一株產(chǎn)纖維素酶硫磺菌的生物學(xué)特性及其對松針降解效果研究

何建清 張格杰 劉林峰 王思遠(yuǎn) 馬金玉

（1西藏農(nóng)牧學(xué)院理化測試與生物技術(shù)中心，西藏林芝 860000；2西藏農(nóng)牧學(xué)院植物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000）

松針是一種可再生的自然資源，分布范圍廣泛，松針蘊(yùn)含量在一億t 以上。松針富含的蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素和活性物質(zhì)對作物生長有著重要的作用，松針黃酮還具有獨(dú)特的水溶性，充分腐熟后會釋放進(jìn)入土壤中，對土壤改良可起到獨(dú)特的作用[1-2]。同時松針中富含的酸性物質(zhì)能夠降低土壤pH，對堿性土壤起到良好的調(diào)節(jié)作用，是鹽堿地土壤改良的一種有效的生物改良劑[3]。

西藏東南地區(qū)松針資源豐富，品種繁多。松針是松樹類植物的主要副產(chǎn)物之一，具有再生速度快、四季均可采收、天然蓄積量大的特點(diǎn)。松針堆肥后用于生產(chǎn)土壤改良劑，對合理利用西藏廢棄松針資源，改善西藏土壤的生態(tài)環(huán)境具有積極的作用。

松針富含豐富的木質(zhì)纖維素，松針中纖維素類物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)56.4%[4]。木質(zhì)素作為物理屏障，阻礙了纖維素酶與纖維素的作用，故木質(zhì)纖維素的有效轉(zhuǎn)化需要葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶和木聚糖苷酶等纖維、半纖維素酶及漆酶（Laccase，Lac）、木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）及Mn 依賴過氧化物酶（Mn-dependent peroxidase，MnP）等木質(zhì)素酶協(xié)同作用[5-6]。同時，松針富含油分，能夠減少水分的蒸騰以及葉片吸水，阻礙堆肥過程中松針的降解。因此，如何加快松針降解速度是松針堆肥亟待解決的一個重要問題。近年來，生物法預(yù)處理由于其環(huán)境友好、低能耗、低成本等特點(diǎn)，被認(rèn)為是最具前景的預(yù)處理技術(shù)。褐腐菌主要降解針葉樹，大量的木質(zhì)素殘留致使腐朽木材呈褐色腐朽[7]。Michael 等[8]首次研究褐腐菌降解針葉樹材形成生物燃料過程中的早期降解機(jī)制。結(jié)果表明，在降解初期褐腐菌通過提高木材生物質(zhì)的糖化作用，引起木材細(xì)胞壁中纖維素成分（包括纖維素和半纖維素）快速、大量地解聚，從而達(dá)到生物降解木材的目的[9]。

硫磺菌屬Laetiporus隸屬于擔(dān)子菌門Basidiomycota、傘菌綱Agaricomycetes、多孔菌目Polyporalaes、擬層孔菌科Fomitopsidaceae。該屬真菌廣泛分布于世界各地，從寒溫帶到熱帶區(qū)域都有其分布的報道[10]。硫磺菌是食、藥兼用的大型真菌之一[11]。硫磺菌屬真菌，易于培養(yǎng)，且富含不飽和脂肪酸、草酸和布里酸等成分，有毒成分極低，甚至無法檢測到[12]。該屬真菌多生長在針闊葉樹的活樹、樹樁或倒木上，引起樹木心材的褐色腐朽[13]。國內(nèi)外研究表明，褐腐菌因其在環(huán)境價值和生物技術(shù)方面的潛能而被備受關(guān)注。目前，國內(nèi)對硫磺菌屬真菌分類[10]、馴化[13]及生物學(xué)特性[14]等方面已有不少研究，但其產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶的方面研究還很少[15]，利用其進(jìn)行松針的降解還未見報道。為此，筆者研究利用前期篩選的1 株產(chǎn)纖維素酶活性較強(qiáng)的硫磺菌[16]，對其進(jìn)行鑒定，并研究其菌絲生長最適碳源、碳源、溫度及pH，以及對松針的降解能力，以期為該菌的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試菌株：供試菌株子實(shí)體采自西藏色季拉山海拔3600 m 左右的松樹活立木上，采用組織分離法獲得硫磺菌菌株，編號為LS，保藏于西藏農(nóng)牧學(xué)院真菌實(shí)驗(yàn)室。（2）松針材料：2020年10—12月于西藏農(nóng)牧學(xué)院校園撿拾地面當(dāng)季凋落的原狀松針帶回實(shí)驗(yàn)室，剔除樹枝、樹皮、灌木葉片等雜物，保留外形完整未分解狀態(tài)的松針。用自來水快速沖洗松針，瀝水后置于60 ℃烘箱內(nèi)烘48 h，粉碎，過40 目篩，備用。（3）培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基用于菌種分離與保藏、形態(tài)特征觀察、菌種培養(yǎng)；基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于菌絲體生物學(xué)特性試驗(yàn)，配方見參考文獻(xiàn)[6]。松針固體發(fā)酵培養(yǎng)基：松針粉20.0 g，60 mL PD 培養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離、培養(yǎng)與保存

組織分離法分離菌株[17]。菌株編號為LS，于25 ℃避光培養(yǎng)7d，于4 ℃保藏。

1.2.2 形態(tài)與分子鑒定

觀察子實(shí)體形態(tài)并記錄。菌絲顯微觀察采用插片培養(yǎng)法。分子鑒定采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）鑒定法。結(jié)合形態(tài)特征和分子生物學(xué)特性確定目標(biāo)菌株的分類學(xué)地位。

為了驗(yàn)證本工作提出的改進(jìn)的MPDTC方法的正確性,利用Matlab/Simulink建立驅(qū)動系統(tǒng)的仿真模型進(jìn)行仿真研究.仿真中MPDTC的磁鏈和轉(zhuǎn)矩權(quán)重因子為kψ=2,kT=1,LSFMPDTC的權(quán)重因子為kψ=2,kT=1,kf=0.1,電機(jī)的額定值和相關(guān)參數(shù)如表1所示,系統(tǒng)采樣頻率為6 kHz,Udc為540 V.

1.2.3 碳氮源試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[6]的方法，采用固體平板培養(yǎng)法，分別測定蔗糖、阿拉伯糖、可溶性淀粉、木糖、甘露醇對菌株LS菌絲生長的影響；氮源酵母浸膏、硫酸銨、牛肉膏、硝酸鉀、賴氨酸和谷氨酸對菌株LS 菌絲生長的影響。每處理重復(fù)3次。

1.2.4 pH對菌絲生長的影響

將固定碳氮源的培養(yǎng)基的pH調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 共7 個梯度。將其置于28 ℃培養(yǎng)箱中，接種、培養(yǎng)，測定方法同上。每處理重復(fù)3次。

1.2.5 溫度對菌絲生長的影響

將菌株LS接種到相同的培養(yǎng)基中，分別放置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中。測定方法同上。每處理重復(fù)3次。

1.2.6 松針固體發(fā)酵試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取松針粉20 g 于250 mL 廣口瓶中，加入60 mL PD 培養(yǎng)液，混合均勻，121 ℃滅菌30 min。接種直徑5 mm 的在PDA 培養(yǎng)基上擴(kuò)繁7 d 的菌餅6塊，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d，以不接菌的樣品為對照，試驗(yàn)重復(fù)3次。按參考文獻(xiàn)[18]測定發(fā)酵前后松針中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2007 進(jìn)行初步處理后，采用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LS鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)特征

菌株LS 擔(dān)子果一年生，無柄或有近似側(cè)生柄，覆瓦狀結(jié)構(gòu)（圖1a）。擔(dān)子果幼嫩時肉質(zhì)，烘干后較輕，易碎；菌蓋平展，扇形至半圓形；幼嫩時上層表面亮鮭紅橙色，風(fēng)干后變?yōu)闇\棕色，光滑無毛，有明顯的環(huán)紋或微弱環(huán)紋；邊緣幼嫩時奶油色至淺黃色，老后變?yōu)槌赛S色至紅褐色，鈍圓，較厚；菌孔表面新鮮時檸檬黃色至亮奶油黃色，干后變?yōu)闇\黃色，不育邊較窄，寬1 mm；菌孔初時近圓形，生長后變得不規(guī)則，菌孔2～4 mm，孔壁較薄，全緣到撕裂；菌肉新鮮時白色，厚3 cm，基部略厚并下延至菌柄附著處，干后奶油色至淡黃色；菌管顏色與孔面顏色相同，易碎，長為1～5 mm。無氣味，無口感。孢子卵圓形至橢圓形，透明，光滑，（5.5～7.2）μm×（3.5～4.5）μm。菌株LS 在PDA 培養(yǎng)基中菌落表現(xiàn)為平展，白色或淡黃白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，絨毛狀，細(xì)密，整齊，生長較快（圖1 b）。

圖1 硫磺菌菌株LS的形態(tài)特征

2.1.2 ITS序列分析

經(jīng)PCR 擴(kuò)增、與載體連接及測序，得到菌株LS的ITS序列。通過NCBI網(wǎng)站進(jìn)行在線Blast比對，下載髙山硫磺菌、硫色硫磺菌、哀牢山硫磺菌、針葉樹硫磺菌、變孢硫磺菌、環(huán)紋硫磺菌及辛辛那提硫磺菌等相關(guān)硫磺菌屬已發(fā)表菌株的ITS 序列，利用MEGA5.0 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)該序列與環(huán)紋硫磺菌和硫色硫磺菌相似度均達(dá)99.81%。菌株LS 與硫色硫磺菌聚在一起，且支持率為93%（圖2）。結(jié)合該菌株形態(tài)特征[19]，將其鑒定為硫色硫磺菌Laeti-porus sulphureus。

圖2 基于rDNA-ITS基因片段的系統(tǒng)發(fā)育圖

2.2 碳源對硫磺菌LS菌絲生長的影響

由表2 可知，供試6 種碳源中，以葡萄糖為碳源時，硫磺菌LS菌絲生長最快，其菌絲淡黃濃密，菌落邊緣規(guī)則，且日均長速顯著快于其他碳源，為5.10 mm/d，蔗糖、阿拉伯糖次之；木糖和甘露醇的菌絲日均長速和長勢一般，可溶性淀粉菌絲日均長速最慢，僅為2.85 mm/d。綜合菌絲日均長速和長勢，硫磺菌LS菌株固體培養(yǎng)基中的最佳碳源為葡萄糖。

表2 供試碳源對硫磺菌LS菌絲生長的影響

2.3 氮源對硫磺菌LS菌絲生長的影響

由表3 可知，以牛肉膏為氮源時硫磺菌LS 菌絲平均長速最快，為5.60 mm/d，且菌絲粗壯濃密，邊緣規(guī)則。蛋白胨、酵母粉和谷氨酸為氮源時，硫磺菌LS 菌絲生長速度無顯著差異；硫磺菌LS 不能利用硫酸銨、硝酸鉀和賴氨酸。因此，綜合菌絲長勢和菌絲平均長速，確定硫磺菌LS菌絲生長的最適氮源為牛肉膏。

表3 供試氮源對硫磺菌LS菌絲生長的影響

2.4 培養(yǎng)溫度對硫磺菌LS菌絲生長的影響

由圖3 可知，硫磺菌LS 菌絲生長速度隨溫度的升高（15～25 ℃）而加快，在30 ℃時，菌絲日均長速顯著變慢（P＜0.05），僅為1.05 mm/d；25 ℃時，菌絲日均長速最快，為4.45 mm/d，且菌絲濃密；35 ℃時，菌絲不能生長。綜合考慮菌絲日均長速和長勢，硫磺菌LS菌絲的最適生長溫度為25 ℃，其次為20 ℃。

圖3 培養(yǎng)溫度對硫黃菌LS菌絲生長的影響

2.5 pH對硫磺菌LS菌絲生長的影響

由圖4 可知，隨著培養(yǎng)基的pH 上升，硫磺菌LS菌絲日均長速逐漸變慢。pH 為4.0，其菌絲生長速度最快，為6.25 mm/d，其次pH 為5.0，為4.60 mm/d；第三是pH 為6.0，為1.15 mm/d；pH 為7、8、9 和pH 為10，硫磺菌LS菌絲基本不生長。綜合菌絲日均長速及長勢，硫磺菌LS培養(yǎng)基的最適pH為4.0。

圖4 pH對硫磺菌LS菌絲生長的影響

2.6 發(fā)酵后松針木質(zhì)纖維素的含量

為研究硫磺菌菌株LS對松針木質(zhì)纖維素的降解效果，測定發(fā)酵前后松針的纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的含量（圖5）。發(fā)酵前松針中纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50.08%，半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.55%，木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40.71%。經(jīng)硫磺菌菌株LS 發(fā)酵30 d 后，三者含量均有一定程度下降，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降至24.10%、11.35% 和37.14%，降解率分別為51.88%、16.24% 和8.77%。以上結(jié)果表明，硫磺菌菌株LS 可產(chǎn)生降解木質(zhì)纖維素的主要相關(guān)酶系，且對于木質(zhì)纖維素的降解效果明顯。

圖5 發(fā)酵前后松針中木質(zhì)纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 小結(jié)與討論

從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征初步確定菌株LS為硫色硫磺菌Laetiporus sulphureus。培養(yǎng)試驗(yàn)表明，該菌株菌絲生長最適碳源為葡萄糖，氮源為牛肉膏，最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，pH 為4。降解松針木質(zhì)纖維素試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株LS 對松針發(fā)酵30 d后，松針中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率分別為51.88%、16.24%、8.77%。

松針因其獨(dú)特的生存環(huán)境和生理功能，造就獨(dú)特的內(nèi)含物質(zhì)，顯著不同于一般禾本科作物，是一種獨(dú)特的有機(jī)肥原材料[3]。纖維素是松針細(xì)胞重要組成成分之一。纖維素屬于大分子聚合物，是分布最廣的碳水化合物[4]。由于纖維素具有水不溶性的高結(jié)晶結(jié)構(gòu)，外圍被木質(zhì)素包圍，難以大量降解。褐腐菌多為擔(dān)子菌類，分泌纖維素酶系，可分解纖維素和半纖維素。但它對木質(zhì)素的降解能力很弱。硫色硫磺菌能較強(qiáng)地降解松針纖維素和半纖維素，但對木質(zhì)素的降解率較低。白腐真菌是一類能夠降解木材并造成白色腐朽的真菌，它們能夠分泌多種降解木質(zhì)纖維素的胞外酶，且降解木質(zhì)素能力強(qiáng)于降解纖維素[20]。用褐腐菌和白腐菌的混合菌群，可以起到更加顯著的效果，縮短預(yù)處理周期[21]。今后應(yīng)以混合型菌劑降解松針為研究方向，以及各種菌株之間降解過程中的協(xié)助與拮抗作用，以尋找最佳的混合菌種，以實(shí)現(xiàn)松針的高效降解，提高松針堆肥的利用價值。