白靈菇液體發(fā)酵菌種培養(yǎng)終點初探

劉海娟 劉利娟 郭紋余 常曉寧 鄭素月 郭金英

（河北工程大學，河北邯鄲 056001）

白靈菇Pleurotus tuoliensis又名阿魏側(cè)耳、阿魏蘑菇、阿魏蘑、阿魏菇等，是一種食、藥用性都很高的珍稀食用菌。美味可口、營養(yǎng)豐富[1]的白靈菇不僅食用價值較高，還具有一定的藥用價值，如具有降血壓[2]、降血脂[3-4]、抗氧化、抗疲勞[5-6]、抗腫瘤、抗輻射及提高免疫力[7-8]等功效，所以常被稱為白靈芝。

液體發(fā)酵終點傳統(tǒng)的判斷方法主要以發(fā)酵瓶質(zhì)量變化[9-10]為依據(jù)，此方法在液體發(fā)酵培養(yǎng)終點的報道中相對較多，但是用于食用菌方面的較少。雖然以發(fā)酵瓶質(zhì)量變化為參數(shù)，結(jié)合生長曲線判斷液體發(fā)酵的培養(yǎng)終點方法簡便，但無法確定菌絲活力。因此，結(jié)合漆酶[11]、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶等酶活測定判斷液體發(fā)酵培養(yǎng)終點能判定出菌絲的老化程度，找出菌絲質(zhì)量較好的發(fā)酵時間點，從而更好地應(yīng)用于生產(chǎn)。余昌霞等[12]用傳統(tǒng)方法配合酶（漆酶、羧甲基纖維素、半纖維素酶）活性測定判斷草菇液體菌種的培養(yǎng)終點應(yīng)在84～96 h。許修宏等[13]從不同添加物的角度進行木耳液體菌種老化的研究，通過測定氧化還原物質(zhì)及氧化還原酶酶活性得出菌絲抗氧化能力是隨著發(fā)酵時間而變化?？寡趸芰姷木z質(zhì)量較好[14]，并且用于生產(chǎn)后可提高菌絲對栽培基質(zhì)中營養(yǎng)的利用率。

筆者通過對白靈菇液體發(fā)酵菌種定性、定量分析及栽培試驗，找出菌絲質(zhì)量較好的發(fā)酵培養(yǎng)終點，以縮短白靈菇生產(chǎn)周期，提高生物轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為“白雜65”，由河北工程大學食用菌實驗室雜交選育而成。

1.2 供試培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖25 g，酵母膏7 g，MgSO40.5 g，KH2PO42 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖25 g，酵 母 膏7 g，MgSO40.5 g，KH2PO42 g，蒸 餾 水1000 mL，pH自然。

栽培料培養(yǎng)基：棉籽殼78%，麩皮20%，石灰1%，石膏1%，含水量約60%。

1.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)方法

液體發(fā)酵培養(yǎng)方法參考文獻[15]。

1.4 液體菌種定性分析

1.4.1 菌球感官觀察

300 mL 三角瓶液體培養(yǎng)基裝液量為100 mL，接種10 mL 液體菌種，在恒溫搖床中25 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min進行培養(yǎng)。試驗設(shè)三次重復(fù)，共9瓶。從第0 天開始記錄發(fā)酵液氣味、顏色，菌球密度、顏色、外觀等。

1.4.2 顯微鏡檢檢測鎖狀聯(lián)合數(shù)量變化

用鑷子將菌球置于干凈的載玻片上，在酒精燈上將菌絲烤干，滴入1 滴結(jié)晶紫染色1～2 min，水洗，烤干，每天觀察記錄菌絲鎖狀聯(lián)合數(shù)量，并繪制出白靈菇液體發(fā)酵菌種在發(fā)酵過程中菌絲鎖狀聯(lián)合數(shù)量變化的曲線圖。

1.4.3 回接平板試驗

在超凈工作臺中，用鑷子將菌球置于PDA 平板培養(yǎng)基中心，在溫度為25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h觀察一次菌球萌發(fā)狀態(tài)。

1.5 液體菌種定量分析鑒定

1.5.1 發(fā)酵液pH測定

在超凈工作臺中取液體發(fā)酵培養(yǎng)時間為第0天、第1 天、第3 天、第5 天、第7 天、第9 天的10 mL發(fā)酵液于玻璃燒杯中，用pH計測發(fā)酵液pH并記錄。每組3次重復(fù)。

1.5.2 可溶性蛋白含量測定

移取2 mL 發(fā)酵液至離心管中，8000 r/min 離心10 min，取上清液即為可溶性蛋白質(zhì)待測液。每隔24 h 提取一次，每個重復(fù)提取3 個待測液。蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法[16]。

1.5.3 還原糖含量測定

從發(fā)酵培養(yǎng)第2 天開始，每隔24 h 移取2 mL 發(fā)酵液于離心管中，4 ℃8000 r 離心10 min 取上清液即為還原糖待測液，每組3 個重復(fù)。還原糖含量測定采用DNS法[16]。

1.5.4 ABTS法測定漆酶酶活性

移取1 mL 發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中，以12000 g離心10 min，取上清液即為漆酶粗酶液。漆酶活性測定及計算公式參考文獻[16]。

1.6 栽培方法

按照配方制備栽培料，含水量為60%。將栽培料裝入17 cm×38 cm×0.0045 cm 的高壓聚丙烯塑料袋，并在料袋中心插入錐形棒，高溫高壓滅菌鍋滅菌90 min。滅菌料袋冷卻后同時接入液體和固體菌種，接液體菌種10～20 mL（發(fā)酵培養(yǎng)第5 天）；固體菌種接種時，將每個固體（平板）培養(yǎng)基平均切4塊，每個栽培料袋接種2 塊。設(shè)3 次重復(fù)，每個重復(fù)3袋，置于培養(yǎng)室25 ℃避光培養(yǎng)發(fā)菌。菌絲長滿袋之日起進入后熟期，將后熟期結(jié)束后的菌袋置于夜晚10 ℃以下，白天15 ℃，通風良好，空氣相對濕度為85% 處，避光培養(yǎng)，并適時疏蕾，保證每個菌袋有1～2 個健壯的菇蕾。當菇蕾形成后將菇房溫度調(diào)整為15 ℃，空氣相對濕度為90%～95%，通風良好，自然晝夜光照。當白靈菇子實體菌蓋完全展開，菌蓋邊緣內(nèi)卷、孢子尚未彈射時采收。

記錄菌絲滿袋時間、出菇日期，統(tǒng)計子實體鮮重，測定子實體菌蓋縱徑、橫徑、菌蓋厚度、菌柄長度，計算生物轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體菌種定性分析

2.1.1 菌球感官變化

液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液顏色、氣味與菌球密度、顏色、外觀等都隨發(fā)酵時間的變化而變化。由表1可知，隨發(fā)酵時間延長，發(fā)酵液顏色由深棕黃色變?yōu)闇\棕黃色，酵母膏氣味由濃變淡逐漸消失，且發(fā)酵后期出現(xiàn)酒精氣味；菌球密度由稀疏到稠密再到黏稠，菌球顏色由淺棕黃色到潔白最后呈現(xiàn)出中心發(fā)黃的現(xiàn)象，壁掛白靈菇菌絲（以下稱菌絲）由深棕黃色線條至潔白濃密。

表1 發(fā)酵液及菌球感官變化

2.1.2 顯微鏡檢測菌絲鎖狀聯(lián)合數(shù)

由圖1 可見，菌絲鎖狀聯(lián)合數(shù)量隨著發(fā)酵培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當液體菌種培養(yǎng)至第5 天時，菌絲鎖狀聯(lián)合數(shù)最多，為24 個。液體發(fā)酵后期，菌絲空泡現(xiàn)象比較嚴重，發(fā)酵前期形成的鎖狀聯(lián)合會隨著菌絲空泡加劇呈現(xiàn)出菌絲鎖狀聯(lián)合空心的現(xiàn)象，即可推測菌絲已經(jīng)嚴重老化，活力降低（圖2a）。當空泡嚴重程度更加惡化時，菌絲開始斷裂出現(xiàn)自溶現(xiàn)象（圖2b）。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)過程菌絲鎖狀聯(lián)合個數(shù)

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)第8天的菌絲鎖狀聯(lián)合形態(tài)（箭頭所指）

2.1.3 回接平板試驗分析

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間延長，菌球回接平板萌發(fā)時間呈先降低再升高的趨勢。發(fā)酵第2天、第3天時，菌球回接平板萌發(fā)時間較長。當發(fā)酵培養(yǎng)至第5 天、第6 天時，回接平板的菌絲萌發(fā)時間最短，為16 h，此時菌絲活力較高，生長速度快。當液體發(fā)酵培養(yǎng)至后期時，菌球回接平板萌發(fā)時間較長，表明菌球活力下降。

圖3 液體菌種菌球回接平板萌發(fā)時間

2.2 液體菌種定量分析

2.2.1 發(fā)酵液pH變化

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵液中pH變化趨勢為先上升后下降再上升。發(fā)酵后期，發(fā)酵液pH升高，推測可能由于菌絲老化嚴重，自溶或死亡，菌絲體內(nèi)代謝物溶解到發(fā)酵液中導(dǎo)致發(fā)酵液pH升高。

圖4 發(fā)酵液pH變化

2.2.2 發(fā)酵液中還原糖質(zhì)量濃度變化

由圖5可知，隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵液中還原糖質(zhì)量濃度總體呈下降趨勢。發(fā)酵第2 天、第3 天時，菌絲生長緩慢還原糖消耗較少；發(fā)酵第4天、第5天時，菌絲生長較快，活力較強還原糖消耗較快，推測此時菌絲可能處于對數(shù)生長期；發(fā)酵第6天開始，還原糖消耗量減少并趨于平穩(wěn)。

圖5 發(fā)酵液中還原糖質(zhì)量濃度變化

2.2.3 發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度變化

由圖6可知，發(fā)酵第2天、第3天時，發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度趨于平穩(wěn)。發(fā)酵第4 天、第5 天時，發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度上升，表明此時菌絲生長迅速，由菌絲體溶解到發(fā)酵液中，致使可溶性蛋白質(zhì)量濃度上升。發(fā)酵第7 天、第8 天時，發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度再上升，此時期菌絲因空泡導(dǎo)致斷裂或自溶，可能導(dǎo)致菌絲體內(nèi)可溶性蛋白大量流失到發(fā)酵液中，從而使發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度上升。

圖6 發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度變化

2.2.4 漆酶酶活性變化

由圖7可知，發(fā)酵培養(yǎng)過程中，漆酶酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的特點。發(fā)酵第2 天、第3 天時，菌絲生長速度較慢，漆酶酶活性較低；發(fā)酵培養(yǎng)至第4天、第5 天時，漆酶活性迅速上升，促進菌絲對營養(yǎng)成分的吸收，從而使菌絲生長迅速。發(fā)酵后期菌絲逐漸老化，漆酶活性也相對降低。發(fā)酵第8天時，菌絲老化嚴重甚至死亡，漆酶活性急劇下降，此時的菌絲生長較慢，甚至部分菌絲不再生長。

圖7 漆酶活性隨培養(yǎng)時間的變化

2.3 栽培試驗結(jié)果

2.3.1 袋料菌絲生長情況

液體菌種接種的栽培袋內(nèi)菌絲生長速度明顯比固體菌種快。液體菌種菌絲滿袋時間、采收時間比固體菌種提前15 d，即栽培周期縮短15 d（表2、圖8）。

表2 菌絲滿袋時間及采收時間

圖8 培養(yǎng)第31天時栽培袋發(fā)菌對比

2.3.2 白靈菇子實體經(jīng)濟性狀分析

由表3 可知，液體菌種栽培的子實體鮮重平均為500 g，生物轉(zhuǎn)化率為100%。固體菌種的鮮重平均為280 g，生物轉(zhuǎn)化率為56%。子實體菌蓋縱徑、橫徑，液體菌種比固體菌種好，具有顯著差異，而菌蓋厚、菌柄長度無差異。

表3 白靈菇子實體經(jīng)濟性狀

3 小結(jié)

從液體發(fā)酵感官觀察得出發(fā)酵第5 天左右，菌絲生長最好。顯微鏡鏡檢鎖狀聯(lián)合、回接平板萌發(fā)試驗及漆酶酶活性測定結(jié)果表明，液體發(fā)酵第5 天時菌種活力最強。

液體發(fā)酵工藝有分批發(fā)酵[17]、連續(xù)發(fā)酵[18]和補料分批發(fā)酵[19]三種發(fā)酵方式。分批發(fā)酵中微生物生長的四個時期比較明顯、操作簡單，應(yīng)用較廣泛。隨發(fā)酵時間的延長，結(jié)合發(fā)酵液中漆酶、還原糖、可溶性蛋白的含量及發(fā)酵液中pH 的變化曲線圖可推測出，白靈菇液體菌種在發(fā)酵過程中存在微生物生長的四個時期。發(fā)酵第4 天、第5 天時，菌絲處于對數(shù)生長期，此時期菌絲生物量增長較快，表明此時期菌絲活力達最強。將此時期的液體菌種接于栽培料中，菌絲滿袋時間及生物轉(zhuǎn)化率均高于常規(guī)固體菌種。因此，綜合結(jié)果表明，白靈菇液體發(fā)酵菌種培養(yǎng)最適時間為5 d左右。