人參皂苷Rg3對(duì)食管癌放療患者體外免疫增強(qiáng)作用的探討

何昕

（江西省人民醫(yī)院腫瘤科 南昌 330006）

食管癌在全球發(fā)病率和死亡率普遍較高，而我國(guó)又是食管癌大國(guó)，放療作為食管癌的主要治療手段，治療的同時(shí)也會(huì)引起機(jī)體免疫功能下降，從而加快腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。單獨(dú)采用放療手段常無(wú)法得到滿意結(jié)果，因此，亟需尋找一種更佳的綜合治療方法，來(lái)提高患者放療后的免疫功能。人參對(duì)人體具有整體調(diào)節(jié)作用，一方面可以減輕放療引起的毒副反應(yīng)，另一方面可以增強(qiáng)患者的免疫功能，降低癌癥復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。人參為補(bǔ)氣藥，主治氣、血、津液不足，被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤輔助治療中。藥理研究證明，人參皂苷具有調(diào)節(jié)免疫作用[1~3]。有研究證實(shí)其能提高放療后鼻咽癌等其他腫瘤患者細(xì)胞免疫功能[4]，展現(xiàn)出良好的開(kāi)發(fā)前景。為進(jìn)一步證實(shí)人參皂苷Rg3可以改善食管癌放療患者的免疫功能，本研究擬在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中探討人參皂苷Rg3對(duì)食管癌放療患者免疫功能的改善及其相關(guān)機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年10月至2020年10月確診食管癌并在醫(yī)院接受調(diào)強(qiáng)放療的患者30例，其中男19例（63.3%），女11例（36.7%）；年齡46~71歲，平均年齡（52.9±6.3）歲；鱗癌29例，腺癌1例；Ⅰ期1例，Ⅱ期7例，Ⅲ期14例，Ⅳ期8例。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)病理診斷確診的食管癌；KPS評(píng)分≥70分；心、肝、腎功能正常；于醫(yī)院接受調(diào)強(qiáng)放療。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 既往接受過(guò)放療者；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；放療期間使用過(guò)人參制劑者；伴隨免疫性疾病者。

1.4 研究方法

1.4.1 分離、純化食管癌患者的淋巴細(xì)胞 分離：采集10 ml空腹靜脈血，抗凝處理后加入10 ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS）混勻，再將10 ml細(xì)胞分離液緩慢加入，然后離心18 min（800 rpm），用移液器移出管內(nèi)的一層白色絮狀條帶液（即淋巴細(xì)胞）至EP管中。純化：先加RPMI1640培養(yǎng)液10 ml，混勻后離心15 min（800 rpm），去上清，重復(fù)3次，再用RPMI1640（含10%FBS）液重懸浮細(xì)胞，37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。

1.4.2 MTT比色法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖 將所得淋巴細(xì)胞洗滌3次，離心15 min（800 rpm），棄上清，用RPMI1640[含10%胎牛血清（FBS）]液將細(xì)胞濃度稀釋為2×106cells/ml后平鋪至96孔板，每孔200 μl，恒溫箱培養(yǎng)24 h。分為對(duì)照組及Rg3組，Rg3組分別加入不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L），對(duì)照組分別加入相同濃度的二甲基亞砜（DMSO）（1、10、100 mg/L），平行6份，其中3份加入刺激物絲裂原刀豆蛋白A（ConA）5 μg/ml，另外3份加入脂多糖（LPS）5 μg/ml。然后再用恒溫箱37℃培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束后，在每個(gè)板孔內(nèi)加入50 μl的MTT液，恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h，離心15 min（800 rpm）后舍棄上清，每孔加入150 μl DMSO，然后計(jì)算OD 570 nm值。

1.4.3 流式細(xì)胞儀測(cè)淋巴細(xì)胞亞群PBS液洗滌淋巴細(xì)胞3次，離心10 min（800 rpm），棄上清，加RPMI1640（含10% FBS）液將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106cells/ml，平鋪至24孔板，每孔1 ml，恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h。Rg3組分別加入不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L），對(duì)照組分別加入對(duì)應(yīng)濃度的DMSO（1、10、100 mg/L），平行3份。培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)72 h，取100 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl CD4+、CD8+檢測(cè)試劑混勻，室溫下避光孵育20 min，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+，計(jì)算CD4+/CD8+。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附法 （ELISA）進(jìn)行抗體的測(cè)定操作同上，將淋巴細(xì)胞的濃度調(diào)整為5×106個(gè)/ml，鋪板，恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h。Rg3組加入不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L），對(duì)照組加入等體積的PBS溶液，平行3份。培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)72 h，采用ELISA法測(cè)定IgM和IgG抗體的水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同絲裂原下Rg3對(duì)食管癌放療患者淋巴細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）處理接受放療的食管癌患者外周血淋巴細(xì)胞后，可促進(jìn)由ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），人參皂苷濃度越高，淋巴細(xì)胞的增殖程度越大；不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）可以促進(jìn)由LPS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著人參皂苷濃度增高，淋巴細(xì)胞的增殖程度越大。見(jiàn)表1。

表1 不同絲裂原下Rg3對(duì)食管癌放療患者淋巴細(xì)胞增殖的影響（）

表1 不同絲裂原下Rg3對(duì)食管癌放療患者淋巴細(xì)胞增殖的影響（）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

LPS（5 μg/ml）1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L對(duì)照組Rg3組組別 n ConA（5 μg/ml）1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L 30 30 0.11±0.10 6.16±1.76*0.12±0.08 15.98±2.33*0.11±0.09 49.63±3.45*0.11±0.12 2.55±0.54*0.11±0.08 3.98±0.33*0.12±0.09 4.63±0.85*

2.2 Rg3對(duì)食管癌放療患者T細(xì)胞亞群的影響不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）處理接受放療的食管癌患者外周血淋巴細(xì)胞后，使得T細(xì)胞CD4+亞群的比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且隨著人參皂苷濃度的增加，其細(xì)胞亞群的比例越高；而經(jīng)不同濃度人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）處理后，外周血中T細(xì)胞CD8+亞群的比例下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著人參皂苷濃度的增加，其細(xì)胞亞群的比例越低。見(jiàn)表2。不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）處理接受放療的食管癌患者外周血淋巴細(xì)胞后，使得T細(xì)胞CD4+亞群的比例升高，CD8+亞群的比例下降，從而導(dǎo)致CD4+/CD8+比值升高（P＜0.05），且隨著人參皂苷濃度的增加，其比值升高越明顯。見(jiàn)表3。

表2 人參皂苷Rg3對(duì)食管癌放療患者外周血CD4+及CD8+的影響（%，）

表2 人參皂苷Rg3對(duì)食管癌放療患者外周血CD4+及CD8+的影響（%，）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

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表3 人參皂苷Rg3對(duì)食管癌放療患者外周血CD4+/CD8+的影響（）

表3 人參皂苷Rg3對(duì)食管癌放療患者外周血CD4+/CD8+的影響（）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別 n 1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L對(duì)照組Rg3組30 30 0.74±0.10 0.94±0.06*0.72±0.08 1.32±0.13*0.73±0.09 1.97±0.45*

2.3 Rg3對(duì)食管癌放療患者外周血IgG和IgM抗體水平的影響 不同濃度的人參皂苷Rg3（1、10、100 mg/L）處理接受放療的食管癌患者外周血淋巴細(xì)胞后，使得B細(xì)胞活化分泌免疫球蛋白IgG和IgM，人參皂苷組IgG和IgM水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），且隨著人參皂苷濃度的增加，抗體的水平越高。見(jiàn)表4。

表4 Rg3對(duì)食管癌放療患者外周血淋巴細(xì)胞IgG及IgM抗體水平的影響（mg/ml，）

表4 Rg3對(duì)食管癌放療患者外周血淋巴細(xì)胞IgG及IgM抗體水平的影響（mg/ml，）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

0.56±0.13 5.73±0.61*IgM 1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L對(duì)照組Rg3組組別 n IgG 1 mg/L 10 mg/L 100 mg/L 30 30 0.95±0.21 1.16±0.16*0.97±0.25 1.51±0.13*0.96±0.19 1.73±0.21*0.55±0.11 2.26±0.17*0.55±0.15 3.51±0.23*

3 討論

由于不良的飲食習(xí)慣及環(huán)境污染，我國(guó)食管癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，危害人民的身體健康。大部分食管癌患者在療程中需要使用放療，放療是腫瘤治療的常用且重要的治療手段，在有效治療同時(shí)亦會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫抑制[5]。眾所周知，細(xì)胞免疫相關(guān)的淋巴細(xì)胞在抗癌活性中發(fā)揮著重要作用，且淋巴細(xì)胞屬于放射敏感性高的細(xì)胞系，放療會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞數(shù)目減少，從而減弱抗腫瘤免疫應(yīng)答。

人參是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴藥材，屬于五加科植物，具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、生津止渴、安神益智的功效。而人參皂苷作為人參的主要活性成分，在藥理上具備一定的抗腫瘤活性，研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，抗腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移以及抑制腫瘤新生血管形成，并且其次級(jí)代謝產(chǎn)物人參單體的活性更強(qiáng)[6~7]。黃京子等[8]通過(guò)建立小鼠動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3除了可以起到放療增敏的作用外，還可以抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。既往研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3聯(lián)合放療還可以改善惡性腫瘤患者的免疫功能[9]。

淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫成分，參與了免疫應(yīng)答，放療產(chǎn)生的射線會(huì)殺傷外周血細(xì)胞，尤其是T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少，不利于抗腫瘤免疫應(yīng)答的誘生，引起機(jī)體免疫功能下降[10]。潘維華等[11]發(fā)現(xiàn)，小白鼠脾內(nèi)淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞，經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇洗脫后，在人參皂苷的作用下，脾淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯提升，提示人參皂苷可以刺激小鼠免疫細(xì)胞的增殖起到免疫增強(qiáng)的作用。張仲苗等[12]對(duì)人參皂苷Rg3的研究中發(fā)現(xiàn)，Rg3能夠促進(jìn)實(shí)驗(yàn)鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，預(yù)示無(wú)論是非特異性免疫還是特異性免疫均得以提高。在陳洪志等[13]的人參皂苷體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，認(rèn)為Rg3可提高接受放療的鼻咽癌患者外周血的細(xì)胞免疫功能。

絲裂原可以與淋巴細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，刺激淋巴細(xì)胞有絲分裂，是一種非特異性的淋巴細(xì)胞多克隆激活劑，而不同絲裂原作用的主要細(xì)胞不同，ConA誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的分裂，LPS誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的分裂。在本研究中，不同濃度（1、10、100 mg/L）的人參皂苷Rg3處理接受放療的食管癌患者外周血淋巴細(xì)胞后，結(jié)果顯示在不同濃度的人參皂苷Rg3中，淋巴細(xì)胞數(shù)在ConA、LPS誘導(dǎo)下分裂增殖的細(xì)胞數(shù)均得到提升，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性，人參皂苷Rg3濃度越高，細(xì)胞增殖越快。提示在不同濃度的人參皂苷Rg3作用下，接受放療的食管癌患者的T、B淋巴細(xì)胞增殖加快，且人參皂苷Rg3濃度越高，T細(xì)胞及B細(xì)胞增殖越快，從而促進(jìn)了外周血免疫功能的活化。

T細(xì)胞參與機(jī)體細(xì)胞免疫，其中CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞是參與細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞，兩者數(shù)量及其比例的改變影響著機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，CD4+/CD8+比值升高提示機(jī)體免疫功能增強(qiáng)，反之提示免疫功能下降[4]。放療會(huì)影響機(jī)體的免疫功能，有研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)食管癌患者的淋巴細(xì)胞亞群的比例，結(jié)果提示CD4+及CD8+均顯著下降，放療后甚至?xí)霈F(xiàn)CD4+/CD8+比例倒置[14]。在孫義長(zhǎng)[15]的研究中，采用人參皂苷Rg3聯(lián)合新輔助放化療的方式治療胃癌患者，通過(guò)測(cè)量T細(xì)胞亞群的值及比例，發(fā)現(xiàn)在人參皂苷的作用下，CD4+及CD4+/CD8+比值均上升，因此認(rèn)為人參皂苷聯(lián)合放化療能夠提高患者的免疫功能，改善生存。本研究采用不同濃度（1、10、100 mg/L）的人參皂苷Rg3處理接受放療的食管癌患者外周血后，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)量T細(xì)胞亞群中CD4+、CD8+值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)人參皂苷Rg3處理后，各實(shí)驗(yàn)組CD4+及CD4+/CD8+比值均有所升高、而CD8+在各組中表現(xiàn)為下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，人參皂苷Rg3的濃度越高，CD4+及CD4+/CD8+比值越高、CD8+則越低。提示對(duì)于食管癌患者，放療通過(guò)殺傷外周血T細(xì)胞，使得各亞群數(shù)目下降、比例失調(diào)導(dǎo)致免疫抑制；不同濃度的人參皂苷Rg3則可通過(guò)調(diào)節(jié)改善T淋巴細(xì)胞亞群的比例，達(dá)到提高細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用，從而減輕放療所導(dǎo)致的免疫抑制作用，濃度越高，提高細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用越強(qiáng)。

B細(xì)胞則在體液免疫中擔(dān)任著要角色，通過(guò)分泌不同活性的免疫球蛋白，比如IgG、IgM等來(lái)誘導(dǎo)抗原-抗體反應(yīng)，從而激活機(jī)體體液免疫達(dá)到提高機(jī)體免疫狀態(tài)的作用。宋振宇[16]將胃癌患者中的IgG與健康體檢者進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)的IgG的水平與胃癌患者的預(yù)后相關(guān)，IgG濃度降低，則患者的免疫功能下降，因此腫瘤患者的預(yù)后更差。譚江峽[17]在肺癌患者中同樣發(fā)現(xiàn)了此規(guī)律。本研究不同濃度（1、10、100 mg/L）的人參皂苷Rg3處理接受放療的食管癌患者后，測(cè)量外周血中IgM、IgG的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各濃度組的IgM、IgG抗體濃度均升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著人參皂苷Rg3的濃度升高，外周血淋巴細(xì)胞分泌的IgM、IgG抗體濃度增高。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg3可以通過(guò)刺激活化食管癌患者外周血B淋巴細(xì)胞，使抗體分泌量增多，誘導(dǎo)抗原-抗體反應(yīng)發(fā)生，從而提高機(jī)體的體液免疫活性，且其作用特征隨著濃度的增加而增大。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)淋巴細(xì)胞增殖、淋巴細(xì)胞亞群比例、抗體分泌的檢測(cè)等一系列研究，證實(shí)人參皂苷Rg3對(duì)接受放療的食管癌患者的細(xì)胞及體液免疫功能具有促進(jìn)作用，能夠改善放療后食管癌患者的免疫功能，并且隨著人參皂苷Rg3的濃度越大其免疫促進(jìn)作用越強(qiáng)。