一種H9 亞型禽流感病毒的臨床鑒定方法

張蒙蒙，姬星宇

（商丘美蘭生物工程有限公司，河南商丘 476000）

禽流感（Avian Influenza，AI）是由正黏病毒科、A 型流感病毒引起的一種禽類疾病綜合征。分為高致病性和低致病性2 種， 該病毒是分節(jié)段的負(fù)鏈單股RNA 病毒，在其傳代過程中極易發(fā)生基因突變、基因重組等，尤其是在免疫壓力等因素的作用下。 其中低致病性禽流感常導(dǎo)致家禽的呼吸道癥狀，生長發(fā)育受阻及產(chǎn)蛋下降，常引起大腸桿菌等合并感染，且H9 亞型是當(dāng)前流行的主型，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。 臨床毒株的分離鑒定及生物學(xué)特性研究， 為現(xiàn)有及在研疫苗研究提供基礎(chǔ)材料和依據(jù)。

2022 年1 月， 河南省某雞場發(fā)生疑似低致病性禽流感疫情，從病料中分離到1 株疑似H9亞型禽流感病毒毒株， 對分離到的病毒進(jìn)行了鑒定。 現(xiàn)將該毒株的分離和鑒定總結(jié)如下。

1 材料

1.1 樣品

河南省某雞場病雞， 由商丘美蘭生物工程有限公司實(shí)驗(yàn)人員采集病料， 帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離和鑒定。

1.2 陽性血清

H9 亞 型、H7 亞 型、H5 亞 型、NDV 及EDS陽性血清，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 禽流感（H9 亞型）PCR 鑒定材料

1.3.1 主要試劑：RNA 病毒基因組提取試劑盒、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司、針對禽流感H9 亞型HA 基因設(shè)計如下引物：

上 游 引 物：5’-CTYCACACAGARCCAARGRRATG -3’； 下 游 引 物 ：5’ -GTCACACTTGTTGTTGTRTC-3’； 2×Taq PCR mix、超純水、瓊脂糖、TAE 等。

1.3.2 主要儀器：PCR 儀、恒溫水浴鍋、水平電泳儀、凝膠成像儀等。

1.4 SPF 雞胚和雞

均來源于北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.5 試驗(yàn)設(shè)施

所有實(shí)驗(yàn)操作均在生物安全柜中進(jìn)行，所有SPF 雞飼養(yǎng)在商丘美蘭生物實(shí)驗(yàn)動物房隔離器內(nèi)。

2 方法

2.1 病毒分離

取病死雞肝臟、肺、氣管及氣管干酪樣物質(zhì)等樣品，按照1∶2 的比例加入無菌PBS 液，加入雙抗，組織被研磨后，反復(fù)凍融3 次，10000 轉(zhuǎn)/分鐘離心8 分鐘后取上清， 經(jīng)0.45 微米微孔濾器過濾， 按0.2 毫升/胚的劑量經(jīng)尿囊腔途徑接種10 日齡SPF 雞胚。 置36℃～37℃恒溫恒濕箱內(nèi)培養(yǎng)。 每日照蛋，棄去24 小時內(nèi)死亡的雞胚。取培養(yǎng)48～72 小時的死亡以及存活的所有雞胚，每胚取樣測定紅細(xì)胞凝集價。

2.2 病毒含量測定

將收集的雞胚尿囊液用無菌PBS 作10 倍系列稀釋，取10-7、10-8、10-93 個稀釋度，分別經(jīng)尿囊腔內(nèi)接種10 日齡SPF 雞胚5 枚，0.1 毫升/胚，置36℃～37℃培養(yǎng)，24 小時以內(nèi)死亡的雞胚棄去不計，24～120 小時內(nèi)死亡的雞胚隨時取出，收獲雞胚尿囊液，同一稀釋度的胚液等量混合，按稀釋度分別測定紅細(xì)胞凝集價，至120 小時，取出所有活胚，逐枚收獲尿囊液，分別測定紅細(xì)胞凝集價，凝集價不低于1∶16 判為感染，按照Reed-Muench 法計算EID50。

2.3 病毒鑒定

2.3.1 血凝試驗(yàn)法鑒定 取收獲的雞胚尿囊液分別與NDV、H9 亞型、H7 亞型、H5 亞型及EDS 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和，再作紅細(xì)胞血凝試驗(yàn)，根據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)行判定。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

2.3.2.1 基因組RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄

禽流感病毒RNA 的提取， 參照TIANGEN DP315 RNA 提取試劑盒進(jìn)行。

反轉(zhuǎn)錄： 先加入提取的RNA 模板、Oligo（dT）18Primer 和Water，nuclease-free，65℃反 應(yīng)5 分鐘； 然后放置在冰上， 再加入5×Reaction Buffer、Ribolock RNase Inhibitor （20U/微 升）、10mM dNTP mix 和 RevertAid M -Mμlv RT（200U/微升），總體系共20 微升，42℃反應(yīng)60 分鐘，然后70℃反應(yīng)5 分鐘終止，得到禽流感H9亞型病毒液基因組cDNA。 PCR 反應(yīng)程序：95℃5 分鐘；94℃1 分鐘，55℃45 秒，72℃2 分鐘；30個循環(huán)，72℃10 分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

3 結(jié)果

3.1 病毒分離結(jié)果

病死雞樣品接種雞胚后24 小時內(nèi)無雞胚死亡，且無細(xì)菌污染；收獲的尿囊液能夠凝集雞紅細(xì)胞，HA 平均效價為1∶256。

3.2 血凝試驗(yàn)鑒定結(jié)果

該病毒與雞新城疫陽性血清、H5 亞型禽流感陽性血清、H7 亞型禽流感陽性血清和減蛋綜合征陽性血清中和后，HA 效價均為1∶128，證明分離株均不能被上述4 種陽性血清中和；與H9亞型陽性血清中和后HA 效價0， 無血凝效價，證明分離樣品能夠被H9 亞型陽性血清中和中和。 綜合上述試驗(yàn)結(jié)果， 初步證明該分離株為H9 亞型禽流感病毒。

3.3 RT-PCR 鑒定結(jié)果

經(jīng)RT-PCR 鑒定得到針對HA 基因產(chǎn)物為496bp，這與實(shí)驗(yàn)設(shè)計的目的片段大小一致。 結(jié)果見圖1。

圖1 PCR 電泳結(jié)果

3.4 病毒含量（EID50）的測定

將H9 亞型禽流感病毒用無菌PBS 作10 倍系列稀釋，10-7、10-8、10-93 個稀釋度， 各經(jīng)尿囊腔接種10～11 日齡SPF 雞胚5 枚， 每胚0.1 毫升，置36℃～37℃繼續(xù)孵育，接種24 小時內(nèi)死亡的雞胚棄去不計，在24～120 小時內(nèi)死亡的雞胚隨時取出，至120 小時，取出所有活胚，逐枚收獲雞胚液，每胚分別測定紅細(xì)胞凝集價，紅細(xì)胞凝集價不低于1∶16 者判為感染， 按Reed 和Muench 方法計算EID50。 計算結(jié)果，該毒株病毒含量為108.83EID50/0.1 毫升。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)室分離的疑似H9 亞型禽流感毒株具有血凝性特性，HA 效價為1∶256， 病毒含量為108.83EID50/0.1 毫升；經(jīng)血凝試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，該毒株能夠被禽流感H9 亞型陽性血清完全中和，確定該毒株為H9 亞型禽流感病毒。