分子生物學技術在綿羊毛、山羊絨鑒別中研究應用進展

費靜 陳曉 劉敏華 葛存卿 秦皓

摘 要：山羊絨、綿羊毛外觀相似，理化性質相近，這是傳統(tǒng)檢測方法無法客觀區(qū)分兩者最主要的原因。為從根本上解決這個問題， 科研人員從生命最本質的特征入手，開發(fā)了針對特種動物纖維角蛋白檢測方法，以及毛髓細胞內的遺傳物質DNA的檢測方法。文章簡述了檢測的基本原理、發(fā)展歷程、應用范圍及存在的問題，對目前存在的幾種分子生物學檢測方法作了較為系統(tǒng)的比較分析。其中，DNA檢測靈敏度高，但使用范圍受限;蛋白檢測方法較為穩(wěn)定，易于實現多種混合物的定性檢測，但靈敏度不及DNA檢測法。總之，分子生物學檢測法是傳統(tǒng)檢測法的有益補充，在其適用范圍內，可以提供客觀一致的檢測結果。

關鍵詞：羊絨;羊毛;DNA;蛋白質;鑒別

中圖分類號：TS137

文獻標志碼：A

文章編號：1009-265X（2022）01-0036-05

Abstract： Similarity between cashmere and sheep wool in appearance， physical and chemical properties are two main reasons why traditional detection methods can't distinguish them objectively. To solve this problem fundamentally， starting from the most essential characteristics of life， researchers developed a new detection method for fibrokeratin of special animals and a detection method for the genetic material DNA in medullary cells. This review provides a systematic comparative analysis of several existing molecular biological detection methods， and focuses on the basic principle， development history， application scope and existing problems of these methods. Among them， DNA detection features a high sensitivity， but a limited applicable scope. While protein analysis is more stable， and easy to achieve qualitative detection of a variety of mixtures， but its sensitivity is not as good as that of DNA detection. In conclusion， molecular biological detection methods are a good supplement to traditional methods and can provide objective and consistent results within their scope of application.

Key words： cashmere; wool; DNA; protein; identification

山羊絨因其纖細、柔軟、保暖的特點，長期占據著高檔面料原料榜首。物以稀為貴，憑借其優(yōu)異的性能和產量的稀缺性，山羊絨價格較高，利欲熏心的不法分子在山羊絨中摻入價格較低的其他纖維，如羊毛、牦牛絨等，以次充好，牟取暴利，侵害了消費者的權益[1]。美國、歐盟、日本等國均制定了相應的標簽法規(guī)，打擊以次充好，維護市場的公平公正。中國是山羊絨的主要出口國，這種欺詐行為，也有損中國羊絨生產大國的形象。這就對檢測監(jiān)管部門提出了更高的要求。過去傳統(tǒng)的檢測方法，主要從山羊絨和綿羊毛的外觀形態(tài)入手，借助顯微鏡、電鏡等放大成像設備進行鑒別[2]。纖維的染色及其他復雜的加工工藝掩蓋了鱗片厚度形態(tài)等鑒別指標，此外改性綿羊毛、拉伸羊毛、剝鱗羊毛等的摻入，進一步增加了檢測難度。這類基于外觀形態(tài)的檢測方法，準確度受限于檢測人員的經驗，結果較為主觀[3-4]。隨著計算機技術的不斷發(fā)展，以深度學習為代表的視覺成像識別技術也取得了突破性進展，研究人員建立了以AI為基礎，結合自動圖像處理技術的纖維鑒別檢測方法，實現羊毛、羊絨的自動化、智能化檢測。這一方法的特點在于重復性好，檢測效率高，但方法的準確度有賴于譜圖庫的不斷完善。

人們對生物體的認知隨著生命科學的發(fā)展已逐漸深入到微觀水平。山羊絨是山羊身上隱藏于粗毛根部的底絨，而羊毛則來自綿羊，山羊（Capra hircus）和綿羊（Ovis aries）在動物學分類上同科不同屬。既然如此，它們在分子層面一定存在著物種特異的可區(qū)分的特征。

1 脫氧核糖核酸（DNA）水平

1.1 檢測原理

DNA即脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid），是染色體主要組成成分，同時也是主要遺傳物質。每個單核苷酸又由3種比較簡單的化合物即磷酸、脫氧核糖和堿基各一分子組成。堿基有嘌呤和嘧啶兩大類，嘌呤中主要有腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G），嘧啶中主要有胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。單個脫氧核糖核酸通過磷酸二酯鍵連接形成長鏈。DNA檢測的依據是物種特異的核糖核苷酸組成排列，具有客觀、精確的特點，近年來在司法鑒定、動植物檢疫、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領域得到了廣泛的應用。檢測的基礎是PCR技術。PCR技術是一種體外模擬DNA擴增的技術，短時間內能將微量的DNA大量增加。從毛發(fā)中獲得足夠量，且比較完整能進行PCR擴增的DNA成了制約該技術發(fā)展的一個瓶頸。毛發(fā)DNA種屬鑒別長時間停滯不前，是由于過去的研究集中在細胞基因組DNA上，而基因組DNA大量集中于帶毛囊的動物纖維中，在毛干中的含量極少，一旦纖維經過染整后就難檢測到了。直到2004年印度科學家Subramanian等[5]將研究重點轉移到線粒體DNA上，大大推進了這項技術在特種動物纖維鑒別中的研究應用。

1.2 定性檢測

美國科學家hamalyn等[6]對DNA分析定性檢測特種動物纖維做了最早的嘗試。1992年，他們利用探針雜交技術，設計了特異性結合綿羊DNA的綿羊探針，從而可以區(qū)分羊毛與羊絨、馬海毛等其他纖維，但受限于當時生物技術水平，仍存在諸多缺點，無法推廣。線粒體DNA廣泛存在于皮質細胞中，每個細胞中存在多個拷貝，相較基因組DNA更容易得到。kerkhoff等[3]于2009年實現了物種特異性PCR區(qū)分鑒別羊毛、羊絨、駱駝毛、牦牛毛等纖維，實現了快速簡便的纖維定性分析，但同樣存在著無法精確定量分析混合纖維的問題。

ISO18074：2015《紡織品 DNA分析法鑒別某些特種動物纖維 山羊絨、綿羊毛、牦牛絨及其混合物》通過設計針對山羊絨、綿羊毛、牦牛絨的線粒體DNA的物種特異性引物，對經抽提純化的DNA進行PCR擴增，通過特定長度片段的電泳遷移來確認動物纖維的種類[7]。該方法實現了山羊絨、綿羊毛、牦牛絨的定性鑒別。該標準是首個利用DNA檢測進行動物纖維鑒別的標準。

1.3 定量檢測

熒光定量PCR是PCR技術的升級，可通過熒光信號實現對DNA擴增的監(jiān)控，不僅能對物種進行定性，還能進行定量。

課題組研究利用了TaqMan熒光定量PCR技術實現了山羊絨、綿羊毛的定量檢測。針對山羊絨、綿羊毛種內保守，種間差異的線粒體DNA區(qū)段設計了特異性的引物探針，通過使用已知含量的標準混合物建立定量標準曲線，實現未知樣品的檢測。收集不同產地、年齡段的山羊絨進行方法的驗證，證明了線粒體DNA的數目在動物毛發(fā)中是相對穩(wěn)定的，該定量方法具有普適性[4]。熒光定量PCR法與普通PCR相比，是閉管檢測，減少了污染因素，且能實現山羊絨、綿羊毛相對定量檢測，是一個質的飛躍。

GB/T 36433-2018《紡織品 山羊絨和綿羊毛的混合物DNA定量分析 熒光PCR法》就是該研究的應用。靈敏度高，重復性好，可檢測到1%的甚至更低的異質纖維摻入[8]。該定量方法是一種相對定量檢測，對相同組成的山羊絨、綿羊毛混合物，經過同樣的染色、后整理等處理，均能得到一致的含量檢測結果[9]。

1.4 存在的問題

DNA檢測的適用范圍有一定的限制。完整的一定量的DNA是進行PCR檢測的必要條件。對于某些過度處理，尤其經氧化剝色的纖維定量結果不準確，原因是DNA鏈不耐受強氧化劑，鏈斷裂后PCR反應無法進行。另外，山羊絨回用纖維常因多次染色，其處理程度與相混合的綿羊毛不一致，也會導致檢測結果不準確。因而GB/T 36433-2018對標準的適用范圍作了嚴格的限制。

2 蛋白水平的檢測

2.1 檢測原理

角蛋白是毛發(fā)纖維的重要組成部分[10]，DNA中存在物種差異，也會反映到表達的蛋白中。角蛋白是外胚層細胞的結構蛋白，由于角蛋白含有較多的胱氨酸，故二硫鍵含量特別多，在蛋白質肽鏈中起交聯作用，因此角蛋白化學性質特別穩(wěn)定，有較高的機械強度。由于蛋白的分子量比較大，需要溫和地將角蛋白溶解下來，通過一定的分離，找到山羊絨和綿羊毛存在物種差異的角蛋白區(qū)域，對存在物種差異的多肽片段進行檢測。

2.2 定性定量檢測

意大利科研人員率先進行了蛋白免疫反應鑒別山羊絨和綿羊毛的大膽嘗試，使用免疫小鼠產生的抗山羊的單克隆抗體進行山羊絨和綿羊毛的鑒別分析，該方法可以實現定性鑒別和粗略的定量檢測，但受限制于蛋白提取的產率和重復性，以及免疫檢測步驟的繁瑣性，未大面積推廣[11]。Sara等[12]在前人的基礎上，開發(fā)了儀器檢測蛋白指紋圖譜鑒別特種動物纖維的方法。該方法采用了液相色譜-電噴霧電離質譜 （LC-ESI-MS）作為檢測手段，兼具了液相色譜儀有效分離及質譜儀強大的組分鑒定能力。Claudia等[13]通過一系列不同產地來源的動物纖維驗證了該方法的普適性。張娟等[14-15]使用LC-MS/MS技術對羊毛羊絨鑒別的可能性開展了研究，找到了多個物種特異性的山羊絨，綿羊毛、綿羊絨的多肽片段，實現了定性檢測，為后續(xù)定量方法的開發(fā)提供了依據。

激光解吸基質輔助飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）是另一種檢測多肽的有效手段。這種新型的軟電離生物質譜技術，已經在蛋白質、多肽、核酸、寡糖等生物大分子質量測定上得到了廣泛應用，具有靈敏度高，準確度高，高通量，易于實現自動化等優(yōu)點[16]。張娟[15]考察了尿素、二硫蘇糖醇和碘乙酰胺的濃度及溫度對溶解提取動物纖維角蛋白的影響，用MALDI-TOF-MS對蛋白進行測定，在一定掃描范圍內找到物種特異性的質核比，建立了鑒別山羊絨、綿羊毛的方法，并通過脫磷、拉伸等羊毛的驗證，確認方法的可靠、客觀性。Kim等[17]用MALDI-TOF-MS分析了25個不同品種來源的山羊絨樣品和7個牦牛絨樣品的多肽片段，找到了物種特異的質核比作為定性鑒別的標記，并通過一系列實際樣品的檢測驗證了該方法的準確性。

ISO 20418提供了兩種多肽分析定性定量檢測特種動物纖維的方法。ISO 20418-1：2018利用液相色譜-電噴霧電離質譜 （LC-ESI-MS）對特種動物角蛋白多肽進行分離檢測，而ISO 20418-2：2018利用的是基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）進行多肽的定性定量檢測。兩種方法均選擇了2691、2664分別作為山羊絨，綿羊毛的特征標記。根據山羊絨、綿羊毛的特征標記（峰）進行定性。通過對已知含量的標準混合物進行測定，根據其特征峰面積或峰高，建立定量標準曲線，可實現對未知樣品的定量檢測。

這兩種方法均需要對溶解的角蛋白進行胰蛋白酶處理，使之酶解成更易檢測的多肽片段。通過對物種特性多肽短片大小的測定實現纖維的定性鑒別。不同的是第一種方法對所有的蛋白均進行了酶解處理，然后再進行分離檢測，而第二種方法先使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，回收特定的蛋白片段后再對其進行胰酶處理[18-19]。其余方法上的差異見表1。

兩個方法的定量均需要利用已知含量的混合標樣建定量標準曲線，建立起含量和物種特征的面積比之間的聯系，從而實現定量檢測。對MALDI-TOF-MS多肽分析法進行了進一步的研究，該定量方法對不同品種、不同產地的山羊絨均適用。剝鱗處理，拉伸處理均對其結果無影響，但該方法檢測剝色紫絨混合樣時發(fā)現，山羊絨檢測含量偏低，推測剝色氧化劑對多肽結構有破壞作用[20]。

2.3 存在的問題

蛋白多肽定性定量測定法，可輕松用于多種混合動物纖維的定性鑒別，特別適用于多種動物纖維混合物的定性鑒別。只要知道特征標記，即可識別其存在。若構建合適的定量模型后，也可用于3種甚至更多混合纖維的定量。但該方法的靈敏度不夠高，混合低值僅能測到5%左右[19]。此外，該方法對氧化剝色的產品也不適用。

3 結 語

回顧了特種動物纖維分子生物學水平定性定量的研究歷程和最新進展，對國內外現行的標準方法進行了比較分析?？偟膩碚f，DNA檢測儀器設備投入低，相對比較成熟，靈敏度高，但適用的范圍受限更多一些;蛋白檢測適用范圍廣，但靈敏度不高，低含量樣品無法檢測。這些方法的開發(fā)和應用，是對傳統(tǒng)檢測方法的有益補充，實現了儀器檢測，減少了主觀因素的影響，對毛紡產品的質量監(jiān)督檢驗、消費者合法權益的維護有重要意義。特種動物纖維的檢測，尤以羊毛羊絨為代表在定量檢測，到目前為止還是纖維成分鑒別的難題。綜合運用顯微鏡法和分子生物學檢測法，能得到相對準確可靠的結果。

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