GeneXpert 和LPA 兩種方法檢測(cè)在診斷耐藥結(jié)核病中的價(jià)值

陳麗玲 鄧蓮 陳麗娟

（福建省龍巖市龍巖人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 龍巖 364000）

耐藥結(jié)核病是指機(jī)體對(duì)藥物的敏感性下降，導(dǎo)致藥物對(duì)肺結(jié)核治療療效降低，且隨著耐藥種類的增加，療效越差[1]。有研究顯示[2]，結(jié)核病主要經(jīng)呼吸系統(tǒng)傳播，是全球十大死亡原因之一的疾病，由于疾病治療時(shí)間長(zhǎng)，患者難以遵循用藥原則，因此極易產(chǎn)生耐藥性而加重病情，導(dǎo)致療效降低。及早診斷，并針對(duì)病情采取合適的治療方案是提高療效的關(guān)鍵。BACTEC MGIT 960 液體培養(yǎng)是現(xiàn)階段診斷該疾病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但液體培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，難以防控疾病，從而影響疾病得到及時(shí)有效的控制，探尋快速、有效的檢測(cè)方式對(duì)疾病的控制起著重要作用[3]。實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（GeneXpert）主要以實(shí)時(shí)熒光PCR 為原理，該檢測(cè)方式在準(zhǔn)備樣品及核酸的提取環(huán)節(jié)完全實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，檢測(cè)時(shí)間短，能快速得出檢測(cè)結(jié)果；線性探針檢測(cè)技術(shù)（LPA）在6~8 h 內(nèi)可完成檢測(cè)，與GeneXpert 均具有快速檢測(cè)的特點(diǎn)[4]。由于兩種檢測(cè)方式均在臨床興起，且難以判斷兩者檢測(cè)效能，基于此，本研究探討GeneXpert 和LPA兩種方法在診斷耐藥結(jié)核病中的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 將 2021 年3 月至 2022 年 3 月醫(yī)院收治的286 例疑似耐藥肺結(jié)核患者納入研究。所有患者進(jìn)行GeneXpert 檢測(cè)、LPA 檢測(cè)，并進(jìn)行BACTEC MGIT 960 液體培養(yǎng)，以液體培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)。其中男175 例，女111 例；年齡17~70 歲，平均年齡（44.25±12.30）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）18~24 kg/m2，平均（20.36±1.55）kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；心、肝、腎等功能正常；患者及家屬對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：已經(jīng)確診的耐藥性肺結(jié)核；伴有肺部惡性腫瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn) [臨床項(xiàng)目審批件（2022）倫理第（56）號(hào)]

1.2 檢測(cè)方法 所有患者進(jìn)行GeneXpert 檢測(cè)、LPA 檢測(cè)，并進(jìn)行BACTEC MGIT 960 液體培養(yǎng)，以液體培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)。GeneXpert 檢測(cè)：嚴(yán)格根據(jù)檢驗(yàn)規(guī)程操作，采集痰標(biāo)本，確保在采集痰標(biāo)本時(shí)選擇膿性及黏稠部分，將痰標(biāo)本先后放置于2%N-乙酰 -L-半胱氨酸（NALC）-氫氧化鈉（NaOH）及無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行離心處理，隨后將痰標(biāo)本及處理液按照1:2 比例進(jìn)行配置，采用漩渦振蕩10 s，并在室溫下靜置15 min，待痰液充分液化后取2 ml加入GeneXpert 核酸擴(kuò)增儀內(nèi)[賽沛（上海）商貿(mào)有限公司生產(chǎn)，型號(hào)Infinity-80]進(jìn)行全自動(dòng)檢測(cè)，約2 h 出結(jié)果報(bào)告。LPA 檢測(cè)：根據(jù)結(jié)核分枝桿菌及耐藥基因檢測(cè)試劑盒（國(guó)械注進(jìn)20153402307）說(shuō)明書操作。采用0.5 g NALC、50 ml NaOH 及50 ml 枸櫞酸鈉配制處理液，2 ml 標(biāo)本在生物安全柜內(nèi)轉(zhuǎn)移到50 ml 離心管中并進(jìn)行標(biāo)記。根據(jù)標(biāo)本性狀，將1~2 倍體積前處理液在柜內(nèi)向前處理管中加入，并將蓋子旋緊，渦旋震蕩30 s，待樣本充分液化，離心管在室溫下靜置15 min。在柜內(nèi)打開(kāi)旋蓋，加入45 ml 磷酸緩沖鹽溶液（PBS），隨后蓋緊螺旋蓋。配平離心管并放入離心桶中，離心20 min 后棄去上層清液，加入2 ml 緩沖液并混勻，將其放置于2 個(gè)1.5 ml 離心管中并進(jìn)行標(biāo)記。確定擴(kuò)增體系數(shù)量，除DNA 樣本外，應(yīng)制備所有擴(kuò)增試劑混合物。將混合物進(jìn)行混勻后瞬時(shí)離心，將45 μl 混合物貼壁加入PCR 管中，避免出現(xiàn)氣泡。隨后對(duì)處理液進(jìn)行離心（12 000 r/min，5 min）處理，隨后根據(jù)PCR 儀設(shè)置好參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。液體培養(yǎng)：采用藥敏板（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）嚴(yán)格按照說(shuō)明書以最低抑菌濃度法進(jìn)行操作，利福平臨界濃度:1.0 μg／ml；耐藥標(biāo)準(zhǔn)：菌株MIc值＞臨界濃度為耐藥，MIc 值≤臨界濃度為敏感。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察GeneXpert 檢測(cè)、LPA 檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果和檢驗(yàn)效能，檢驗(yàn)效能包括準(zhǔn)確度、靈敏度、誤診率、特異度、陰性預(yù)測(cè)值與陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 軟件處理分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 286 例肺結(jié)核患者經(jīng)液體培養(yǎng)確定耐藥性肺結(jié)核（陽(yáng)性）279 例，不耐藥性肺結(jié)核（陰性）7 例；經(jīng) GeneXpert 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性 275 例，陰性11 例；經(jīng)LPA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性273 例，陰性13 例。見(jiàn)表1。

表1 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比（例）

2.2 檢驗(yàn)效能對(duì)比 GeneXpert 檢測(cè)準(zhǔn)確度（95.80%）、誤診率（4.20%）、特異度（42.86%）、靈敏度（97.13%）、陰性預(yù)測(cè)值（27.27%）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（98.55%）與LPA 檢測(cè)準(zhǔn)確度（93.71%）、誤診率（6.29%）、特異度（14.29%）、靈敏度（95.70%）、陰性預(yù)測(cè)值（7.69%）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（97.80%）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 檢驗(yàn)效能對(duì)比（%）

3 討論

耐藥性結(jié)核病可分為單耐藥結(jié)核病和多耐藥結(jié)核病，出現(xiàn)的耐藥種類越多療效越差。有研究指出[6]，耐藥結(jié)核病因?qū)λ幬锏牟幻舾行远鴮?dǎo)致治療效果差，且全球?qū)Y(jié)核病控制所面臨的日益突出問(wèn)題即是耐藥結(jié)核病的流行，對(duì)于該疾病的治療，需要明確其耐藥性以制定針對(duì)性治療措施，而及時(shí)做出診斷便是治療前的關(guān)鍵步驟[7]。近年來(lái)，臨床已經(jīng)將液體培養(yǎng)作為臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)，主要是將獲取的標(biāo)本接種于液體培養(yǎng)基中，使微生物均勻地在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖的一種培養(yǎng)方法，但此項(xiàng)技術(shù)培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，而結(jié)核病病情發(fā)展較快，即便后續(xù)得以診斷，也有可能會(huì)耽誤治療[8]。GeneXpert 結(jié)合了定量PCR分子遺傳檢測(cè)所需的三個(gè)步驟，即準(zhǔn)備樣品、擴(kuò)增及檢測(cè)，能快速報(bào)告樣本中是否存在結(jié)核分枝桿菌及其是否利福平耐藥的特點(diǎn)；LPA 旨在對(duì)基因突變予以檢測(cè)以判斷結(jié)核桿菌是否對(duì)利福平等抗結(jié)核藥產(chǎn)生耐藥性，且檢測(cè)時(shí)間較液體培養(yǎng)時(shí)間短，具有快速診斷的特征[9]，但GeneXpert 與LPA 的診斷效果并未明確，因此本研究探討對(duì)比上述兩種檢測(cè)技術(shù)效果，以選擇更有效的檢測(cè)方式為臨床提供更可靠的依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)GeneXpert 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性275 例，陰性11 例，準(zhǔn)確度為95.80%、誤診率為4.20%、特異度為42.86%、靈敏度為97.13%、陰性預(yù)測(cè)值為27.27%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.55%；經(jīng)LPA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性273 例，陰性13 例，準(zhǔn)確度為93.71%、誤診率為6.29%、特異度為14.29%、靈敏度為95.70%、陰性預(yù)測(cè)值為7.69%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為97.80%。兩種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度、誤診率、特異度、靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明GeneXpert 和LPA 兩種方法檢測(cè)在診斷耐藥結(jié)核病中效果相當(dāng)，后續(xù)檢測(cè)可根據(jù)實(shí)際情況選擇，但由于兩者均存在誤診風(fēng)險(xiǎn)，因此還需引入其他檢測(cè)方式，為實(shí)驗(yàn)室提供更精準(zhǔn)的依據(jù)。這可能是因?yàn)闄z測(cè)方法的不同，其使用前對(duì)標(biāo)本的處理方式也不同，且在檢測(cè)過(guò)程中并不能保證痰樣本性狀黏稠度相統(tǒng)一，不能平均分配（特別針對(duì)一些低陽(yáng)性級(jí)別痰液樣本）；同時(shí)，還可能是因?yàn)闄z測(cè)方法的不同，其檢出限度也不相同，這也會(huì)對(duì)檢測(cè)效能產(chǎn)生影響。與液體培養(yǎng)技術(shù)相比較，GeneXpert 主要在封閉反應(yīng)盒內(nèi)自動(dòng)進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)，該技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、易操作，同時(shí)具有不易污染等特點(diǎn)，且該技術(shù)是基于巢式PCR 技術(shù)的基因擴(kuò)增技術(shù)，在針對(duì)基因利福平核心區(qū)間以設(shè)計(jì)引物及探針，可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)是否發(fā)生突變。劉春平等[10]學(xué)者研究指出，由于液體培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)陽(yáng)性培養(yǎng)時(shí)間需要11~22 d，而Genexpert 從開(kāi)始檢測(cè)到得出報(bào)告時(shí)間只需要2.5 h，相較于液體培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)能有效縮短檢測(cè)時(shí)間。GeneXpert 主要采用半定量熒光定量PCR 技術(shù)原理，在理論上可獲取高效的檢測(cè)敏感度。方木通等[7]學(xué)者表示，該技術(shù)主要利用巢式PCR 為檢測(cè)基礎(chǔ)，是一種集成、全自動(dòng)的擴(kuò)增平臺(tái)，且檢測(cè)過(guò)程在封閉環(huán)境中進(jìn)行，將樣本制備、核酸擴(kuò)增及檢測(cè)集成一體，短時(shí)間（2 h）內(nèi)完成核酸的擴(kuò)增及耐藥性的確認(rèn)，便于及時(shí)對(duì)患者病情進(jìn)行處理?，F(xiàn)有研究表明[11]，rpo B 基因及異常突變是造成利福平耐藥的根本原因。其突變的位置發(fā)生在507~533 位，由27 個(gè)氨基酸組成的區(qū)域中。若rpo B 基因編碼區(qū)出現(xiàn)點(diǎn)突變、缺失、插入等，則會(huì)導(dǎo)致該基因與利福平的親和力降低，從而產(chǎn)生利福平耐藥。然而，LPA 旨在對(duì)比基因突變情況進(jìn)行耐藥性的判斷，其根本機(jī)制在于對(duì)樣本予以DNA擴(kuò)增-雜交反應(yīng)以檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因位點(diǎn)突變狀態(tài)，從而判斷結(jié)核分枝桿菌耐藥性，該技術(shù)具有檢測(cè)簡(jiǎn)便及快速等優(yōu)點(diǎn)，因此后期可根據(jù)臨床實(shí)際情況選擇。由于Genexpert 及LPA 均存在PCR 檢測(cè)步驟，因此兩者對(duì)耐藥性結(jié)核病的診斷效能差異不大。綜上所述，GeneXpert 和LPA 在診斷耐藥結(jié)核病中效果相當(dāng)，后續(xù)檢測(cè)可根據(jù)實(shí)際情況選擇，但由于兩者均存在誤診風(fēng)險(xiǎn)，因此還需引入其他檢測(cè)方式，為實(shí)驗(yàn)室提供更精準(zhǔn)的依據(jù)。