套袋蘋果果實質(zhì)地及其顯微結(jié)構(gòu)與果面裂紋的關(guān)系

黃晶淼，王金鑫，李建明，索相敏，郝 婕，李學(xué)營

(河北省農(nóng)林科學(xué)院石家莊果樹研究所，石家莊 050061)

中國蘋果(Malusdomestica)產(chǎn)量居世界首位[1]，河北省作為蘋果主產(chǎn)區(qū)之一，富士系蘋果占栽培面積的70%左右，產(chǎn)量占62.29%。但是，河北平原區(qū)經(jīng)常出現(xiàn)蘋果果實裂紋現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在果實成熟前，其果肩部、胴部、萼洼部易出現(xiàn)網(wǎng)狀或波紋狀的褐色裂紋，不僅影響果實外觀品質(zhì)，而且也會成為病原菌侵害果實的途徑之一，引起其他病害，導(dǎo)致果實腐爛，貨架期縮短，市場競爭力降低、果農(nóng)收入削減[2]。果實裂紋現(xiàn)象在櫻桃、棗、石榴等果樹上也均有發(fā)生[3-5]，其誘發(fā)因素包括氣候環(huán)境、果園管理、果實表型特征、遺傳等，即使在相同果園管理和環(huán)境條件下，不同品種果實易裂程度與果實的硬度、果皮強度、角質(zhì)膜性質(zhì)之間也存在一定相關(guān)性[6]。

目前，蘋果果實裂紋的研究多集中于針對一個品種，外施赤霉素、細胞分裂素等生長調(diào)節(jié)劑及Ca2+抑制劑對裂紋的調(diào)控作用[7-8]，或果膠含量和相應(yīng)酶活性、擴展蛋白基因表達在果實成熟過程中的變化[9-10]，多個不同易裂度品種間相關(guān)指標的比較鮮有報道。有研究表明，果實質(zhì)地及組織力學(xué)性能與果實裂紋密切相關(guān)[11-12]。質(zhì)構(gòu)儀能客觀、準確地描述蘋果果實質(zhì)地[13]。本研究以親緣關(guān)系較近、果實易裂程度不同的蘋果品種(系)作為兩組試驗材料，利用質(zhì)構(gòu)儀測定果實質(zhì)地，同時利用光學(xué)顯微鏡觀察果實顯微結(jié)構(gòu)，采取主成分結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析果實質(zhì)地、顯微結(jié)構(gòu)與裂紋之間的關(guān)系，以期為蘋果裂紋的形成機制探討及抗裂紋品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為栽植于同一果園、套白色單層紙袋、果面裂紋程度不同的4個蘋果品種(系)：著色富士系‘天紅2號’和短枝富士后代優(yōu)系4-1-103，不著色姊妹系‘冀蘋4號’和‘冀蘋5號’。每個品種(系)分別選擇3株生長發(fā)育狀況良好且長勢一致的樹，從盛花后132 d起，每隔8～13 d調(diào)查1次果實裂紋發(fā)生情況。于盛花后185 d從每株試驗樹上采集3個果實帶回實驗室4 ℃保存?zhèn)溆?，果實狀態(tài)如圖1所示。

A.天紅2號；B.4-1-103；C.冀蘋4號；D.冀蘋5號圖1 不同品種(系)蘋果盛花后185 d果實A. Tianhong 2; B. 4-1-103; C. Jiping 4; D. Jiping 5Fig.1 Fruits of different apple cultivars (series) on 185 days after full bloom

1.2 測定指標及方法

1.2.1 果實裂紋率和裂紋指數(shù)每個品種(系)隨機掛牌固定100個果實，觀察果肩部、胴部、萼洼部裂紋發(fā)生情況并分級。分級標準：果面光滑，未出現(xiàn)裂紋為0級，果面裂紋面積占總面積<10%為1級，10%～20%為2級，20%～40%為3級，40%～60%為4級，>60%為5級[14]。依據(jù)調(diào)查結(jié)果按照如下公式計算裂紋率和裂紋指數(shù)。

裂紋率=裂紋的果數(shù)/調(diào)查總果數(shù)×100%

裂紋指數(shù)=∑(各級裂紋果數(shù)×裂紋級數(shù))/(調(diào)查總果數(shù)×最高級數(shù))

1.2.2 果實質(zhì)地用美國Food Technology Corporation公司生產(chǎn)的TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀測定果實質(zhì)地，于盛花后185 d，每株試驗樹隨機選取3個果實，每個果實陰陽面各測1次。選用P/2柱狀探頭(直徑2 mm)，從果肩處進行整果穿刺法測定果皮破裂前形變量、果皮硬度、果肉硬度等，儀器參數(shù)為：試驗測試速度100 mm/min，觸發(fā)力0.50 N，穿刺距離10.00 mm[15]。用直徑為1.50 cm的打孔器在果肩處打孔，切取高度為5.00 mm的果肉圓柱體，選用P/75探頭(直徑75 mm)，質(zhì)地多面分析法(texture profile analysis，TPA)測定果肉脆裂性、硬度、彈性等，儀器參數(shù)為：力感應(yīng)量程250 N，受壓形變量60%，測試速度60 mm/min，觸發(fā)力0.20 N[16]。

1.2.3 果實顯微結(jié)構(gòu)在果肩部分別取果皮(長寬各5 mm)、果肉(長寬厚各5 mm)放入FAA固定液中固定24 h，制作石蠟切片，在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照[17-18]。采用ImageJ軟件測量角質(zhì)膜厚度、表皮細胞面積、維管束直徑和果肉間隙率等指標。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用SPSS 22.0進行方差分析，獨立樣本T檢驗和單因素ANOVA比較差異顯著性，用SPSSPRO進行主成分和灰色關(guān)聯(lián)度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種(系)蘋果果實裂紋發(fā)生情況比較

2.1.1 裂紋率和裂紋指數(shù)由圖2可知，‘天紅2號’和‘冀蘋4號’果實均于盛花后142 d開始出現(xiàn)裂紋，‘冀蘋5號’和4-1-103則分別于盛花后161 和174 d開始出現(xiàn)裂紋。在盛花后132～185 d，不同品種(系)蘋果果實裂紋率均有升高趨勢，且‘天紅2號’裂紋率始終明顯高于同期優(yōu)系4-1-103，‘冀蘋4號’裂紋率始終明顯高于同期的姊妹系‘冀蘋5號’?！旒t2號’和‘冀蘋4號’裂紋高發(fā)期分別出現(xiàn)于盛花后150～185 d和142～174 d，均于盛花后185 d裂紋率達最大值，分別為81.82%和66.67%；4-1-103和‘冀蘋5號’裂紋率均于174 d才有明顯升高趨勢，最大值僅分別為2.50%和17.50%。

圖2 不同品種(系)蘋果果面裂紋率變化Fig.2 Changes of percentage of cracking in different apple cultivars (series)

同時，圖3顯示，在盛花后142～185 d，‘天紅2號’和‘冀蘋4號’裂紋指數(shù)表現(xiàn)出升高的趨勢，分別由0.25、0.20增加至1.88、1.27；優(yōu)系4-1-103在盛花后174 d為0.03，其余時間均為0，‘冀蘋5號’在盛花后174～185 d僅由0.27增加至0.30，其余時間均為0。在同一調(diào)查時間點，4-1-103和‘冀蘋5號’的裂紋指數(shù)分別顯著低于‘天紅2號’和‘冀蘋4號’?？梢?，‘天紅2號’和‘冀蘋4號’果實裂紋出現(xiàn)早、裂紋指數(shù)高，而4-1-103和‘冀蘋5號’果實裂紋出現(xiàn)遲、裂紋指數(shù)很低。

*表示同期品種(系)間在0.05水平內(nèi)存在顯著性差異(P<0.05)圖3 不同品種(系)蘋果果面裂紋指數(shù)變化*indicate significant difference between cultivars (series) during the same period at 0.05 level (P<0.05)Fig.3 Changes of cracking index in different apple cultivars (series)

2.1.2 不同部位裂紋變化由圖4可以看出，‘天紅2號’和‘冀蘋4號’果肩部裂紋率始終高于胴部和萼洼部，均于盛花后185 d達最大值，分別為45.45%和61.11%?！旒t2號’萼洼部和胴部裂紋分別主要發(fā)生于盛花后142～161 d和161～185 d，裂紋率分別于161 d和185 d達最大值，分別為10.00%和31.81%?！教O4號’胴部于盛花后150 d出現(xiàn)裂紋，裂紋率于盛花后174 d達最大值(10.00%)，其萼洼部未發(fā)現(xiàn)裂紋。

圖4 ‘天紅2號’(A)和‘冀蘋4號’(B)果實不同部位裂紋率變化Fig.4 Changes of percentage of cracking in different parts of ‘Tianhong 2’(A) and‘Jiping 4’(B) fruit

2.2 不同品種(系)蘋果果實質(zhì)地比較

由表1可知，整果穿刺法測試得到的果皮破裂前形變量、果皮硬度、果肉硬度、果皮果肉硬度比在‘冀蘋4號’與其低裂紋姊妹系‘冀蘋5號’之間均無顯著差異，果皮破裂前形變量在‘天紅2號’與其低裂紋優(yōu)系4-1-103之間也無顯著差異，而其余3個指標均表現(xiàn)為‘天紅2號’顯著小于其低裂紋優(yōu)系4-1-103。TPA得到的果肉彈性在各品種(系)之間均無顯著性差異，果肉脆裂性、硬度均表現(xiàn)為‘天紅2號’顯著小于低裂紋優(yōu)系4-1-103，‘冀蘋4號’顯著小于其低裂紋姊妹系‘冀蘋5號’，即易裂紋品種果肉脆裂性和硬度均顯著小于不易裂紋品種。雖然，‘冀蘋4號’與‘冀蘋5號’ 果肉硬度在整果穿刺法中無顯著性差異，但在TPA中有顯著差異，且TPA能更精細地反映果肉質(zhì)地差異，整果穿刺法是果肉質(zhì)地的補充測定方式[19]。

表1 不同品種(系)蘋果果實質(zhì)地特性

2.3 不同品種(系)蘋果果實顯微結(jié)構(gòu)比較

2.3.1 果皮及果肉細胞的形態(tài)特征蘋果果實從外向內(nèi)由角質(zhì)膜細胞、表皮細胞和果肉細胞組成。從不同品種(系)蘋果果皮及果肉細胞的光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)圖(圖5)可以看出：角質(zhì)膜呈透明狀態(tài)；表皮細胞位于角質(zhì)膜與果肉細胞之間，有5～7層，靠近角質(zhì)膜的表皮細胞呈長卵圓形，靠近果肉細胞的表皮細胞呈不規(guī)則圓形；內(nèi)層的果肉細胞，比角質(zhì)膜和表皮細胞大，其細胞間分布有維管束。不同品種(系)蘋果間果皮和果肉細胞形態(tài)亦存在明顯差異，易發(fā)生裂紋品種‘冀蘋4號’和‘天紅2號’角質(zhì)膜有“V”型凹陷，深入表皮細胞，與其鑲嵌，并發(fā)生龜裂；表皮細胞排列疏松、無規(guī)則；果肉細胞間隙和維管束均較大。而不易發(fā)生裂紋品種(系)‘冀蘋5號’和4-1-103角質(zhì)膜平滑且保存完整；表皮細胞排列緊實有規(guī)則，果肉細胞間隙和維管束相對較小。

2.3.2 果皮顯微結(jié)構(gòu)不同品種(系)蘋果果皮顯微結(jié)構(gòu)觀測結(jié)果(表2)顯示，‘冀蘋4號’表皮厚度顯著大于其低裂紋姊妹系‘冀蘋5號’，表皮細胞長寬比和表皮細胞密度均顯著小于‘冀蘋5號’；‘天紅2號’的角質(zhì)膜厚度、表皮細胞長、表皮細胞長寬比和表皮細胞間隙率均顯著大于低裂紋優(yōu)系4-1-103，而表皮細胞面積和表皮細胞密度則顯著小于4-1-103?？梢姡琢鸭y蘋果品種果實表皮細胞密度顯著小于不易裂紋品種。

表2 不同品種(系)蘋果果皮顯微結(jié)構(gòu)的指標比較

A-D.果皮；E-H.果肉；A、E.‘冀蘋4號’；B、F.‘冀蘋5號’；C、G.‘天紅2號’；D、H.4-1-103；1. 角質(zhì)膜；2. 表皮細胞；3. 果肉細胞圖5 不同品種(系)蘋果果皮及果肉細胞的光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)A-D. Skin; E-H. Flesh; A,E.‘Jiping 4’; B,F.‘Jiping 5’; C,G.‘Tianhong 2’; D,H.4-1-103; 1. Cutin membrane; 2. Epidermal cell; 3. Flesh cellFig.5 Microstructure of skin and flesh cells in different apple cultivars (series)

2.3.3 果肉顯微結(jié)構(gòu)由不同品種(系)蘋果果肉顯微結(jié)構(gòu)的8個相關(guān)細胞指標(維管束直徑、維管束數(shù)量、果肉細胞密度和果肉細胞間隙率等)觀測結(jié)果(表3)可知，‘冀蘋4號’果肉細胞面積、細胞長、細胞寬和細胞間隙率均顯著大于其低裂紋姊妹系‘冀蘋5號’；‘天紅2號’果肉細胞間隙率和維管束直徑均顯著大于低裂紋優(yōu)系4-1-103，果肉細胞面積和細胞寬均顯著小于4-1-103。說明易裂紋蘋果品種果肉細胞間隙率顯著大于不易裂品種。

表3 不同品種(系)蘋果果肉顯微結(jié)構(gòu)的指標比較

2.4 蘋果果實質(zhì)地和顯微結(jié)構(gòu)與果肩裂紋指數(shù)關(guān)系

2.4.1 果實質(zhì)地與果肩裂紋指數(shù)關(guān)系各品種(系)蘋果質(zhì)地特性指標的主成分分析結(jié)果(表4)表明，前2個主成分因子方差累積貢獻率達89.750%，主成分1和2的特征根分別為3.347和2.935，即前2個主成分因子已經(jīng)代表了全部指標的主要信息。其中，主成分1解釋了7個指標47.810%的變化，結(jié)合主成分因子載荷矩陣熱力圖(圖6)可明顯看出果肉硬度、TPA果肉硬度和果肉脆裂性因子載荷系數(shù)較高，是主成分1的主要相關(guān)指標；主成分2解釋了7個指標41.940%的變化，主要與果皮果肉硬度比相關(guān)。

表4 質(zhì)地特性主成分因子載荷系數(shù)及方差貢獻率

圖6 質(zhì)地特性主成分因子載荷矩陣熱力圖Fig.6 The heat map of principal component factor load matrix of texture characteristics

同時，將不同品種(系)蘋果質(zhì)地特性指標與果肩裂紋指數(shù)進行灰色關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果(表5)顯示果皮破裂前形變量與果肩裂紋指數(shù)關(guān)聯(lián)度最高(0.990)，且果肉彈性、果皮果肉硬度比和果肉硬度3個指標與果肩裂紋指數(shù)的關(guān)聯(lián)度也均高于0.900，對果肩裂紋指數(shù)有較大影響力。兩種方法綜合分析結(jié)果表明，果肉硬度和果皮果肉硬度比是解釋果面裂紋的主要相關(guān)指標。

表5 質(zhì)地特性與果肩裂紋指數(shù)灰色關(guān)聯(lián)度分析

2.4.2 果實顯微結(jié)構(gòu)與果肩裂紋指數(shù)關(guān)系各品種(系)蘋果顯微結(jié)構(gòu)指標主成分分析結(jié)果(表6)顯示，3個主成分因子方差累積貢獻率達100%，主成分1、2和3的特征根分別為7.366、5.756和2.878，3個主成分因子已經(jīng)代表了全部指標的主要信息。其中，主成分1解釋了16個指標46.040%的變化，結(jié)合主成分因子載荷矩陣熱力圖(圖7)可明顯看出果肉細胞面積、果肉細胞寬和果肉細胞長因子載荷系數(shù)較高，是主成分1的主要相關(guān)指標；主成分2解釋了16個指標35.980%的變化，主要與果肉細胞間隙率和維管束直徑相關(guān)；主成分3解釋了16個指標17.990%的變化，主要與果肉細胞密度相關(guān)。

表6 顯微結(jié)構(gòu)指標主成分因子載荷系數(shù)及方差貢獻率

圖7 顯微結(jié)構(gòu)指標主成分因子載荷矩陣熱力圖Fig.7 The heat map of principal component factor load matrix of microstructure

同時，將不同品種(系)蘋果顯微結(jié)構(gòu)指標與果肩裂紋指數(shù)進行灰色關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果(表7)表明果肉細胞間隙率、表皮細胞間隙率與果肩裂紋指數(shù)關(guān)聯(lián)度均達1.000，維管束數(shù)量、果肉細胞長寬比和表皮細胞長寬比3個指標與果肩裂紋指數(shù)關(guān)聯(lián)度均為0.999，它們對果肩裂紋指數(shù)均有較大影響力。兩種方法綜合分析表明，果肉細胞間隙率是解釋果面裂紋的主要相關(guān)指標。

表7 顯微結(jié)構(gòu)指標與果肩裂紋指數(shù)灰色關(guān)聯(lián)度分析

3 討 論

果面裂紋主要發(fā)生在果實生長中后期[20]，不同品種之間易裂程度存在差異[21]。本研究中，‘天紅2號’和‘冀蘋4號’蘋果果面裂紋高發(fā)期分別在盛花后150～185 d和142～174 d，均為生長中后期；兩組試驗材料組內(nèi)比較，‘天紅2號’出現(xiàn)裂紋的時間比優(yōu)系4-1-103早32 d， ‘冀蘋4號’比其姊妹系‘冀蘋5號’早19 d；‘天紅2號’和‘冀蘋4號’裂紋出現(xiàn)時間早，持續(xù)時間長，發(fā)生程度較4-1-103和‘冀蘋5號’更嚴重。

Galvez等[22]認為即使親本及其后代個體或姊妹系間的果實質(zhì)地也存在差異。本研究中，兩組試驗材料均為易裂紋品種的果肉脆裂性、果肉硬度顯著小于不易裂品種。有關(guān)棗裂果機制的研究中也表明，果肉硬度與裂果指數(shù)呈顯著負相關(guān)[12]。同時，本研究進一步的主成分結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析表明，果皮果肉硬度比是解釋蘋果果面裂紋的主要相關(guān)指標，吳建陽等[23]也認為果皮果肉力學(xué)強度不平衡，會導(dǎo)致果面裂紋的發(fā)生。

顯微結(jié)構(gòu)差異性是果實裂紋的重點關(guān)注內(nèi)容之一。魏欽平等[24]研究了不同地區(qū)‘喬納金’蘋果果皮解剖結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)果面光潔、低裂紋果實的角質(zhì)膜不是最厚也不是最薄，認為角質(zhì)膜厚度不是評價裂紋率的標準；而Fogelman等[25]通過研究‘粉紅女士’噴施赤霉素和細胞分裂素混合物后果實裂紋和細胞顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)果面裂紋率降低、角質(zhì)膜變厚，認為角質(zhì)膜厚度與裂紋率呈負相關(guān)。本研究中，‘天紅2號’果實角質(zhì)膜厚度顯著大于其優(yōu)系4-1-103，但姊妹系‘冀蘋4號’和‘冀蘋5號’的角質(zhì)膜厚度無顯著性差異，從而認為果實角質(zhì)膜厚度與其裂紋率不是密切相關(guān)。魏欽平等[24]關(guān)注不同環(huán)境條件引起的果實裂紋差異，F(xiàn)ogelman等[25]觀察外施生長調(diào)節(jié)劑對一個品種果實裂紋的影響，本研究則比較不同品種間的果實裂紋差異，且試驗材料不同，因此材料和試驗自變量不同可能是導(dǎo)致結(jié)果不一致的原因。但研究結(jié)果普遍支持果實角質(zhì)膜保存完整、平滑均一、不發(fā)生龜裂、無“V”型凹陷，且表皮及果肉細胞排列緊實有規(guī)則的品種較耐裂的觀點[26-27]。本研究中耐裂紋的品種(系)4-1-103和‘冀蘋5號’角質(zhì)層完整，表皮和果肉細胞排列緊實，表皮細胞密度顯著大于易裂紋的‘天紅2號’和‘冀蘋4號’，果肉細胞間隙率顯著小于‘天紅2號’和‘冀蘋4號’。由此推測，細胞間隙率小，細胞密度大，細胞壁增加，引起鈣、果膠、纖維素和相應(yīng)酶等細胞壁組分變化，從而增強了果實抗裂能力[10,23]，不同品種間細胞壁組分與裂紋的關(guān)系有待后續(xù)試驗驗證。

細胞間的空隙度和細胞形態(tài)特征對果肉硬度和脆度有很大程度的影響。本研究中，親緣關(guān)系較近的著色系‘天紅2號’和4-1-103，不著色姊妹系‘冀蘋4號’和‘冀蘋5號’兩組內(nèi)比較，果實裂紋率與果肉脆裂性、硬度呈負相關(guān)，與果肉細胞間隙率呈正相關(guān)，果肉細胞間隙率與果肉脆裂性、硬度呈負相關(guān)，主成分和灰色關(guān)聯(lián)度分析也表明果肉硬度和細胞間隙率是解釋果面裂紋的主要相關(guān)指標，這與李紅光[28]和HOU等[29]的研究一致。但是，4個蘋果品種(系)同時比較發(fā)現(xiàn)，果實裂紋率表現(xiàn)為‘天紅2號’>‘冀蘋4號’>‘冀蘋5號’>4-1-103，果肉脆裂性和硬度表現(xiàn)為‘冀蘋5號’>‘冀蘋4號’>4-1-103>‘天紅2號’，果肉細胞間隙率表現(xiàn)為‘天紅2號’>‘冀蘋4號’>4-1-103>‘冀蘋5號’，并不是一一對應(yīng)的正負相關(guān)，推測跟親本遺傳和果實著色有關(guān)[30]，今后需進一步研究果實連續(xù)發(fā)育過程中相關(guān)的酶和基因效應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究通過觀察套白色單層紙袋著色富士系‘天紅2號’和短枝富士后代優(yōu)系4-1-103，以及不著色姊妹系‘冀蘋4號’和‘冀蘋5號’4個蘋果品種(系)生長發(fā)育過程中裂紋率和裂紋指數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)‘天紅2號’和‘冀蘋4號’果面裂紋率和裂紋指數(shù)始終高于4-1-103和‘冀蘋5號’，且其裂紋主要部位發(fā)生在果肩部。果實質(zhì)地特性和顯微結(jié)構(gòu)觀測結(jié)果顯示，易裂紋的‘天紅2號’和‘冀蘋4號’角質(zhì)膜有“V”型凹陷，并發(fā)生龜裂；耐裂紋的4-1-103和‘冀蘋5號’角質(zhì)膜完整，果肉脆裂性、果肉硬度和表皮細胞密度均顯著大于‘天紅2號’和‘冀蘋4號’，果肉細胞間隙率顯著小于‘天紅2號’和‘冀蘋4號’。主成分結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析發(fā)現(xiàn)，果肉硬度、果皮果肉硬度比和果肉細胞間隙率是解釋果面裂紋的主要相關(guān)指標。因此，果實角質(zhì)膜完整均一、果肉硬度大、果肉細胞間隙率小的蘋果品種不易發(fā)生裂紋。