根際細(xì)菌對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)與Cd解毒機(jī)制研究

郭軍康， 王 敏， 呂 欣， 魏 婷， 賈紅磊， 劉 洵， 劉文建

(陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展導(dǎo)致土壤重金屬污染急劇增加，治理和修復(fù)重金屬污染是亟待解決的問(wèn)題之一.鎘(Cd)是農(nóng)業(yè)環(huán)境中普遍存在的最嚴(yán)重的污染物之一[1].由于人為和工業(yè)活動(dòng)、含磷肥料的施用、污水污泥、農(nóng)藥等，大量的Cd被輸入到農(nóng)田地區(qū)[2]，而番茄作為重要的蔬菜作物，會(huì)從土壤中吸收養(yǎng)分和重金屬[3]，進(jìn)而導(dǎo)致Cd 富集在果蔬作物的可食用部位.據(jù)報(bào)道，相當(dāng)大比例的種植土壤受到高度Cd污染[4]，生長(zhǎng)在Cd污染環(huán)境中的植物經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一系列嚴(yán)重的植物毒性，包括產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(ROS)、光合作用和呼吸作用下降、養(yǎng)分和水分吸收不足、各種代謝途徑紊亂，甚至植物死亡[5].

利用重金屬富集性植物修復(fù)土壤重金屬污染存在生物量小、生長(zhǎng)速度慢、逆境下重金屬耐受性差等問(wèn)題[6].因此，借助根際細(xì)菌協(xié)同植物的新型修復(fù)策略逐漸被學(xué)者重視，成為重金屬污染土壤的植物修復(fù)研究的重要方向之一.根際環(huán)境中的根際微生物在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物生物量和土壤中重金屬的生物有效性方面有著重要的作用[7]，能夠增強(qiáng)植物宿主對(duì)環(huán)境污染物和其他逆境的耐受性，從而有效地增強(qiáng)共生體系對(duì)環(huán)境的修復(fù)能力.

Han等[8]從受Cd和Pb污染的萵苣根際土壤中分離出兩株產(chǎn)多胺細(xì)菌，其能夠提高植物對(duì)Cd和Pb的抗性，促進(jìn)生菜生長(zhǎng).Manzoor等[9]從超富集植物蜈蚣草根際土壤中分離出一株抗As細(xì)菌PG-12，發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種金屬具有耐受性，并且能夠促進(jìn)蜈蚣草的生長(zhǎng).Kamran等[10]從重金屬污染土壤中分離出一株惡臭假單胞菌，發(fā)現(xiàn)接種PGPR促進(jìn)了Cd超富集植物Eruca sativa的生長(zhǎng)和對(duì)鎘的吸收.Wei等[11]研究顯示，野生豆類(lèi)根部的根瘤菌土壤桿菌同時(shí)對(duì)鉛、銅、鎘、鋅具有抗性，并且可促進(jìn)植物生長(zhǎng).黃文[12]篩選出一株能產(chǎn)生物表面活性劑的根際細(xì)菌LKS06，其在促進(jìn)龍葵生長(zhǎng)的同時(shí)顯著地提高了龍葵對(duì)鎘的富集能力，根和地上部鎘的總累積量最高的分別比對(duì)照增加了36.7%和42.4%，并且證實(shí)該菌株對(duì)多種重金屬(Pb2+、Zn2+、Cu2+) 也有很高的耐受性.

在本研究中，選用一株從重金屬污染的稻田土壤樣本中分離出的細(xì)菌菌株GBR32，并以番茄幼苗為研究對(duì)象，研究接種GBR32菌株對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)和Cd脅迫響應(yīng)過(guò)程.為根際細(xì)菌在作物重金屬脅迫響應(yīng)與受污染農(nóng)田安全利用領(lǐng)域提供新的知識(shí).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用番茄品種為石紅三號(hào)，購(gòu)于新疆石河子蔬菜研究所番茄研究開(kāi)發(fā)中心.

于廣東省大寶山礦區(qū)附近被重金屬污染的稻田土壤樣本中分離出的寡養(yǎng)單胞菌屬 (Stenotrophomonassp.)GBR32作為實(shí)驗(yàn)菌株，由本實(shí)驗(yàn)室前期保存.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 根際促生菌的培養(yǎng)

細(xì)菌菌株在LB固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并在28 ℃下孵育24～48 h，挑選單菌落后于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，28 ℃、180 rpm培養(yǎng)至OD600=1.0，此時(shí)有效菌濃度約為1.0×106cfu/mL，5 500 rpm離心10 min，收集菌體并用無(wú)菌水洗滌2次，再將菌體重懸于無(wú)菌水中并定容至500 mL備用[13]，取相同體積的無(wú)菌水作為空白對(duì)照.

1.2.2 水培實(shí)驗(yàn)

番茄種子用15%的次氯酸鈉消毒并均勻播種于蛭石盤(pán)中，置于人工植物培養(yǎng)室(晝26 ℃/夜20 ℃，晝夜時(shí)間為16 h/8 h，相對(duì)濕度60%).待幼苗長(zhǎng)至“兩葉一心”時(shí)將其轉(zhuǎn)移至含1/4 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的水培箱中培養(yǎng)兩周，隨后用1/2濃度的Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)一周.選取長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄幼苗進(jìn)行接菌處理，將番茄幼苗根部浸泡于制備好的菌懸液中室溫避光培養(yǎng)2 h，未接菌的用去離子水浸泡作為對(duì)照，3天后對(duì)番茄幼苗進(jìn)行2 mg/L的Cd(CdCl2·2.5H2O)處理，在Cd脅迫處理一周后收樣.

1.2.3 番茄生物量和Cd含量的測(cè)定

分開(kāi)收集番茄幼苗的地上部和根部，根部在5.0 mmol/L 的乙二胺四乙酸二鈉( EDTA-2Na) 溶液中浸泡15 min，去除根表面附著的Cd2+，并用去離子水沖洗數(shù)次，置于烘箱中烘干至恒重，之后分別對(duì)地上部和根部進(jìn)行稱(chēng)重以確定其生物量[14].將樣品研磨混勻，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.25 g植物樣品進(jìn)行消解，使用原子吸收光譜儀進(jìn)行Cd含量的測(cè)定[15]，每組處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn).

采用轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)(Translocation factor)來(lái)評(píng)價(jià)Cd從根部輸送到地上部的能力，其計(jì)算公式為：TF=番茄地上部分Cd含量(mg/kg)/根系部分Cd含量(mg/kg).

1.2.4 番茄丙二醛和抗氧化酶活性的測(cè)定

將新鮮植物樣品 (0.5 g) 在 5 mL 磷酸緩沖液(50 mM，pH7.8)中徹底勻漿，離心后將上清液用于后續(xù)測(cè)試[16].丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法(TBA)[17].超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)比色法[18].過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[19].過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測(cè)定[20].

1.2.5 葉綠素含量的測(cè)定

采用95%乙醇提取法，待提取液制備完成后，以95%乙醇為空白，在波長(zhǎng)665 nm、649 nm、470 nm下測(cè)定吸光度并計(jì)算葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素的含量[21].

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)使用Excel 2016、SPSS、Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理、顯著性分析與作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 接種GBR32對(duì)Cd脅迫下番茄生物量的影響

植物對(duì)重金屬的耐性可以根據(jù)植物地上部以及根系生物量的變化作為指標(biāo)[22]，當(dāng)重金屬濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)抑制植物幼苗的生長(zhǎng)，植株葉片小而失綠，從而導(dǎo)致植物的生物量積累受抑制而降低.

由圖1可知，Cd處理組番茄地上部和根部的生物量顯著低于CK對(duì)照組，分別降低了53.4%和53.8%，表明2 mg/L的Cd脅迫會(huì)抑制番茄幼苗的生長(zhǎng).接種GBR32處理組地上部和根部的生物量顯著低于CK，分別降低了31.9%和31.2%，說(shuō)明接種GBR32細(xì)菌后，能夠誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗性(ISR)從而抵御對(duì)生物脅迫的抗性，使植物進(jìn)入防御狀態(tài)，防衛(wèi)反應(yīng)的激活使細(xì)胞和能量代謝轉(zhuǎn)向于逆境響應(yīng)，從而打破了正常的細(xì)胞發(fā)育功能，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)減緩，降低番茄植株的生物量.GBR32+Cd處理組的生物量與Cd處理相比分別增加了63.6%和98.6%，說(shuō)明接種GBR32菌株能夠顯著緩解Cd脅迫引起的番茄生長(zhǎng)抑制.

圖1 不同處理對(duì)番茄生物量的影響

2.2 接種GBR32對(duì)Cd脅迫下番茄MDA含量的影響

逆境下植物器官往往會(huì)受到傷害，產(chǎn)生膜脂過(guò)氧化現(xiàn)象，MDA則是膜脂發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)后形成的最終產(chǎn)物，其含量通常用于表示植物的氧化損傷程度[23].

如圖2所示，較CK處理組相比，Cd脅迫下番茄地上部和根部的MDA含量分別顯著增加了15.2%和115.9%.說(shuō)明Cd脅迫能夠誘導(dǎo)番茄幼苗體內(nèi)活性氧積累，加劇膜脂過(guò)氧化，從而使細(xì)胞膜的完整性受到破壞.GBR32和GBR32+Cd處理組較CK處理組相比，地上部的MDA含量分別降低了29.5%和38.2%，說(shuō)明接種GBR32菌株后，植物的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性被激活，從而引發(fā)植物對(duì)生物和非生物脅迫的增強(qiáng)抗性，緩解了GBR32和Cd對(duì)植物膜脂的氧化損傷.與Cd處理組相比，GBR32+Cd處理組使得番茄地上部和根部的MDA含量分別降低了46.4%和14.5%，說(shuō)明接種GBR32菌株后番茄地上部和根部MDA含量均有一定的緩解作用.

圖2 不同處理對(duì)番茄MDA含量的影響

2.3 接種GBR32對(duì)Cd脅迫下番茄抗氧化酶活性的影響

在正常條件下，植物能有效地清除體內(nèi)的活性氧，使細(xì)胞免受傷害.但在逆境條件下，植物體內(nèi)的活性氧自由基產(chǎn)生速度超過(guò)了植物清除活性氧的能力[24].因此，為了減輕ROS造成的氧化損傷，植物體內(nèi)已經(jīng)進(jìn)化出了一種由超氧化物歧化酶 (SOD)、過(guò)氧化物酶 (POD)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)等構(gòu)成的保護(hù)酶系統(tǒng)[25].

如圖3所示，較CK處理組相比，Cd脅迫下番茄根部SOD活性提高了4.6%，說(shuō)明番茄幼苗根系對(duì)Cd脅迫更為敏感，誘導(dǎo)SOD活性提高，從而清除植株體內(nèi)的O2-.與Cd處理組相比，GBR32+Cd處理組番茄幼苗根部SOD活性降低了19.8%.這與MDA含量的結(jié)果相一致，說(shuō)明GBR32菌株能夠降低Cd脅迫下植株所受到的傷害程度，緩解氧化應(yīng)激，因此SOD活性降低.

圖3 不同處理對(duì)番茄SOD活性的影響

如圖4所示，Cd脅迫下，番茄地上部和根部的POD活性較CK處理組相比分別提高了117.1%和29.5%.說(shuō)明Cd脅迫下番茄植株為了清除體內(nèi)過(guò)多的H2O2和其他過(guò)氧化物，從而誘導(dǎo)了POD活性的提高，以維持自身的正常代謝[26].與Cd處理組相比，GBR32+Cd處理組的地上部和根部的POD活性分別降低了62.9%和10.4%.這可能是由于接種GBR32菌株后，植株體內(nèi)自由基積累量減少，對(duì)植株造成的氧化損傷程度減小，因此POD活性降低以調(diào)節(jié)植物的適應(yīng)能力.

圖4 不同處理對(duì)番茄POD活性的影響

2.4 接種GBR32對(duì)Cd脅迫下番茄葉綠素含量的影響

重金屬通過(guò)干擾植物呼吸、破壞葉綠體的完整性、影響光合過(guò)程中的電子傳遞從而影響植物的光合作用[27].葉綠素含量的降低是植物在受到重金屬毒害后而表現(xiàn)出來(lái)的現(xiàn)象.Pramanik等[28]研究表明，在Cd脅迫下接種根際促生菌顯著提高了植物的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量(>2.5倍)，從而緩解了Cd對(duì)植物光合作用所帶來(lái)的毒害作用.

通過(guò)分析葉綠素含量發(fā)現(xiàn)(圖5)，與CK相比，Cd處理組的番茄葉片葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素含量分別下降了41.1%、49.2%和35.3%，說(shuō)明Cd能夠抑制原葉綠素酸酯還原酶活性并阻礙氨基-γ-酮戊二酸的合成，從而影響葉綠素的生物合成[29]，也可能與合成葉綠素所需的酶受Cd破壞有關(guān)[30].但與Cd處理相比，GBR32+Cd處理組的番茄葉片葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素含量均有顯著的增加，分別提高了20.5%、38.9%和14.1%.說(shuō)明接種GBR32菌株有利于促進(jìn)Cd脅迫環(huán)境下番茄幼苗葉綠素含量的增加，從而緩解Cd對(duì)番茄光合作用所帶來(lái)的毒害.

圖5 不同處理對(duì)番茄葉綠素含量的影響

2.5 接種GBR32對(duì)Cd脅迫下番茄內(nèi)源茉莉酸含量的影響

茉莉酸(JA)作為重要的逆境信號(hào)分子在調(diào)控重金屬脅迫等逆境脅迫中起著重要的作用.如圖6所示，與CK對(duì)照組相比，Cd脅迫處理組番茄地上部和根部?jī)?nèi)源茉莉酸含量無(wú)顯著變化，而接種GBR32菌株后，地上部和根部?jī)?nèi)源茉莉酸含量均有顯著增加.與Cd處理組相比，GBR32+Cd處理組使得番茄地上部和根部茉莉酸含量分別顯著增加了41.9%和9.3%.說(shuō)明接種GBR32菌株可能通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)源JA的合成從而激活JA/ET介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性.

圖6 不同處理對(duì)番茄JA含量的影響

2.6 接種GBR32對(duì)Cd脅迫下番茄內(nèi)源乙烯含量的影響

植物在重金屬脅迫下乙烯含量會(huì)增加，ET濃度的升高，會(huì)阻礙側(cè)根的生長(zhǎng)、根系伸長(zhǎng)和根毛的形成，從而抑制植物生長(zhǎng)[31].目前有益內(nèi)生菌和根際促生菌的特點(diǎn)之一是可以產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶，調(diào)控ACC是細(xì)菌協(xié)助植物抵抗非生物脅迫的重要途徑之一[32].病原菌的入侵能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ET的積累[33].

如圖7所示，與CK處理組相比，Cd脅迫下番茄地上部的內(nèi)源乙烯含量無(wú)顯著變化，而根部的乙烯含量顯著降低.與Cd處理組相比，GBR32+Cd處理組使得番茄地上部和根部乙烯含量分別顯著增加了13.8%和11.8%.說(shuō)明GBR32菌株可能通過(guò)乙烯含量的增加來(lái)誘導(dǎo)乙烯信號(hào)途徑進(jìn)而提高番茄對(duì)Cd的抗性.

圖7 不同處理對(duì)番茄ET含量的影響

2.7 接種GBR32對(duì)Cd脅迫下番茄Cd累積量和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響

重金屬Cd存在于土壤中，并被植物吸收累積.研究表明，根際細(xì)菌能夠調(diào)控不同植物對(duì)重金屬的吸收[34].如圖8所示，與Cd處理組相比，GBR32+Cd處理組使得番茄地上部和根部的Cd含量分別提高了46.7%和60.9%，顯著增加了地上部和根部的Cd含量.

圖8 不同處理對(duì)番茄Cd含量的影響

接種GBR32對(duì)番茄Cd的累積量的影響如表1所示.由表1可知，GBR32能夠顯著提高Cd脅迫下番茄根部Cd累積量.計(jì)算其轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)結(jié)果如表1所示.由表1可以看出，在Cd脅迫下接種GBR32菌株能夠降低Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，說(shuō)明GBR32菌株能夠抑制重金屬Cd從根部向地上部的運(yùn)輸.綜上，說(shuō)明GBR32菌株能夠大幅度提高番茄植株對(duì)Cd的吸收和富集能力，并且將Cd大量集中在根部.因此可以成為具有潛在重金屬修復(fù)能力的菌株，進(jìn)一步用于實(shí)際重金屬污染修復(fù)[35].某些根際細(xì)菌細(xì)胞壁含有的羧基、羥基、氨基、磷酸基團(tuán)等官能團(tuán)能與金屬離子配位絡(luò)合，從而將其固定于細(xì)胞壁上[36]，因此，細(xì)菌細(xì)胞壁組成與Cd累積之間的關(guān)系有待深入研究.

表1 不同處理下的Cd累積量

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)番茄幼苗接種從被重金屬污染的稻田土壤樣本中分離得到的GBR32菌株，研究發(fā)現(xiàn)：(1)接種GBR32菌株可顯著地提高Cd脅迫下番茄幼苗的生物量；(2)降低番茄MDA、SOD和POD活性，提高番茄葉片中的葉綠素含量，提高番茄內(nèi)源茉莉酸和乙烯含量，緩解了Cd脅迫；(3)大幅度提高番茄根部對(duì)Cd的富集能力并將Cd固定在根部，降低Cd轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù).該研究結(jié)果為根際細(xì)菌在調(diào)控作物重金屬吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，緩解重金屬毒害，開(kāi)展受污染農(nóng)田安全利用提供科學(xué)依據(jù).