邯鄲某雞場(chǎng)禽源空腸彎曲菌的分離鑒定與耐藥性情況

李晶晶，劉彥威，劉建釵

（河北工程大學(xué)，河北邯鄲 056000）

隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展， 禽類疾病的種類越發(fā)復(fù)雜，且不同疾病的癥狀與病變的相似之處越來(lái)越多， 臨床上準(zhǔn)確診斷出疾病愈發(fā)困難，傳統(tǒng)的診斷方法不能準(zhǔn)確診斷出疾病，所以怎樣對(duì)病雞做出最準(zhǔn)確的診斷就顯得尤為重要，而細(xì)菌的分離鑒定就能做到準(zhǔn)確診斷疾病。

細(xì)菌性的疾病， 雖然有與之相符的抗生素對(duì)其進(jìn)行抑制，但是現(xiàn)在存在著很多問(wèn)題。 現(xiàn)在面臨的問(wèn)題是很多的細(xì)菌已經(jīng)對(duì)一些常用的抗生素產(chǎn)生耐藥性，并且這種耐藥性還可以通過(guò)這種菌上的耐藥基因進(jìn)行一代代的傳遞，這會(huì)對(duì)疾病的治療產(chǎn)生很大的影響，使此類疾病的病程延長(zhǎng)，治療成本加大，產(chǎn)生更大的損失。并且細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性會(huì)使大多數(shù)常用的抗生素對(duì)此病菌效果不顯著甚至無(wú)效，所以細(xì)菌分離鑒定后的藥敏試驗(yàn)可以有效地指導(dǎo)臨床用藥，讓疾病得到最為高效的治療。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株（大腸桿菌25922、空腸彎曲菌NCTC11168） 為河北工程大學(xué)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)研究所保存。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 改良CCD瓊脂培養(yǎng)基、Cary-Blair 氏運(yùn)送培養(yǎng)基、 改良CCD 瓊脂添加劑、 布氏肉湯、Bolton 肉湯、脫纖維羊血、MH（A）培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品； 微需氧厭氧袋，日本三菱公司；TAE 緩沖液，康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；載玻片，秦皇島市東風(fēng)醫(yī)用玻璃廠產(chǎn)品； 草酸銨結(jié)晶紫染液產(chǎn)品、 革蘭氏碘液、90%乙醇、番紅染液，常德比克曼生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖，西班牙Agarose 產(chǎn)品；甘油，天津歐博凱化工有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 藥敏試紙 藥敏紙片，上海源葉

1.1.4 主要儀器 摩爾基因超純水器， 德國(guó)Millipore 公司； 立式自動(dòng)電壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司； 電子顯微鏡， 日本Olympus 公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；數(shù)控恒溫水浴鍋，常州易晨?jī)x器制造有限公司；臺(tái)式高速旋轉(zhuǎn)離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公 司 ；Bio-Rad 凝膠成像分析系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；2.5升密封培養(yǎng)罐，日本三菱公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 空腸彎曲菌的分離 接種環(huán)沾取少量泄殖腔拭子， 在改良mCCDA 培養(yǎng)基劃線分離，并將培養(yǎng)板放入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋或培養(yǎng)罐中，放入微需氧產(chǎn)氣袋密封， 42℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48 小時(shí)后看結(jié)果。 對(duì)疑似菌落，呈扁平狀或透明水滴樣再進(jìn)行增菌劃線培養(yǎng)。

1.2.2 空腸彎曲菌的鑒定 對(duì)有明顯空腸彎曲菌的菌落形態(tài)，進(jìn)行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察，并采用水煮法提取DNA，通過(guò)空腸彎曲菌hipO 基因鑒定。 引物序列見表1。

表1 引物序列基因

PCR 反應(yīng)體系為25 微升：2×Taq PCR Master Mix 12.5 微升，hipO 基因上下游引物各1 微升，DNA 模板2 微升，ddH2O 補(bǔ)齊25 微升。

PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5℃5 分鐘；95℃30 秒，60℃30 秒，72℃1 分鐘，72℃，7 分鐘。 PCR 產(chǎn)物在1%的瓊脂糖電泳， 凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，并采集圖像。

1.2.3 空腸彎曲菌K - B 紙片法藥敏試驗(yàn)

對(duì)采樣分離所得的禽空腸彎曲菌分離株，運(yùn)用K-B 紙片法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)， 根據(jù)對(duì)公共衛(wèi)生的影響和臨床重要性，選擇使用氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、林可酰胺類六類6 種抗生素藥敏紙片進(jìn)行藥敏驗(yàn)證。將貼好藥敏片的平板倒置與厭氧袋一起放于厭氧罐中，42℃厭氧培養(yǎng)48 小時(shí)后，測(cè)量抑菌圈直徑， 并以大腸桿菌25922 作為質(zhì)控株，根據(jù)CLSI 發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)判斷樣本菌株對(duì)各藥物敏感（S）或耐藥（R）。

藥敏片詳細(xì)信息參考表2

表2 藥敏片及判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 空腸彎曲菌分離與鑒定

空腸彎曲菌在mCCDA 培養(yǎng)基上呈灰色、濕潤(rùn)、凸起光滑的水滴樣菌落，非常小，比大腸桿菌小一些(如圖1)；革蘭氏染色，呈弧形、S 型彎曲狀(如圖2)； 經(jīng)過(guò)擴(kuò)增特異性hipO 基因后，1×瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物片段，大小基本相同，條帶一致，并處在預(yù)期序列大小范圍內(nèi)（目標(biāo)片段735bp）（見圖3）。 結(jié)果顯示，從邯鄲某養(yǎng)雞場(chǎng)采集的150 份雞泄殖腔拭子， 共分離出14 株空腸彎曲菌分離菌。

圖1 菌落形態(tài)鑒定

圖2 革蘭氏染色

圖3 分離株普通PCR 鑒定

2.2 空腸彎曲菌分離株的耐藥情況

KB 紙片法檢測(cè)結(jié)果表明，14 株分離菌對(duì)六種抗生素耐藥情況最高的是紅霉素， 其次是環(huán)丙沙星（見圖4）。

圖4 耐藥情況

3 討論

空腸彎曲菌廣泛存在于多種畜禽、 野鳥等動(dòng)物腸道內(nèi)。 本試驗(yàn)主要是從蛋雞禽泄殖腔拭子分離培養(yǎng)空腸彎曲菌，培養(yǎng)過(guò)程中，需要的條件比較苛刻，需要較低含量的氧氣，不像大腸桿菌在正?？諝庵?7℃就能長(zhǎng)的很好， 空腸彎曲菌長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中也會(huì)導(dǎo)致其死亡，本身培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基成本也比較高，在這種情況下，如何快速劃線培養(yǎng)及鑒定就成為了成功分離空腸彎曲菌的關(guān)鍵，從流行病學(xué)來(lái)說(shuō)具有深遠(yuǎn)的價(jià)值意義。

彎曲菌對(duì)大多數(shù)抗生素敏感， 彎曲菌種類的分化可能有助于選擇適當(dāng)?shù)目股刂委煛?尤其像空腸彎曲菌對(duì)氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類表現(xiàn)出不同程度的耐藥，耐藥趨勢(shì)的發(fā)展已經(jīng)引起世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。 人類臨床上最常用的治療藥物是大環(huán)內(nèi)酯類如紅霉素和氟喹諾酮類如環(huán)丙沙星，從本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果也能得到紅霉素有明顯耐藥情況。

4 小結(jié)

檢測(cè)空腸彎曲菌的方法很多，各有利弊，建立一個(gè)更快速簡(jiǎn)便、更穩(wěn)定可靠、更高效準(zhǔn)確、更低成本的檢測(cè)技術(shù)是保證公共衛(wèi)生和食品安全的迫切需求。 可以預(yù)見，多種檢測(cè)技術(shù)的有機(jī)結(jié)合和優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)有望解決上述需求。