基于超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質譜和網(wǎng)絡藥理學探討通脈顆粒治療腦卒中的作用機制

龐漢青, 商瀟予, 魏 曄, 丁書文, 劉 量

(1. 揚州大學醫(yī)學院, 江蘇 揚州, 225000; 2. 江蘇省中西醫(yī)結合老年病防治重點實驗室, 江蘇 揚州, 225000)

腦卒中是一種急性腦血管疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高、復發(fā)率高和病死率高等臨床特征[1]。中國人群的腦卒中發(fā)病率排在全球首位，其是導致居民死亡的首位病因[2]?！吨袊渲兄行膱蟾?020》[3]揭示，腦卒中的發(fā)病率居高不下，且發(fā)病呈年輕化趨勢。臨床證據(jù)[4]表明，與西藥治療相比，中醫(yī)藥在腦卒中防治中具有獨特優(yōu)勢。通脈顆粒由丹參、川芎和葛根共3味中藥組成，具有活血通脈之功效，臨床主要用于腦卒中、動脈硬化、心絞痛和冠心病等心腦血管疾病治療[5]。通脈顆粒具有抑制神經(jīng)炎癥、抗氧化應激和改善血液流變學等多重藥理作用[6-8]。通脈顆粒是治療腦卒中的核心中藥制劑，臨床療效確切，不良反應較小[9]。但通脈顆粒治療腦卒中的藥效成分和潛在作用機制尚不清楚，制約了其臨床應用。本研究擬采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質譜(UHPLC-QTOF-MS)技術對通脈顆粒的化學成分進行系統(tǒng)表征，并借助網(wǎng)絡藥理學對其抗腦卒中的作用途徑進行初步探討，以期更好地指導臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

通脈顆粒(批號2110009)購自葵花藥業(yè)集團(唐山)生物制藥有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純，由美國TEDIA公司提供。超純水由Mill-Q去離子水系統(tǒng)(美國密理博公司)自制，其他試劑為分析純。

1.2 主要儀器

Waters Acquity超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，含在線真空脫氣機、柱溫箱、自動進樣器、四元泵和WAD檢測器。SCIEX 4600高分辨四極桿飛行時間質譜儀(美國AB公司)。KH-500DB型數(shù)控超聲儀, Centrifuge 5425R低溫高速離心機(德國艾本德公司)。

1.3 樣品溶液制備

精密稱取1.0 g樣品至100.0 mL錐形瓶中，加入30.0 mL的75%甲醇水溶液, 100 Hz下超聲提取60 min; 冷卻至室溫, 75%的甲醇水溶液補足失重; 將提取液于13 000轉/min離心10 min, 取上清轉移至1.5 mL離心管，于-20 ℃保存待用。

1.4 UHPLC-QTOF-MS分析

液相色譜條件: 色譜柱, Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×100.0 mm, 1.8 μm); 流動相: A為乙腈, B為0.1%甲酸水溶液; 進樣量為2.0 μL; 流速為0.4 mL/min; 柱溫為40 ℃; 梯度洗脫程序如下: 0～1 min, 5% A; 1～5 min, 5%～12% A; 5～15 min, 12%～22% A; 15～22 min, 22%～38% A; 22～30 min, 38%～95% A; 30～32 min, 95% A; 32～32.1 min，95%～5% A; 32.1～35 min, 5% A。

質譜條件: 采用DIA采集模式獲得MS和MS/MS數(shù)據(jù)，正、負離子模式掃描。離子化電壓為(+)5 000/(-)4 500 V; 離子源溫度(+)500/(-)450 ℃, 接簇電壓(DP)為(+)80/(-)80 V, 碰撞能(CE)為(+)35/(-)35 V; 噴霧氣(Gas 1)為55 psi, 輔助加熱氣(Gas 2)為55 psi, 氣簾氣為35 psi。一級質譜母離子和二級質譜子離子掃描范圍均為m/z50～1 500。

1.5 通脈顆?；钚猿煞值暮Y選

將從通脈顆粒鑒定的化學成分導入中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php)。以口服生物利用度(OB)和分子類藥性(DL)為標準，篩選出OB≥30.00%且DL≥0.18的化學成分作為通脈顆粒的活性成分。此外，通過文獻檢索的方法，考慮化合物在通脈顆粒中的含量及其生物活性，篩選通脈顆?；钚猿煞帧?/p>

1.6 通脈顆粒關鍵靶點獲取

將通脈顆?；钚猿煞謱隩CMSP、PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)和PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)等數(shù)據(jù)庫進行靶點挖掘。以“Stroke” “Cerebral ischemia” “Cerebral hemorrhage”為關鍵詞，分別通過PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)、Comparative Toxicogenomics Database(CTD, http://ctdbase.org/)和Therapeutic Target Database(TTD, http://db.idrblab.net/ttd/)等數(shù)據(jù)庫篩選腦卒中相關靶點。將化合物和腦卒中靶點導入Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫對基因名稱規(guī)范處理。基于VENNY 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es)平臺繪制化合物靶點和疾病靶點的韋恩圖，獲得通脈顆粒治療腦卒中的關鍵靶點。為表征通脈顆粒治療腦卒中的關鍵功效，將通脈顆粒治療腦卒中的交集靶點導入CTD數(shù)據(jù)庫，匯總靶點對應的功效。

1.7 蛋白與蛋白交互(PPI)網(wǎng)絡建立和關鍵靶標分析

采用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)分析關鍵靶點的PPI網(wǎng)絡，物種設置為“Homo Sapiens”, 其他參數(shù)采用默認設置?；贑ytoscape 3.7.1軟件構建通脈顆粒治療腦卒中的PPI網(wǎng)絡，并采用軟件中自帶的NetworkAnalyzer工具包對PPI網(wǎng)絡的拓撲異構參數(shù)(degree、betweeness、closeness)進行分析，確定PPI網(wǎng)絡的核心靶點。

1.8 “化合物-靶點”和“靶點-功效”網(wǎng)絡構建

采用Cytoscape 3.7.1軟件分別構建“化合物-靶點”和“靶點-功效”互作網(wǎng)絡。通過分析“化合物-靶點”和“靶點-功效”網(wǎng)絡的拓撲異構參數(shù)，篩選通脈顆粒治療腦卒中的關鍵藥效成分、作用靶點和藥效。

1.9 京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析和基因本體論(GO)生物功能注釋

將上述篩選到的交集基因導入DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫，對通脈顆粒治療腦卒中的作用靶點進行KEGG通路分析和GO功能富集分析。利用RStudio軟件以氣泡圖和條形圖的形式可視化處理通脈顆粒治療腦卒中的作用通路和涉及的生物功能。

2 結 果

2.1 通脈顆粒的化學成分鑒定

采用UHPLC-QTOF-MS方法，通過文獻查詢[10-12]、數(shù)據(jù)庫匹配和標準品比對，共從通脈顆粒中鑒定出96個化合物，正離子模式下鑒定38個，負離子模式下鑒定58個。UHPLC-QTOF-MS-的總離子流圖見圖1。通脈顆粒的化學成分以黃酮類、酚酸類、丹參酮類和苯酞類為主，其中黃酮類成分39個，酚酸類成分26個，丹參酮類成分17個，苯酞類成分9個和其他類成分5個。

2.2 通脈顆粒治療腦卒中的活性成分

通脈顆粒中活性化合物的篩選不僅根據(jù)化學成分的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)行為(OB≥30%; DL≥0.18), 也綜合考慮化合物在通脈顆粒中含量高低及其生物活性。以葛根中葛根素、大豆苷和染料木素為例，盡管這3個化合物的OB值均低于30%, 但葛根素、大豆苷和染料木素是葛根指標性成分，且有明顯抗腦缺血活性[13], 因而也被確定為通脈顆?；钚猿煞?。最終篩選到通脈顆粒中38個活性成分，其中丹參16種，葛根14種和川芎8種。見表2。

表2 通脈顆粒中活性成分

2.3 通脈顆粒治療腦卒中的關鍵靶點

將篩選到的38個活性成分導入PubMed、PharmMapper和TCMSP數(shù)據(jù)庫，共檢索到通脈顆粒化學成分靶點254個。PharmGKB、CTD、TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫共查詢到腦卒中相關靶點453個。采用VENNY 2.1構建通脈顆?；瘜W成分和腦卒中靶點的韋恩圖，共得到55個通脈顆粒治療腦卒中的關鍵靶點(圖2A)。分別對丹參、川芎和葛根的作用靶點取交集，得到3味藥的交集靶點8個(圖2B), 分別為核因子κB(NFκB)、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、Toll樣受體4(TLR4)、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(BCL2)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、白細胞介素-1β(IL-1β)和缺氧誘導因子1α(HIF-1α)。

2.4 通脈顆粒治療腦卒中的關鍵靶點PPI網(wǎng)絡

關鍵靶點的PPI網(wǎng)絡圖見圖3，該PPI網(wǎng)絡共包含52個節(jié)點(node)和744條邊(edge)。以degree值大小篩選核心靶點，排在前列的靶點如下: 白細胞介素-6(IL-6, degree=38)、TLR4(degree=36)、IL-1β(degree=35)、腫瘤壞死因子(TNF, degree=34)、血管內皮生長因子(VEGF, degree=34)、信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3, degree=31)和HIF-1α(degree=30)等，這些靶點在PPI網(wǎng)絡中互作頻率較高，提示上述靶點可能是腦卒中治療的關鍵靶點。

2.5 通脈顆粒的化學成分-腦卒中靶點網(wǎng)絡分析

通脈顆?；瘜W成分-腦卒中靶點的可視化網(wǎng)絡見圖4, 該網(wǎng)絡共含有93個節(jié)點(化學成分38個，靶點55個)和353條邊。采用“NetworkAnalyzer”插件進行網(wǎng)絡分析, degree值排名前10的活性成分為: P60(丹酚酸B)、P23(葛根素)、P26(大豆苷)、P69(染料木素)、P59(大豆黃素)、P94(丹參酮ⅡA)、P5(丹參素)、P75(藁本內酯)、P82(洋川芎內酯A)和P48(芒柄花苷); 前10位靶點依次為: 前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、核因子κB(NFκB)、胱天蛋白酶3(CASP3)、核因子紅細胞系2相關因子2(NRF2)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、BCL2相關X蛋白(BAX)、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(BCL2)、腫瘤壞死因子(TNF)、誘導型一氧化氮合酶(NOS2)和VEGF(血管內皮生長因子)。以上結果表明，上述degree值較高的活性成分和靶點可能是通脈顆粒治療腦卒中的關鍵藥效成分和作用靶點。

2.6 通脈顆粒靶點-功效網(wǎng)絡分析

腦卒中的病理特征主要有神經(jīng)炎癥、神經(jīng)毒性、細胞凋亡、氧化應激、血腦屏障損傷、能量代謝紊亂等[14], 依次將這些靶點的功效歸為這些病理特征。通脈顆粒的靶點-功效網(wǎng)絡如圖5所示。通脈顆粒治療腦卒中的作用靶點主要富集在炎癥(degree=22)、凋亡(degree=16)、氧化應激(degree=13)和神經(jīng)保護(degree=11)上，尤其是神經(jīng)炎癥和細胞凋亡富集的靶點最多，提示其主要通過抗炎和抑制凋亡途徑發(fā)揮抗腦卒中的作用。

2.7 GO功能及KEGG通路富集分析

GO富集分析共得到549條生物過程(BP)、55條細胞組成(CC)和78條分子功能(MF), 排名前10位GO條目的結果見圖6。通脈顆粒治療腦卒中的關鍵靶點主要涉及細胞交互、催化活性、信號傳導、細胞遷移的正調控、細胞死亡、神經(jīng)元凋亡的調控等生物過程; 主要涉及蛋白復合物、細胞質、細胞連接、囊泡、線粒體和細胞膜等細胞組分; 主要參與蛋白結合、酶結合、信號受體結合、血紅素結合、蛋白激酶結合和轉錄因子結合等分子功能。

進一步采用KEGG通路富集分析篩選通脈顆粒治療腦卒中可能涉及的信號通路，共得到29條顯著相關的信號通路(P<0.05)。富集排名靠前的信號通路主要包括缺氧誘導因子信號通路(HIF-1 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、白細胞介素-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、松弛素信號通路(Relaxin signaling pathway)和神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路(Neurotrophin signaling pathway)等。富集因子前20位的信號通路見圖7。KEGG通路分析表明，通脈顆粒主要通過抑制神經(jīng)炎癥相關信號通路發(fā)揮治療腦卒中的作用。

3 討 論

腦中風的發(fā)病機制涉及再灌注損傷、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)細胞凋亡等復雜的缺血級聯(lián)反應，其確切發(fā)病機制尚未完全清楚[15]。目前，西醫(yī)尚無特效的治療方法，而中醫(yī)藥治療缺血性中風具有整體調節(jié)、綜合治療、標本兼顧的獨特優(yōu)勢[16]。通脈顆粒由丹參、川芎和葛根組成，其中丹參具有活血祛瘀、清心除煩的作用; 川芎具有活血化瘀、祛風燥濕和行氣止痛之功效; 葛根具有升陽透疹、解肌退熱和止瀉的作用。諸藥合用可活血、行氣和養(yǎng)血，其被廣泛用于腦卒中的臨床治療。本研究利用UHPLC-QTOF-MS結合網(wǎng)絡藥理學技術探討了通脈顆粒治療腦卒中的關鍵靶點和作用機制。

化合物-靶點網(wǎng)絡分析顯示，通脈顆粒中丹酚酸B、葛根素、大豆苷、染料木素、丹參酮ⅡA和藁本內酯等活性成分通過作用于PTGS2、NFκB、CASP3、NRF2和AKT1等靶點，在腦卒中治療中發(fā)揮重要作用。丹酚酸B和丹參酮ⅡA是丹參主要活性成分，丹酚酸B通過抑制脂質過氧化反應、清除氧自由基、促進半影區(qū)VEGF的表達等途徑，有效改善血腦屏障損傷[17]。丹參酮ⅡA能夠顯著下調BCL2相關X蛋白(BAX)、胱天蛋白酶3(Caspase-3)、胱天蛋白酶8(Caspase-8)等凋亡誘導因子的表達，抑制神經(jīng)元細胞凋亡[18]; 并可降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β和IL-6等炎癥因子的表達，進而抑制神經(jīng)炎癥，減輕細胞黏附分子和白細胞浸潤導致的腦損傷[19]。葛根素和染料木素是葛根主要藥效成分，葛根素通過抑制單核細胞因子和內皮素分泌，減少腦梗死范圍，改善腦卒中患者神經(jīng)功能缺損[20]。染料木素通過抑制Ca2+超載、減輕谷氨酸神經(jīng)毒性、上調NRF2、HIF-1α等抗氧化蛋白表達，對腦卒中有顯著預防和保護作用[21]。藁本內酯是川芎重要活性成分，可通過抑制TLR4-MAPK/NF-κB信號通路，減少炎癥相關酶及炎癥因子表達，減少缺血區(qū)腦梗死體積[22]。

KEGG富集分析結果表明，以PTGS2、TNF、VEGF、NFκB、NRF2、BAX和IL-6等為核心的通脈顆粒治療腦卒中的關鍵靶點，參與了HIF-1、TNF、PI3K-Akt、IL-17、Relaxin和Neurotrophin等信號通路。缺氧誘導因子(HIF)是機體低氧應答狀態(tài)下的關鍵轉錄因子，通過抑制氧化/硝化應激、促進血管生成等途徑改善半影區(qū)的腦梗死體積[23]。TNF-α和IL-1β、IL-6、IL-17等炎癥細胞因子具有促進腦內炎癥反應，加重腦損傷的作用[24]。PI3K-Akt通路是自噬的經(jīng)典通路，涉及神經(jīng)炎癥、內質網(wǎng)應激、氧化應激和神經(jīng)元細胞凋亡等重要生命過程，與腦卒中的發(fā)生發(fā)展密切相關[25]。Neurotrophin信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，對于促進神經(jīng)細胞存活尤為重要，可通過激活Trk受體誘導神經(jīng)遞質釋放，增強突觸可塑性[26]。PTGS2參與局部缺血后的氧化應激和炎癥反應，服用PTGS2抑制劑可增加腦卒中病死率[27]。

綜上所述，通脈顆粒中有酚酸類、苯酞類、黃酮類和丹參酮類等成分，通過作用于PTGS2、HIF-1α、NFκB、NRF2、TNF和BAX等腦卒中相關靶點，干預HIF-1、TNF和PI3K-Akt等信號通路，進而抑制神經(jīng)炎癥、降低氧化應激和調節(jié)細胞凋亡，從而改善腦卒中癥狀。本研究從化學成分表征、靶點、功效、生物功能和信號通路等多角度探討通脈顆粒治療腦卒中的藥效成分和作用機制，可為通脈顆粒的臨床應用和二次開發(fā)提供參考。