顯微灌注結(jié)合3D打印制作股骨頭內(nèi)動(dòng)脈鑄型標(biāo)本

張向南，鄧偉，張松強(qiáng)，王宏宇，李雷，鞠文，周廣良，居發(fā)新，周正虎，李關(guān)興，巨積輝*，侯瑞興*

1.蘇州大學(xué)附屬瑞華醫(yī)院骨科，江蘇 蘇州 215104；2.寶應(yīng)縣人民醫(yī)院骨科，江蘇 揚(yáng)州 225800

股骨頭缺血壞死是骨科難治性疾病之一，致殘率較高，每年新增病例數(shù)為15～20萬(wàn)，且以青壯年為主[1～4]。股骨頭缺血壞死主要分為兩大類(lèi)型，即創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性[5]。前者發(fā)生的主要原因?yàn)楣晒穷i骨折及醫(yī)源性引起的股骨頭的血供遭到急劇下降或中斷所致，后者主要的原因?yàn)槠べ|(zhì)類(lèi)固醇的應(yīng)用或酗酒所引起的股骨頭血供緩慢下降所致[6]?？梢?jiàn)股骨頭缺血壞死的主要原因?yàn)楣晒穷^血供減少，使骨細(xì)胞和骨髓組織的壞死，進(jìn)而繼發(fā)的骨形態(tài)學(xué)改變[7，8]。解剖學(xué)研究證實(shí)，股骨頭血供的主要來(lái)源是股骨頭支持帶動(dòng)脈，占股骨頭總血供的70%[9]。目前有關(guān)股骨頭外的動(dòng)脈研究較多且較為清楚，但對(duì)頭內(nèi)動(dòng)脈的研究較少。對(duì)于頭內(nèi)動(dòng)脈的研究，大多數(shù)采取的是影像學(xué)間接研究手段[10]。本研究通過(guò)顯微灌注頭內(nèi)動(dòng)脈后酸堿腐蝕，結(jié)合3D打印填充技術(shù)制作帶有頭內(nèi)動(dòng)脈的透明股骨頭標(biāo)本，希望能為研究股骨頭內(nèi)的血液供應(yīng)提供一個(gè)直接的研究手段。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

3例帶髖周血管的離體豬股骨頭標(biāo)本（豬齡8～12個(gè)月，平均10個(gè)月）。本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬瑞華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：RX2019003。

1.2 試劑與儀器

環(huán)氧樹(shù)脂大紅色精混合液（環(huán)氧樹(shù)脂由東莞市小馬新材料科技有限公司提供），50%NaOH溶液（NaOH固體由上海麥克林生化科技有限公司提供），10%HCl溶液（38%HCl溶液由江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司提供），顯微鏡（鎮(zhèn)江市卓創(chuàng)醫(yī)療科技公司；AC220V/50Hz），手持3D掃描儀（型號(hào)：REEYEEPRO+，南京威布三維科技有限公司生產(chǎn)），3D打印機(jī)（廣州邁普再生醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，型號(hào)：SLJ-JUPU 420）。

1.3 方法

1.3.1 分離插管 取帶有髖周血管的離體豬股骨頭標(biāo)本，肉眼下沿髖臼打開(kāi)關(guān)節(jié)囊，切斷股骨頭韌帶，去除髖臼。顯微鏡下在關(guān)節(jié)囊外尋找支持帶動(dòng)脈的起源主干血管，根據(jù)血管口徑導(dǎo)入合適的頭皮留置針并結(jié)扎，注射少量肝素稀釋液并觀察股骨頭下滋養(yǎng)孔處的靜脈是否有血液流出以驗(yàn)證插管是否成功。需要同時(shí)對(duì)后上、后下及前方3組支持帶動(dòng)脈中的3根主干動(dòng)脈進(jìn)行插管，并結(jié)扎漏血分支血管。

1.3.2 沖洗灌注 3根主干血管分別用10 ml肝素鈉稀釋液沖洗排空股骨頭內(nèi)動(dòng)脈的血液后，以適當(dāng)壓力注入環(huán)氧樹(shù)脂大紅色精混合液。過(guò)程中用止血鉗夾閉溢出鑄型劑的血管斷端，灌注結(jié)束后夾閉留置針軟管。

1.3.3 凝固及分離 灌注后的股骨頭置于常溫下凝固24 h。肉眼及顯微鏡下對(duì)股骨頭血管周?chē)M織進(jìn)行初步分離，主要去除肌肉組織，注意保護(hù)血管的完整性。

1.3.4 堿腐蝕 已初步分離的股骨頭置于50%NaoH溶液堿腐蝕6 h，腐蝕液面須沒(méi)過(guò)大轉(zhuǎn)子，小轉(zhuǎn)子以及部分股骨干，以保證股骨頭標(biāo)本軟組織徹底清除。堿腐蝕后顯微鏡下對(duì)血管周?chē)M織進(jìn)行精細(xì)分離，并沖洗清潔股骨頭表面使之光滑。在小轉(zhuǎn)子下緣下方3cm用擺鋸進(jìn)行股骨干截骨。

1.3.5 3D掃描并打印模具 堿腐蝕后的股骨頭立于掃描盤(pán)上，用手持3D掃描儀進(jìn)行3D掃描，掃描完成后，在Wiboox Reeyee-Plus軟件上去除不相關(guān)部分后生成封閉模型保存為Obj格式，在Geomagic Studio 2014軟件上進(jìn)行圈定所要打印的范圍導(dǎo)出stl格式，在Materialise Magics21.0中文版軟件上放大1.1倍并傳輸至3D打印機(jī)打印1 mm厚度的模具（圖1）。

圖1 3D掃描及打印結(jié)果1A：堿腐蝕后的實(shí)物圖1B：3D掃描結(jié)果1C：選取打印部分1D：選取的部分生成打印數(shù)據(jù)資料1E：打印的模具Fig.1 3D scanning and printing results1A:Physical drawing after alkali corrosion;1B:3D scanning results;1C:Selected the printing section;1D:Selected part to generate printing data;1E:Printed mold圖2 對(duì)股骨頭進(jìn)行倒置酸腐蝕Fig.2 Inverted acid corrosion of femoral head

1.3.6 酸腐蝕及沖洗 取兩根1.5 mm克氏針穿大轉(zhuǎn)子平行于股骨頭頭頸交界線進(jìn)行十字固定股骨頭，股骨頭倒置于250 ml燒杯中，加入10%HCl溶液，前3次液面低于頭頸交界線0.3 cm（圖2）。以后液面至頭頸交界處，每12 h進(jìn)行顯微鏡下沖洗股骨頭一次，并更換10%HCl溶液。直至股骨頭骺板及其以外完全腐蝕，大約進(jìn)行4～7個(gè)循環(huán)即可完全暴露頭內(nèi)血管（圖3）。

圖3 股骨頭酸腐蝕沖洗過(guò)程3A：堿腐蝕結(jié)果3B：酸腐蝕第1次沖洗3C：第2次沖洗3D：第3次沖洗3E：第4次沖洗3F：第5次沖洗并去除雜物Fig.3 Acid corrosion and flushing process of femoral head3A:The result of alkali corrosion;3B:The first rinse of acid corrosion;3C:The second rinse;3D:The third rinse;3E:The fourth rinse;3F:The fifth rinse and removal of impurities

1.3.7 透明股骨頭的制作 3D打印模具安裝在已腐蝕好的股骨頭上，倒置固定模具及股骨頭后，從股骨頸邊緣的模具上注入新配置的環(huán)氧樹(shù)脂液體進(jìn)行填充，靜置72 h后去除打印的模具，打磨股骨頭表面不規(guī)則區(qū)域并對(duì)股骨頭表面進(jìn)行拋光直至表面光滑顯露骨內(nèi)血管。

2 結(jié)果

2.1 股骨頭動(dòng)脈鑄型標(biāo)本清晰完整

本研究通過(guò)對(duì)離體豬股骨頭3根支持帶動(dòng)脈主干同時(shí)進(jìn)行環(huán)氧樹(shù)脂大紅色精混合液顯微灌注，酸堿腐蝕后得到完整的股骨頭內(nèi)動(dòng)脈血管網(wǎng)（圖4）。

圖4 股骨頭內(nèi)動(dòng)脈鑄型結(jié)果4A：前面觀4B：后面觀4C：斜正視觀Fig.4 Casting results of femoral head internal artery4A:Front view;4B:Back view;4C:Oblique front view

2.2 透明股骨頭完整復(fù)原了原股骨頭

應(yīng)用3D打印技術(shù)，成功制成了能清晰觀察到頭內(nèi)動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的透明股骨頭（圖5）。為進(jìn)一步研究股骨頭內(nèi)動(dòng)脈的分布規(guī)律，提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為長(zhǎng)期保存股骨頭動(dòng)脈鑄型標(biāo)本，提供了更好的保障。

圖5 股骨頭骨內(nèi)動(dòng)脈鑄型水晶標(biāo)本5A：前面觀實(shí)物照5B：3D打印模具后環(huán)氧樹(shù)脂填充5C,5D,5E：不同角度觀察股骨頭水晶標(biāo)本 5F：上面觀實(shí)物照Fig.5 Cast crystal specimen of femoral head internal artery5A:The front view of material object;5B:Epoxy resin filling after 3D printing mold;5C,5D,5E:Crystal specimens of femoral head were observed from different views;5F:The above view of material object

3 討論

3.1 股骨頭內(nèi)血管研究現(xiàn)狀

目前對(duì)于股骨頭外動(dòng)脈研究較多且較為透徹[11]，主要原因?yàn)轭^外血管較易暴露，可直視下研究。對(duì)于頭內(nèi)動(dòng)脈的研究，主要以間接方式進(jìn)行研究。湛世本等[12]通過(guò)對(duì)頭內(nèi)動(dòng)脈灌注氧化鉍鑄混合造影劑后進(jìn)行10%鹽酸脫鈣，然后對(duì)脫鈣的標(biāo)本進(jìn)行X線攝片，可獲取到頭內(nèi)血管的一般信息，但難以顯示骨內(nèi)動(dòng)脈的吻合方式、管徑大小及頭內(nèi)動(dòng)脈的三維結(jié)構(gòu)。邱興等[13，14]通過(guò)對(duì)離體豬股骨頭標(biāo)本后下支持帶動(dòng)脈顯微灌注明膠硫酸鋇懸浮液后進(jìn)行顯微CT掃描，重建了頭內(nèi)動(dòng)脈的三維結(jié)構(gòu)，使頭內(nèi)滋養(yǎng)血管的位置、大小、走行走向及分支分布一目了然。但血管的顯示存在操作難度高、灌注不良及存在偽影等不足之處。對(duì)于頭內(nèi)動(dòng)脈的直視下研究，石小田等[15]通過(guò)對(duì)骨內(nèi)動(dòng)脈灌注乙酸乙酯+環(huán)已酮-過(guò)氯乙烯鑄型填充劑后進(jìn)行堿腐蝕破壞骨小梁，然后用10%鹽酸進(jìn)行脫鈣，用手術(shù)刀打開(kāi)髓腔后觀察到骨內(nèi)血管的走行、分布及吻合，但過(guò)氯乙烯填充劑質(zhì)地較軟強(qiáng)度較小，難以保留血管原有的形態(tài)，且剝制雕刻法可能會(huì)對(duì)血管造成損傷。本研究把剝制雕刻法變?yōu)闆_洗法以減少對(duì)血管的損傷。使用環(huán)氧樹(shù)脂大紅色精混合液對(duì)骨內(nèi)動(dòng)脈鑄型，與傳統(tǒng)鑄型劑相比，環(huán)氧樹(shù)脂具有支撐性好且無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，可獲取較為堅(jiān)強(qiáng)的頭內(nèi)動(dòng)脈的立體三維結(jié)構(gòu)。使頭內(nèi)動(dòng)脈的位置、走行特點(diǎn)、分支分布及相鄰血管吻合關(guān)系等清晰可見(jiàn)，便于直視下研究，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)影像學(xué)重疊及偽影的不足。通過(guò)3D打印模具環(huán)氧樹(shù)脂填充把頭內(nèi)血管固定于環(huán)氧樹(shù)脂中便于能夠較好的保持頭內(nèi)血管的形態(tài)及標(biāo)本輪廓的真實(shí)性，為科研教學(xué)提供良好的解剖學(xué)標(biāo)本，也為長(zhǎng)期保存股骨頭動(dòng)脈鑄型標(biāo)本提供了更好的保障。

3.2 股骨頭血管研究的意義

股骨頭的血液供應(yīng)在股骨頭缺血性壞死的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，如創(chuàng)傷引起的股骨頭血供破壞、骨內(nèi)高壓所致的微血流淤滯及微血管損傷等均是造成股骨頭壞死的重要因素[16]。因此，研究股骨頭頭內(nèi)及頭外動(dòng)脈的解剖學(xué)研究對(duì)股骨頭壞死性疾病的研究非常重要。目前對(duì)于股骨頭頭內(nèi)動(dòng)脈的研究，主要認(rèn)為頭內(nèi)動(dòng)脈連接成網(wǎng)，相互溝通，且支持帶動(dòng)脈與骺動(dòng)脈網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)為股骨頭血供的重要來(lái)源[17]。經(jīng)過(guò)對(duì)股骨頭內(nèi)動(dòng)脈的鑄型研究，可獲取到股骨頭內(nèi)動(dòng)脈的立體結(jié)構(gòu)，并對(duì)頭內(nèi)動(dòng)脈的三維結(jié)構(gòu)從任意視角進(jìn)行觀察，可對(duì)頭內(nèi)血管的長(zhǎng)度，方向，吻合情況進(jìn)行定量研究。從鑄型的結(jié)果來(lái)看，股骨頭后上，后下及前方3組支持帶動(dòng)脈在頭頸交界處進(jìn)入股骨頭，每組有一支較粗的主干伴有1～2支的細(xì)小血管，支持帶動(dòng)脈進(jìn)入股骨頭后沿股骨頭的外圍走行，跨越骺板后近似垂直向股骨頭中心走行，走行中成輻射狀發(fā)出較多終末支營(yíng)養(yǎng)股骨頭外圍，在股骨頭中心股骨頭內(nèi)動(dòng)脈以主干的形式進(jìn)行吻合。這種頭內(nèi)動(dòng)脈的解剖學(xué)特點(diǎn)，保證了股骨頭內(nèi)動(dòng)脈的高度吻合性。

3.3 注意事項(xiàng)

離體帶有髖周血管的豬股骨頭標(biāo)本的選擇為越新鮮越好，最好是離體未超過(guò)24 h的豬股骨頭標(biāo)本。插管部位在旋股內(nèi)外側(cè)動(dòng)脈主干發(fā)出支持帶動(dòng)脈主干的位置，這樣就保證了股骨頭支持帶動(dòng)脈灌注的完整性。注射的壓力適當(dāng)控制以免造成動(dòng)脈破裂鑄型劑外露。鑄型劑攪拌應(yīng)遵循慢速、均勻、長(zhǎng)時(shí)間，以免產(chǎn)生氣泡影響灌注效果。鑄型劑配置后在60～90 min之間須灌注完畢，時(shí)間太短鑄型劑過(guò)稀較易流出，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致鑄型劑粘稠不利于灌注。3D打印的過(guò)程中需張貼一定的標(biāo)志點(diǎn)，以免圖像丟失后能夠快速的同步圖像。

總之，結(jié)合3D打印的顯微灌注腐蝕法能夠較好的制作透明豬股骨頭內(nèi)動(dòng)脈鑄型標(biāo)本，為以后的科研教學(xué)提供了良好的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。由于本研究樣本量較少，尚不能對(duì)豬股骨頭內(nèi)動(dòng)脈的分布規(guī)律及形態(tài)特點(diǎn)進(jìn)行歸納總結(jié)，有待后續(xù)深入研究。