安徽省三個(gè)‘黃山白茶’特異品種（系）的分子指紋圖譜構(gòu)建

華冰清，管鵬鵬，桂利權(quán)，沈周高，張愛嘉，陶玲玲，朱俊彥，韋朝領(lǐng)，劉升銳*

安徽省三個(gè)‘黃山白茶’特異品種（系）的分子指紋圖譜構(gòu)建

華冰清1，管鵬鵬1，桂利權(quán)2，沈周高1，張愛嘉1，陶玲玲1，朱俊彥1，韋朝領(lǐng)1，劉升銳1*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與茶葉加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036；2.謝裕大茶葉股份有限公司，安徽合肥 230036)

本研究篩選了6個(gè)多態(tài)性高且穩(wěn)定性好的SSR標(biāo)記作為一個(gè)核心標(biāo)記組，對(duì)‘黃山白茶’三個(gè)特異茶樹品種（系）及其余43份茶樹品種（系）進(jìn)行基因分型，根據(jù)擴(kuò)增條帶的大小構(gòu)建了三個(gè)‘黃山白茶’特異品種（系）的分子指紋圖譜。結(jié)果表明，6個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增條帶清晰，不同樣品間具有較好的多態(tài)性，共擴(kuò)增出等位基因數(shù)26個(gè)，平均為4.33；主效等位基因頻率為0.283～0.370，均值為0.335；觀測(cè)雜合度和期望雜合度均值分別為0.571和0.613；多態(tài)性信息含量為0.700～0.786，平均為0.740。根據(jù)等位基因片段大小分別構(gòu)建了‘黃山白茶1號(hào)’品種、‘黃山白茶2號(hào)’品系和‘黃山白茶3號(hào)’品系的分子指紋圖譜，為‘黃山白茶’種質(zhì)資源鑒定、品種保護(hù)和推廣利用提供重要理論依據(jù)。

黃山白茶；SSR標(biāo)記；遺傳多態(tài)性；分子指紋

我國(guó)茶樹種質(zhì)資源豐富多樣，其中新梢葉色白化茶樹品種是重要的特異資源，因其對(duì)氣候因子敏感程度不同，可分為溫度敏感型和光照敏感型[1]?！S山白茶’（‘Huangshan Baicha’）原產(chǎn)于安徽省歙縣境內(nèi)的新安江支流，因產(chǎn)地居古徽州府所轄，故又名‘徽州白茶’[2]，屬于溫度敏感型白化茶樹變種[3]，其春茶芽葉呈玉白色，隨著春季氣溫升高和芽葉變大，由葉片主脈、支脈、葉肉細(xì)胞依次返綠，葉色逐漸變成黃白色、黃綠色、淺綠色，夏秋茶則為綠色[3,4]。其制成的干茶色澤略顯金黃、沖泡湯色明亮、香高持久、滋味鮮爽，游離氨基酸含量較高，且富含人體所需的硒、鐵、鋅等多種微量元素，兼具飲用與觀賞價(jià)值，備受廣大消費(fèi)者青睞[4-6]。目前，通過短穗扦插繁育的無性系‘黃山白茶1號(hào)’品種（安徽省省級(jí)良種）、‘黃山白茶2號(hào)’品系和‘黃山白茶3號(hào)’品系已推廣種植。現(xiàn)今，全國(guó)各地已選育出大量不同類型的白化茶樹品種，僅通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定難以區(qū)分，且對(duì)于溫度敏感型白化茶樹品種夏秋季返綠后與其它品種更加難以區(qū)分，為茶樹資源保護(hù)和品種鑒別帶來了一定的困難和挑戰(zhàn)[7]。

分子標(biāo)記技術(shù)是從DNA水平上對(duì)物種的遺傳特性進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、不受環(huán)境影響。SSR（Simple Sequence Repeat）分子標(biāo)記具有共顯性、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、且基因組分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)，是茶樹遺傳研究中最常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一[8,9]。目前，SSR分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于構(gòu)建茶樹品種分子指紋。如章志芳和馬建強(qiáng)利用10個(gè)EST-SSR標(biāo)記對(duì)14個(gè)茶樹新品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并構(gòu)建了各自特異的DNA分子指紋圖譜[10]；Tan等從30個(gè)標(biāo)記中篩選了8個(gè)標(biāo)記作為核心標(biāo)記組，并構(gòu)建了128份茶樹品種的分子指紋圖譜[11]；Liu等從36個(gè)SSR標(biāo)記中篩選了5個(gè)多態(tài)性高且穩(wěn)定性好的SSR標(biāo)記作為核心標(biāo)記組，并構(gòu)建了80個(gè)茶樹品種（品系）的分子指紋圖譜[12]；阮旭等利用篩選的50對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)安徽省各個(gè)茶區(qū)共68份茶樹品系進(jìn)行遺傳多樣性分析，并選出8對(duì)核心標(biāo)記組構(gòu)建了其各自特異的分子指紋圖譜[13]；Guo等選用了6個(gè)SSR標(biāo)記作為核心標(biāo)記組，構(gòu)建了126份廣西茶樹種質(zhì)資源的分子指紋圖譜[14]。

本研究以課題組先前開發(fā)的SSR標(biāo)記為基礎(chǔ)，進(jìn)一步篩選了6個(gè)多態(tài)性高且穩(wěn)定性好的SSR標(biāo)記，將其作為核心標(biāo)記組，對(duì)46份茶樹品種（系）進(jìn)行了快速的基因分型，構(gòu)建了‘黃山白茶1號(hào)’‘黃山白茶2號(hào)’和‘黃山白茶3號(hào)’品種（系）特有的分子指紋圖譜。研究結(jié)果為‘黃山白茶’特異茶樹種質(zhì)資源的鑒定、保護(hù)和利用提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

三個(gè)‘黃山白茶’品種（系）及其余43份茶樹品種（系）均來源于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)皖中試驗(yàn)站的茶樹生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的茶樹種質(zhì)資源圃（31°25′N，117°09′E），取嫩葉后用干冰速凍，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。樣品名稱及產(chǎn)地來源詳見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè)

選用EZgene TMCPPlant Miniprep Kit (Biomiga, USA)試劑盒提取茶樹樣品基因組DNA。利用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度和純度，所有樣品稀釋至30～50 ng·μL-1用于PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

首先對(duì)所有患牙進(jìn)行完善的根管治療后，再行牙周基礎(chǔ)治療，包括齦上潔治、齦下刮治及根面平整術(shù)等，必要時(shí)進(jìn)行調(diào)。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳檢測(cè)

根據(jù)先前的研究，選取了6個(gè)多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的SSR標(biāo)記作為核心標(biāo)記組，并對(duì)46份供試茶樹品種（系）進(jìn)行擴(kuò)增以構(gòu)建‘黃山白茶’特異的分子指紋圖譜。利用毛細(xì)管電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物結(jié)果可知，6個(gè)標(biāo)記對(duì)46份茶樹品種（系）擴(kuò)增條帶清晰、片段大小在設(shè)計(jì)片段區(qū)間內(nèi)、且均顯示出較好的多態(tài)性（可參見圖1）。

根據(jù)條帶峰圖進(jìn)行人工方法讀帶，建立原始數(shù)據(jù)矩陣，并根據(jù)軟件要求轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)格式。利用POPGENE V1.32軟件計(jì)算等位基因數(shù)（, number of alleles）和主效等位基因頻率（, major allele frequency）。利用PowerMarker 3.25軟件計(jì)算引物的觀測(cè)雜合度（, Observed heterozygosity）、期望雜合度（, Expected heterozygosity）和多態(tài)性信息含量（PIC, polymorphism information content）。

表1 選取的46份茶樹品種（系）信息

表2 六個(gè)標(biāo)記的引物信息

表3 六個(gè)標(biāo)記對(duì)46份茶樹品種擴(kuò)增多態(tài)性分析

圖1 六個(gè)標(biāo)記對(duì)46份茶樣擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳圖

圖2 三個(gè)‘黃山白茶’品種（系）的分子指紋圖譜

田間初見玉米銹病病葉時(shí)，用20%三唑酮乳油900mL/hm2，或12.5%烯唑醇 (禾果利)450～600g/hm2對(duì)水噴霧防治，視病情酌情補(bǔ)治。玉米螟蟲穗率達(dá)10%或花絲有蟲50頭/百穗時(shí)，先剪去穗頂花絲，再用4.5%高效氯氰菊酯乳油750～900mL/hm2對(duì)水噴玉米穗頂。

PCR反應(yīng)體系、PCR擴(kuò)增程序、毛細(xì)管電泳檢測(cè)及條帶分析參考相關(guān)文獻(xiàn)[8,12]。

1.2.4數(shù)據(jù)整理與分析

“一帶一路”項(xiàng)目建設(shè)中，金融發(fā)揮著十分重要的作用，金融不僅能夠?qū)崿F(xiàn)資源配置的優(yōu)化，還可發(fā)揮杠桿作用，合理調(diào)節(jié)市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)，在短期內(nèi)快速聚集資金，為相關(guān)行業(yè)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。但是，我國(guó)金融支持與合作還面臨著很多的風(fēng)險(xiǎn)，這些均會(huì)影響金融支持與合作，使得金融行業(yè)內(nèi)的不穩(wěn)定因素增加，為“一帶一路”項(xiàng)目建設(shè)金融支持與合作帶來較大的風(fēng)險(xiǎn)與挑戰(zhàn)。

從本課題組先前開發(fā)的SSR標(biāo)記中選取6對(duì)SSR引物[8]，序列由上海通用生物有限公司合成，引物序列及退火溫度詳見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛細(xì)管電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物

1.2.2引物選擇與合成

2.2 標(biāo)記多態(tài)性分析

對(duì)檢測(cè)的6個(gè)標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性分析（可參見表3）。結(jié)果顯示，共檢測(cè)到26個(gè)等位位點(diǎn)數(shù)，平均為4.33個(gè)；主效等位基因頻率值在0.283（CsL68）至0.370（CsL76）之間，平均為0.335；觀測(cè)雜合度從最低的0.143（CsL60）至最高的1.000（CsL67），平均為0.571；期望雜合度在0.143（CsL60）至0.813（CsL67和CsL68）之間，平均值為0.613；多態(tài)性信息含量（PIC）在0.700（CsL76）至0.786（CsL73）之間，平均為0.740。PIC值是衡量位點(diǎn)多態(tài)性的最重要的指標(biāo)，當(dāng)PIC>0.5時(shí)為高度多態(tài)位點(diǎn)，當(dāng)0.25

2.3 ‘黃山白茶’品種（系）分子指紋圖譜構(gòu)建

毛細(xì)管電泳檢測(cè)可以清晰的顯示每個(gè)樣品擴(kuò)增條帶的大小。為了更加直觀地呈現(xiàn)結(jié)果，6個(gè)標(biāo)記CsL56、CsL60 CsL67、CsL68、CsL73和CsL76分別用A、B、C、D、E和F替代。通過標(biāo)記結(jié)合擴(kuò)增條帶大小的方式，編碼每個(gè)品種（系）的指紋圖譜。此外，分子指紋代碼結(jié)合品種（系）名稱、種質(zhì)類型、亞種分類、選育地區(qū)等信息，構(gòu)建每個(gè)品種（系）的特異分子指紋圖譜，詳見圖2。

建立參數(shù)化模型，關(guān)鍵是能明確表達(dá)模型結(jié)構(gòu)的參數(shù)變量以及它們之間的關(guān)系。壓鉚連接結(jié)構(gòu)參數(shù)變量如表1所示，壓鉚連接模型的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

從區(qū)域分布上看，內(nèi)蒙古地區(qū)“草原絲綢之路”可分為西部段和東部段兩部分。西部段以呼和浩特、烏蘭察布、包頭、鄂爾多斯為重要支點(diǎn)，向西經(jīng)寧夏、青海與新疆絲綢之路相連；東部段由呼倫貝爾、通遼、赤峰等重要節(jié)點(diǎn)城市為依托，連接著俄羅斯、蒙古國(guó)，是通往歐洲絲綢之路的重要通道。

3 討論與結(jié)論

分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于茶樹進(jìn)化起源研究、遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定、基因定位、分子指紋圖譜構(gòu)建等方面，具有重要作用[7,8]?；贒NA分子標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜，可以快速、準(zhǔn)確的對(duì)植物新品種（系）及雜交后代等進(jìn)行真?zhèn)舞b定，并且具有很強(qiáng)的個(gè)體特異性[10,11]。分子指紋可以進(jìn)行品種真實(shí)性的鑒別從而保護(hù)品種權(quán)所有者的合法權(quán)益，也可以鑒定已知種質(zhì)與新種質(zhì)資源的區(qū)別，便于育種工作者進(jìn)行遺傳研究[13,15]。

本研究篩選了6個(gè)多態(tài)性高且穩(wěn)定性好的SSR標(biāo)記作為一個(gè)核心標(biāo)記組，利用高通量、高分辨率的毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行鑒定，分析了6個(gè)標(biāo)記的遺傳多態(tài)性。結(jié)果表明，標(biāo)記平均等位基因數(shù)、平均主效等位基因數(shù)和平均多態(tài)性信息含量分別為4.33、0.335和0.740，總體上各指標(biāo)均較高。標(biāo)記多態(tài)性的核心指標(biāo)PIC值顯著高于先前的研究結(jié)果[9,16]，但與另外幾個(gè)研究結(jié)果值差別不大[11,13,14]，主要是由于這些指標(biāo)受多種因素的影響，如SSR標(biāo)記數(shù)目、SSR標(biāo)記的重復(fù)基序次數(shù)和類型、樣本數(shù)量和遺傳背景差異大小、電泳檢測(cè)方法等[8,12]。此外，利用篩選的核心標(biāo)記組成功構(gòu)建了三個(gè)‘黃山白茶’特異品種（系）的分子指紋圖譜，為‘黃山白茶’特異種質(zhì)資源鑒定、品種保護(hù)和推廣利用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

[1] 劉丁丁,梅菊芬,王君雅,等.茶樹白化突變研究進(jìn)展[J].中國(guó)茶葉,2020,42(04):24-35.

[2] 畢軍生.徽州白茶保護(hù)與開發(fā)[J].茶業(yè)通報(bào),2003,25(03):109.

[3] 周漢琛,劉亞芹,雷攀登.不同白化期的‘黃山白茶’代謝物差異分析[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào),2022,30 (02):187-194.

[4] 沈周高,江穩(wěn)華,方世輝.安徽歙縣黃山白茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對(duì)策思考[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29(26):36-40.

[5] 沈周高,周月琴,李葉云,等.黃山白茶短穗扦插快繁技術(shù)研究[J].茶業(yè)通報(bào),2013,35(02):75-78.

[6] 王龍平.宣城市白化、黃化品種茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及建議[J].茶業(yè)通報(bào),2021,43(04):163-165.

[7] 陳杰丹,馬春雷,陳亮.我國(guó)茶樹種質(zhì)資源研究40年[J].中國(guó)茶葉,2019,41(06):1-5+46.

[8] LIU S R, AN Y L, LI F D, et al. Genome-wide identification of simple sequence repeats and development of polymorphic SSR markers for genetic studies in tea plant ()[J]. Molecular Breeding, 2018, 38: 59.

[9] 劉升銳,董心雨,郭銳,等.安徽省“太平猴魁”茶區(qū)柿大茶群體種遺傳多樣性的SSR分析[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2020,47(04):499-504.

[10] 章志芳,馬建強(qiáng).基于SSR標(biāo)記的茶樹新品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,19:1-4.

[11] TAN L Q, PENG M, XU L Y, et al. Fingerprinting 128 Chinese clonal tea cultivars using SSR markers provides new insights into their pedigree relationships[J]. Tree Genetics & Genomes, 2015, 11: 90.

[12] LIU S R, LIU H W, WU A L, et al. Construction of fingerprinting for tea plant () accessions using new genomic SSR markers[J]. Molecular Breeding, 2017,37: 93.

[13] 阮旭,徐奕鼎,吳瓊,等.安徽省各茶區(qū)茶樹品系遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J].分子植物育種,2020,18(14):4692-4701.

[14] GUO R, XIA X B, CHEN J, et al. Genetic relationship analysis and molecular fingerprint identification of the tea germplasms from Guangxi Province,China[J]. Breeding Science, 2021, 71: 584-593.

[15] 張成才,劉園,姜燕華,等.SSR標(biāo)記鑒定浙江省主要無性系茶樹品種的研究[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2014,15(05):926-931.

[16] 王松琳,馬春雷,黃丹娟,等.基于SSR標(biāo)記的白化和黃化茶樹品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J].茶葉科學(xué),2018,38(01):58-68.

S571.1

A

1006-5768（2022）04-174-05

2022-08-05

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（XJDC2020015）和安徽省科技重大專項(xiàng)（202003a06020021）

華冰清（1992—），女，浙江省金華市人，茶學(xué)本科生，研究方向?yàn)椴铇溆N學(xué)，E-mail：1106805461@qq.com。

劉升銳（1985—），男，安徽省滁州市人，副教授，研究方向?yàn)椴铇溥z傳與育種研究，E-mail：liushengrui@ahau.edu.cn。

投稿平臺(tái)：https://cytb.cbpt.cnki.net

（責(zé)任編輯：徐千懿）