UPLC-QqQ-MS法測定福建靈芝中靈芝烯酸D的含量及其在產(chǎn)地追溯中的應用

張基榮,蔣昆霞,許 文*,林 羽,徐 偉,吳長輝

(1. 福建中醫(yī)藥大學藥學院,福建 福州 350122; 2. 福建中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新與中心,福建 福州 350122; 3. 福建仙芝樓科技有限公司,福建 南平 350002)

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.) Karst或紫芝GanodermasinenceZhao, Xu et Zhang的干燥子實體,性甘,平,具有治療心神不寧,失眠心悸等功效[1]。靈芝含有多類成分,三萜酸類為其主要有效成分之一,現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),靈芝中的三萜酸類成分具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、抗菌[5]等作用。福建靈芝作為全國靈芝的主產(chǎn)區(qū)之一,具有悠久的藥用、食用歷史,是福建地區(qū)重要的道地藥材之一,福建靈芝以武夷山脈的南平為主要種植基地,2021年福建省靈芝種植總面積超2000公頃,產(chǎn)品遠銷全國各地[6]。

中藥材的追溯,目前國家出臺了系列的文件工作,產(chǎn)地的追溯與道地藥材的道地性以及優(yōu)質優(yōu)價相關[7],建立中藥產(chǎn)品從種質種源、種植生產(chǎn)、采收加工、倉儲運輸、市場銷售的全過程質量追溯是目前保障藥材質量的重要方法[8]。2012年國家就頒布《關于開展中藥材流通追溯體系建設試點的通知》,2015年,國務院發(fā)布的《關于加快推進重要產(chǎn)品追溯體系建設的意見》[9];2019、2020年國家科技部國家重點研發(fā)專項將中藥材質量追溯要求列入研究指南;2021年,福建省食品藥品監(jiān)督管理局《福建省規(guī)范中藥材產(chǎn)地趁鮮加工工作指導意見(試行)》將福建靈芝納入中藥材質量追溯體系建設;2022年,福建省藥監(jiān)局發(fā)布《關于推進中藥飲片信息化追溯體系建設工作的通知》,力求中藥飲片全過程質量追溯[10]。因此,構建福建靈芝藥材的質量追溯方法對于高品質靈芝藥材的全鏈條質量追溯具有重要意義。然而,目前針對福建靈芝同其他地區(qū)靈芝的質量溯源研究比較較少,課題組汪麗娜采用高效液相指紋圖譜方法結合PCA、OPLS-DA等化學計量學開展對福建靈芝的檢測,并對比了福建靈芝同其他地區(qū)靈芝中藥指紋圖譜差異性[11],發(fā)現(xiàn)靈芝烯酸D是差異性成分,課題組進一步采用薄層色譜法分析發(fā)現(xiàn)福建靈芝及其他產(chǎn)地的靈芝的差異性鑒別成分為靈芝烯酸D,即靈芝烯酸D薄層斑點在福建靈芝中顯色明顯,但是從含量上能否用于產(chǎn)地的追溯尚未見研究。

目前針對靈芝烯酸D的測定方法主要包括高效液相色譜(HPLC)法[12,13]和HPLC-MS質譜法[14-16],但是現(xiàn)有的文獻的研究均鮮有涉及福建靈芝的樣品,相關建立的方法在前期用于福建靈芝時存在著靈敏度低、色譜峰分離度不佳、分析時間較長等問題。隨著現(xiàn)代分析技術的快速發(fā)展,UPLC-QqQ-MS法在中藥含量測定分析方面應用廣泛,具有分析靈敏、快速的特點[17]。因此,本文采用UPLC-QqQ-MS法,優(yōu)化色譜條件和質譜條件,構建福建靈芝中靈芝烯酸D成分的含量測定方法,并比較福建靈芝與吉林、浙江、安徽三個不同產(chǎn)區(qū)赤芝靈芝烯酸D的含量差異,為福建靈芝質量溯源提供一種新的技術手段。

1 材料

1.1 藥材

靈芝藥材收集于福建(批號:S1～S4)、吉林(批號:S5～S8)、浙江(批號:S9～S12)、安徽(批號:S13～S16)地區(qū),16批靈芝藥材標本經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院藥用植物學實驗室范世明正高級實驗師鑒定為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.) Karst的干燥子實體。

1.2 試劑

對照品靈芝烯酸D,實驗室自制,純度大于98%;地塞米松作為內(nèi)標,批號:100318-2019014購于中國食品藥品檢定研究院,甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司);Milli-Q超純水(美國Millipore公司);其余試劑均為分析純。

圖1 靈芝烯酸D和內(nèi)標(地塞米松)的化學結構圖

1.3 儀器和試劑

ACQUITY UPLC I-Class串聯(lián)Xevo-TQS型超高效(UPLC)液相-三重四級桿(QQQ)質譜(美國Waters公司);EX225DZH/AD型十萬分之一精密自動分析天平(美國OHAUS公司);KQ-500DE型臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);M100型萊茲研磨儀(德國萊茲公司),默克merck公司質譜級水。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

色譜條件:采用Waters UPLC CORTECS C18色譜柱(4.6 mm×100 mm, 1.6 μm)色譜柱,以有機相乙腈(A)-水相0.1%甲酸水溶液(B)為流動相,進行梯度洗脫(0～9.5 min, 25%A; 9.5～11.5 min, 25%～31%A; 11.5～16.5 min, 31%A; 16.5～19 min, 31%～43%A),流速0.25 mL/min,柱溫40℃,進樣量2 μL。

質譜條件:ESI多反應監(jiān)測(MRM)模式,毛細管電壓2.5 KV,錐孔電壓3.00 V,脫溶劑氣流N2800 L·h-1,脫溶劑溫度500℃,錐孔氣流N250 L·h-1,離子源溫度150℃,Extractor 3.00 V,碰撞氣體氬氣。靈芝烯酸D、內(nèi)標物的MS參數(shù)見表1?？瞻兹軇㈧`芝烯酸D、地塞米松(IS)與靈芝樣品MRM離子流圖,見圖2。

表1 靈芝烯酸D質譜參數(shù)

圖2 空白溶劑(A)、對照品(B)與S1批次福建靈芝樣品(C)的離子流色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液及內(nèi)標溶液的制備

對照品溶液的制備:精密稱取靈芝烯酸D的對照品適量用甲醇溶解制備成濃度分別為1.31mg/mL的對照品母液,精密移取靈芝烯酸D對照品母液,加50%甲醇制成靈芝烯酸D濃度為131 μg/mL的對照品儲備液。

內(nèi)標溶液的制備:精密稱取內(nèi)標物地塞米松適量,加入適量甲醇制備成1.71 mg/mL對照品儲備液,精密量取地塞米松對照品用50%甲醇稀釋,得到質量濃度為855 ng/mL的內(nèi)標溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取靈芝樣品粗粉約1.0 g置具塞瓶中,精密移入50 mL的95%乙醇后進行提取具塞瓶稱重,后超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)45 min,放冷之后提取具塞瓶再次稱重,用提取的95%乙醇溶劑進行減失揮發(fā)重量的補足,搖勻,16900 r/min離心10 min,0.22 μm微膜濾孔濾過得到續(xù)濾液中按1∶1(200∶200 μL)加入內(nèi)標溶液后進行測定。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量,用50%甲醇逐級稀釋,加入地塞米松內(nèi)標液,即得用于繪制線性曲線的不同濃度靈芝烯酸D對照液,按上述優(yōu)化的超高效液相色譜以及三重四級桿質譜條件下檢測,積分靈芝烯酸D的峰面積和內(nèi)標地塞米松的峰面積。以靈芝烯酸D與內(nèi)標峰面積比值(Y)對靈芝烯酸D的濃度(X)進行標準曲線的回歸方程計算和線性相關系數(shù)r的計算,并以信噪比S/N≥10為定量限(LOQ),S/N≥3為檢測限(LOD),結果得到靈芝烯酸D的回歸方程為Y=0.0121X+0.0015(r=0.999 4),線性范圍6.55～6550ng/mL,LOQ與LOD分別為6.55、1.97 ng/mL,表明在考察的濃度范圍內(nèi),線性關系良好,符合定量分析要求。

2.3.2 精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液,按照上述優(yōu)化的超高效液相色譜以及三重四級桿質譜條件下檢測6次,測得靈芝烯酸D與內(nèi)標峰面積比值RSD為2.7%,表明儀器日內(nèi)精密度RSD符合液相-質譜檢測要求;連續(xù)3 d重復進樣(n=3)測定,靈芝烯酸D與內(nèi)標峰面積比值RSD為1.8%,表明儀器日間精密度RSD符合液相-質譜檢測要求。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取已經(jīng)制備的S1批次的靈芝供試品溶液,分別于0、1、2、4、8、16、24 h按“2.1”項下色譜和質譜條件進樣分析,測得不同時間段靈芝烯酸D與內(nèi)標峰面積比值RSD為1.6%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復性試驗

精密稱取同一批次(S1)福建靈芝藥材樣品6份,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,即取同批次樣品約1.0 g置具塞瓶中,依法加入95%乙醇,制備樣品溶液,并按照上述優(yōu)化的超高效液相色譜以及三重四級桿質譜條件下檢測,6份福建靈芝藥材樣品的靈芝烯酸D含量的RSD值為2.5%,結果表明,所建立的實驗方法重復性試驗符合液相-質譜聯(lián)用分析要求。

2.3.5 加樣回收率試驗

精密稱取“2.3.4”項下已測得含量的福建靈芝藥材(S1)6份,約0.5 g,往6份平行樣中精密加入0.0917 mg(近似1∶1)的靈芝烯酸D,按“2.2.2”項方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜和質譜條件進樣分析,測定加標后測定量,并根據(jù)回收率公式計算靈芝烯酸D的回收率,見表2,靈芝烯酸D平均回收率為101.01%,RSD為2.6%,表明其回收率良好。

表2 靈芝烯酸D回收率測定結果

2.3.6 樣品含量測定

取不同批次的赤芝樣品約1.0 g置具塞瓶中,依法加入95%乙醇,分別制備各個產(chǎn)地靈芝檢測樣品溶液,并按照上述優(yōu)化的超高效液相色譜以及三重四級桿質譜條件下檢測,測定靈芝烯酸D的含量,結果見表3,福建、吉林、浙江、安徽四個產(chǎn)地靈芝烯酸D的含量對比見圖3。

表3 各批次赤芝中靈芝烯酸D的含量(mg/g, n=3)

圖3 福建、吉林、浙江、安徽四個產(chǎn)地靈芝烯酸D的含量對比

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

靈芝三萜酸是其獨特生源途徑下產(chǎn)生的主要藥效物質成分,在進行色譜條件考察時,本實驗考察了不同流動相體系包括考察了有機相色譜乙腈和色譜甲醇體系的對比,包括水相采用超純水、0.1%甲酸水等比較,發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸水體系色譜峰峰型號較佳,響應較好,故確定為本實驗的流動相體系。進一步進行靈芝烯酸D色譜條件優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在靈芝烯酸D離子通道上存在4個同分異構體的色譜峰,并且質譜測試發(fā)現(xiàn)其在質譜條件上母離子和子離子相同,因此為使靈芝烯酸D能準確定量,必須對四個同分異構體進行拆分,確保四個異構體均能分別達到分離度1.5以上的良好分離,本實驗優(yōu)化了流動相的組成和梯度流動相洗脫的比例,進一步對乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)的比例進行優(yōu)化,最終經(jīng)過優(yōu)化的0～9.5 min, 25%A; 9.5～11.5 min, 25%～31%A; 11.5～16.5 min, 31%A; 16.5～19 min, 31%～43%A條件下靈芝烯酸D能與另外3個同分異構體達到基線分離(分離度>1.5),符合定量分析要求。同時也提示福建靈芝中三萜類成分比較復雜,采用液相色譜測定時,往往難以達到基線要求。

3.2 質譜條件的優(yōu)化

為了提高質譜檢測的靈敏度,首先本文對比了正離子模式和負離子模式,發(fā)現(xiàn)正離子模式下靈芝烯酸D的響應優(yōu)于負離子模式;進一步的實驗對靈芝烯酸D的質譜多反應監(jiān)測模式(MRM)進行優(yōu)化考察,靈芝中的三萜酸化合物靈芝烯酸D與典型的靈芝酸A相比,主要區(qū)別在于側鏈的20,22位形成雙鍵,是一類弱極性化合物,在四環(huán)骨架中3、7、11和15位被羥基或羰基取代,易發(fā)生脫水(18 Da)、脫羧(44 Da)等裂解方式。在正離子模式下,靈芝烯酸D母離子為513.28,經(jīng)過四級桿進行碰撞,其質譜裂解可以產(chǎn)生多個子離子如493.30 [M-H-H2O]-,467.28 [M-H-CO2]-,449.27 [M-H-H2O-CO2]-,437.23 [M-H-2CH3-CO2]-,其中子離子493.30 [M-H-H2O]-在質譜模式識別上表現(xiàn)豐度最高,經(jīng)過碎片離子掃描模式(daughter scan)檢測發(fā)現(xiàn),子離子493.30 [M-H-H2O]-對比上述其他子離子,其峰面積也最大,因此將該離子493.30 [M-H-H2O]-作為定量子離子。本研究也進一步優(yōu)化了錐孔電壓Cone和碰撞能量CE,即采用不同的錐孔電壓及碰撞能量對特定的定量離子對(513.3→495.3)進行考察,最終確定了本文使用的質譜條件。

3.3 含量測定結果分析

通過UPLC-QqQ-MS法測定不同產(chǎn)區(qū)中靈芝烯酸D的含量,其中福建靈芝的靈芝烯酸D的含量范圍為0.1653～0.2013 mg/g,吉林赤芝的靈芝烯酸D的含量范圍為0.0172～0.0839 mg/g,浙江赤芝的靈芝烯酸D的含量范圍為0.0201～0.0608 mg/g,安徽赤芝的靈芝烯酸D的含量范圍為0.0127～0.0389 mg/g。福建、吉林、浙江、安徽四個產(chǎn)地的含量均值分別為0.1801±0.0158、0.0444±0.031、0.0374±0.0176、0.0216±0.0117,經(jīng)Student-t檢驗,福建靈芝的芝靈芝烯酸D含量顯著高于其他3個產(chǎn)區(qū),P值均小于0.001,從測定結果可以看出以靈芝烯酸D含量為0.1mg/g為限度,可以有效區(qū)分福建和其他不同產(chǎn)地靈芝,提示靈芝靈芝烯酸D的含量可作為福建靈芝質量溯源的重要成分。

綜上所述,本研究通過UPLC-QqQ-MS法測定福建靈芝靈芝烯酸D的含量,方法簡便、快速,可為福建靈芝的質量溯源提供可靠的實驗依據(jù)。