壓電源進(jìn)行電泳，快速轉(zhuǎn)膜液400 mA，恒流電源進(jìn)行電轉(zhuǎn)。用TPBS配制的10%的牛奶對(duì)PVDF膜封閉2 h，用TPBS配制的5%的牛奶稀釋抗體（FTH按1∶750稀釋?zhuān)珿APDH按1﹕5000稀釋?zhuān)拱?∶2000稀釋?zhuān)?，一? ℃孵育過(guò)夜，二抗搖床室溫孵育1 h，根據(jù)說(shuō)明書(shū)將ECL試劑中A液、B液按1∶1比例混勻，滴加適量顯影液于PVDF膜上，采用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，曝光結(jié)果使用Image Lab軟件分析灰度值，并定量分析FTH1吸光度與GAPDH吸光度的比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.4? Real-time PCR法檢測(cè)多裂肌Tfr1、DMT1

mRNA的表達(dá)? 從-80 ℃冰箱取出凍存的樣本，取適量的組織，按組織細(xì)胞RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，雙柱法提取組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，按20 μL的擴(kuò)增體系，加入一定量的引物、模板、SYBR Green熒光染料進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果用2-△△Ct表示。引物由上海生工生物科技有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用“x±s”表示，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間差異用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組大鼠多裂肌組織形態(tài)學(xué)結(jié)果

通過(guò)HE染色結(jié)果可見(jiàn)，正常組大鼠肌纖維排列整齊，肌間隙大小一致，肌細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣;和正常組比較，模型組大鼠可見(jiàn)多裂肌肌纖維有斷裂、肌纖維排列不規(guī)整、肌細(xì)胞壞死、細(xì)胞間隙增寬并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明造模成功，且在第3天損傷更為嚴(yán)重，模型5 d組炎性浸潤(rùn)相對(duì)減輕;電針組和模型組比較，受損肌纖維可見(jiàn)一定程度改善，電針3 d組炎性浸潤(rùn)仍比較嚴(yán)重，電針5 d組肌纖維間隙較為均勻，炎性浸潤(rùn)相對(duì)減少。見(jiàn)圖1。

2.2? 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)多裂肌組織點(diǎn)總鐵含量比較

與同時(shí)間點(diǎn)正常組相比較，各時(shí)間點(diǎn)模型組和電針組鐵含量水平均升高（P<0.01）;與同時(shí)間點(diǎn)模型組相比較，電針1 d、3 d、5 d組鐵含量水平降低（P<0.01）電針2 d、7 d組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.3? 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)多裂肌組織FTH1蛋白表達(dá)水平比較

與同時(shí)間點(diǎn)正常組相比較，模型組大鼠多裂肌FTH1表達(dá)水平總體降低（P<0.05或P<0.01）;與同時(shí)間點(diǎn)模型相比較，電針組1、2、3、5 d FTH1表達(dá)水平有所升高（P<0.05或P<0.01），電針7 d組與模型7 d組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。模型各組比較，2 d組最低（P<0.05）;電針各組比較，2 d組最高（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.4? 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)多裂肌組織鐵代謝相關(guān)基因Tfr1 mRNA水平比較

與同時(shí)間點(diǎn)正常組相比較，模型組大鼠多裂肌Tfr1 mRNA水平總體升高（P<0.05或P<0.01）;與同時(shí)間點(diǎn)模型相比較，電針2 d、3 d、5 d、7 d組Tfr1 mRNA水平有所降低（P<0.01），電針1 d組與模型1 d組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各模型組間比較結(jié)果顯示，與模型1 d、5 d組比較，模型2 d、3 d組較高（P<0.05）;模型2 d組與模型3 d、7 d組比較，模型3 d組與模型2 d、7 d組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各電針組比較結(jié)果顯示，與電針1 d、2 d組相比較，電針3 d、5 d、7 d組較低（P<0.05）;電針1 d組與電針2 d組比較，電針3 d、5 d、7 d組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖3。

2.5? 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)多裂肌組織鐵代謝相關(guān)基因DMT1mRNA水平比較

與同時(shí)間點(diǎn)正常組相比較，模型組大鼠多裂肌DMT1 mRNA水平升高（P<0.01）;與同時(shí)間點(diǎn)模型相比較，電針1、2、3、5 d組DMT1 mRNA水平降低（P<0.05或P<0.01），電針7 d組與模型7 d組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與其它時(shí)間點(diǎn)模型組相比，模型3 d組最高（P<0.05）;各電針組比較結(jié)果顯示，電針3 d組與電針1 d、2 d、7 d組相比較表達(dá)量最高（P<0.05），與電針5 d組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖4。

3 討論

鐵作為一種人體必須的微量元素，廣泛參與細(xì)胞的生理生化過(guò)程，但是過(guò)量的鐵對(duì)機(jī)體是有害的[13]。過(guò)量Fe2+可以通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，打破細(xì)胞中的氧化平衡，導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等損傷，因此，機(jī)體內(nèi)的鐵需要受到嚴(yán)格調(diào)控以維持鐵代謝穩(wěn)態(tài)[6]，便于鐵發(fā)揮其核心的生物功能，同時(shí)防止其細(xì)胞毒性作用。研究表明，由鐵過(guò)載介導(dǎo)的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙[14]，會(huì)直接影響ATP產(chǎn)生，進(jìn)而影響骨骼肌的功能[15]。鐵代謝失衡可能破壞骨骼肌微環(huán)境，抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞（satellite cells， SCs）的增殖潛能，打破SCs的分化平衡，影響骨骼肌的再生[16-17]。所以，鐵代謝與骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程中的氧化應(yīng)激、肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)，并且課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針“委中”穴對(duì)多裂肌損傷早期有較好的修復(fù)作用[18]，因此，本實(shí)驗(yàn)基于腰多裂肌損傷大鼠模型，設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀察鐵代謝變化與多裂肌損傷后時(shí)間的相關(guān)性，探討在不同時(shí)間電針干預(yù)條件下，電針“委中”穴促進(jìn)損傷多裂肌修復(fù)的可能機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果顯示造模后多裂肌肌纖維損傷嚴(yán)重，說(shuō)明造模成功，電針干預(yù)后緩解了多裂肌的損傷，促進(jìn)了修復(fù)進(jìn)程。

骨骼肌是體內(nèi)鐵的主要儲(chǔ)存庫(kù)，其含量占非血液成分的60%[19]。鐵是構(gòu)成血紅素必不可少的成分，參與了細(xì)胞的增殖和分化，通過(guò)催化氧化-還原反應(yīng)，參與電子傳遞、細(xì)胞呼吸、能量代謝等機(jī)體許多重要的生理過(guò)程，同時(shí)它也能調(diào)節(jié)與細(xì)胞生長(zhǎng)和功能有關(guān)的基因表達(dá)[20]。因此，鐵在肌細(xì)胞分化、肌纖維生長(zhǎng)以及維持骨骼肌正常生理功能方面必不可少。研究表明，骨骼肌再生的鐵是循環(huán)的[21]。而當(dāng)骨骼肌內(nèi)游離的鐵增多，又會(huì)誘導(dǎo)發(fā)生氧化應(yīng)激，抑制骨骼肌再生[22]或者導(dǎo)致骨骼肌萎縮[23]。研究發(fā)現(xiàn)，在鐵過(guò)載的小鼠中，骨骼肌表現(xiàn)出氧化應(yīng)激增加和肌衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)減少的現(xiàn)象，并在肌肉損傷后，還表現(xiàn)出肌肉再生延遲、再生肌纖維減少、成肌細(xì)胞分化標(biāo)志物表達(dá)減少[22]。所以骨骼肌鐵代謝的調(diào)節(jié)異常，尤其是不穩(wěn)定的鐵積累，可能會(huì)抑制骨骼肌的再生[21]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠多裂肌組織鐵含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)模型組和電針組鐵含量總體比正常組鐵含量高，表明損傷后局部組織總鐵含量升高。鐵主要以離子的形式存在于機(jī)體內(nèi)，F(xiàn)e2+超標(biāo)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量具有代謝毒性的ROS，進(jìn)而氧化細(xì)胞膜脂質(zhì)等導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24]。鐵蛋白是機(jī)體內(nèi)鐵儲(chǔ)藏蛋白，主要在釋放和儲(chǔ)存上對(duì)鐵代謝進(jìn)行調(diào)控，也可以清除亞鐵離子介導(dǎo)的自由基反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化性損傷[25]。鐵蛋白由鐵蛋白輕鏈（ferritin light chain， FTL）和鐵蛋白重鏈（ferritin heavy chain， FTH1）兩個(gè)亞基構(gòu)成，其中FTH1可將Fe2+氧化成Fe3+[26-27]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多裂肌損傷后FTH1表達(dá)水平總體上是降低的，且通過(guò)對(duì)比不同時(shí)間點(diǎn)變化趨勢(shì)發(fā)現(xiàn)，模型2 d組FTH1水平與正常組和其它各時(shí)間點(diǎn)模型組相比最少，說(shuō)明在多裂肌損傷后，鐵蛋白結(jié)構(gòu)破壞，釋放Fe2+，在2 d后FTH1表達(dá)水平開(kāi)始升高。電針治療后，F(xiàn)TH1表達(dá)水平總體上高于模型組，說(shuō)明電針是促進(jìn)FTH1的表達(dá)的，通過(guò)促進(jìn)FTH1的表達(dá)來(lái)抵御多裂肌損傷后過(guò)量Fe2+造成的氧化損傷，促進(jìn)損傷多裂肌修復(fù)，且對(duì)干預(yù)的不同時(shí)間點(diǎn)比較發(fā)現(xiàn)，電針2 d后FTH1表達(dá)升至最高，說(shuō)明在持續(xù)干預(yù)2 d后，在時(shí)間上加速了鐵蛋白大量表達(dá)，從而抵抗Fe2+對(duì)肌細(xì)胞的傷害性作用。而在干預(yù)7 d后，電針組與模型組無(wú)明顯差異，可能與機(jī)體的自我修復(fù)能力有關(guān)。

鐵在細(xì)胞內(nèi)的濃度需要受到嚴(yán)格調(diào)控。Tfr1可轉(zhuǎn)運(yùn)Fe3+進(jìn)入細(xì)胞，在DMT1作用下將Fe3+轉(zhuǎn)為Fe2+，多余的鐵儲(chǔ)存在鐵蛋白中[28-29]。DMT1在完成細(xì)胞鐵攝取的全過(guò)程中不可缺少[30]。細(xì)胞一方面可以通過(guò)釋放鐵蛋白儲(chǔ)存的鐵，另一方面可以通過(guò)增加轉(zhuǎn)鐵蛋白從胞外攝取鐵來(lái)滿(mǎn)足細(xì)胞對(duì)鐵的需求[15]。研究表明，肌衛(wèi)星細(xì)胞中Tfr1的特異性缺失會(huì)抑制骨骼肌再生，并會(huì)誘導(dǎo)氧化損傷[17]，成人Tfr1的缺失會(huì)導(dǎo)致骨骼肌萎縮和功能障礙[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多裂肌損傷后，Tfr1 mRNA水平升高，并且不同時(shí)間點(diǎn)比較顯示Tfr1 mRNA損傷后2～3 d表達(dá)量相比較于其它時(shí)間點(diǎn)更高。在電針治療后，電針1 d組與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組無(wú)顯著差異，隨著治療周期的繼續(xù)，電針組Tfr1 mRNA表達(dá)量相對(duì)模型組有所降低，不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tfr1 mRNA表達(dá)水平在電針治療3 d后顯著降低，并且隨著治療時(shí)間的增加，電針組Tfr1 mRNA的表達(dá)均維持在較低水平。與此同時(shí)，造模后DMT1 mRNA的表達(dá)水平升高，并且在第3天表達(dá)量升至最高，在3 d后表達(dá)趨勢(shì)逐漸降低，電針干預(yù)治療后，不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，DMT1 mRNA也是在第3天的表達(dá)水平最高，但是總體上電針干預(yù)會(huì)降低DMT1 mRNA表達(dá)水平，在干預(yù)7 d后，電針組與模型組無(wú)明顯差異，可能與機(jī)體的自我恢復(fù)水平有關(guān)。上述結(jié)果提示在多裂肌損傷后，Tfr1、DMT1水平升高，攝取過(guò)多的Fe2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且在損傷后2～3 d這種鐵代謝紊亂情況更為明顯，電針治療后通過(guò)抑制Tfr1、DMT1的表達(dá)，減少骨骼肌游離的Fe2+，減輕過(guò)度氧化造成的損傷，從而促進(jìn)骨骼肌再生，并發(fā)現(xiàn)在電針持續(xù)干預(yù)3 d后，顯著促進(jìn)多裂肌損傷后鐵代謝紊亂情況的改善。

綜上所述，在BPVC引起的腰多裂肌損傷模型中，多裂肌總鐵含量升高，F(xiàn)TH1表達(dá)降低，Tfr1、DMT1表達(dá)升高，初步提示多裂肌局部鐵代謝失穩(wěn)，并且，通過(guò)對(duì)鐵代謝和多裂肌損傷時(shí)間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，鐵代謝的紊亂在急性損傷期比較典型。在電針治療一段時(shí)間后，F(xiàn)TH1表達(dá)相對(duì)升高，Tfr1、DMT1表達(dá)相對(duì)降低，并且電針治療3 d后顯著促進(jìn)鐵代謝紊亂的調(diào)節(jié)，說(shuō)明電針“委中”穴可以促進(jìn)大鼠受損腰多裂肌修復(fù)，其機(jī)制可能與電針干預(yù)調(diào)節(jié)了鐵代謝的平衡、減輕組織過(guò)氧化損傷有關(guān)，為電針“委中”穴治療腰痛提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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