儲(chǔ)存溫度對(duì)單瓣和重瓣紫斑牡丹花粉活力及生理特性的影響

趙 萍，唐 紅*，劉興宇，何麗霞

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，蘭州 730070；2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；3 甘肅省牡丹工程研究中心，蘭州 730046)

紫斑牡丹(Paeoniarockii)為芍藥科芍藥屬落葉小灌木，是中國(guó)重要的觀賞植物與油料作物之一，同時(shí)還具有抗寒、抗旱、耐瘠薄等特性[1]。紫斑牡丹花香，花瓣基部具紫斑，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)盛，抗旱、抗寒、抗病、耐土壤瘠薄，具有很高的觀賞及育種價(jià)值[2]。在甘肅主要分布于甘肅南部、定西、蘭州等地?！笱腊住ǖS白色，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，花香，結(jié)實(shí)品質(zhì)良好，是臨夏、臨洮等地傳統(tǒng)品種[1]。

花粉粒的體積很小，具有很強(qiáng)的耐干燥性，特別適合儲(chǔ)存，是種質(zhì)資源保存的重要材料之一；雜交是牡丹培育新優(yōu)品種的主要途徑，特別是遠(yuǎn)距離雜交和遠(yuǎn)緣雜交，需要解決時(shí)空不遇和延長(zhǎng)花粉壽命等問(wèn)題，以便與合適的母體進(jìn)行雜交[3-5]。牡丹花粉的儲(chǔ)存和萌發(fā)率的測(cè)定有助于制定適宜的雜交方案，蓋偉玲等[6]通過(guò)研究4個(gè)牡丹品種的花粉在固體培養(yǎng)基萌發(fā)的情況，認(rèn)為培養(yǎng)6 h左右是計(jì)算牡丹花粉萌發(fā)率的適宜時(shí)期。紫斑牡丹單朵花壽命極短，有研究表明，單朵花從開(kāi)放到衰老僅有7～10 d，因其開(kāi)花時(shí)間的短暫性，花粉壽命也極為短暫，對(duì)雜交育種極為不利[7-9]。篩選適合‘象牙白’花粉儲(chǔ)存的適宜方案是延長(zhǎng)花粉壽命，解決遠(yuǎn)距離雜交的唯一途徑。此外，重瓣牡丹的結(jié)實(shí)性能更為低下，對(duì)其育種和油用價(jià)值產(chǎn)生了很大的影響，制約了牡丹產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展[6]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，由于溫度和水分的脅迫，花粉萌發(fā)率及壽命與花粉貯存期間活性氧的清除機(jī)制及膜脂過(guò)氧化水平有關(guān)，花粉保護(hù)酶活性、丙二醛和蛋白質(zhì)含量保持穩(wěn)定是花粉保持高活力的生理特征[10]。保護(hù)酶活性、MDA和蛋白質(zhì)含量的高低可以反映花粉的健康程度，與花粉壽命及生活力具有密切關(guān)系，是花粉萌發(fā)力的直接表現(xiàn)[5,11]。目前，有關(guān)紫斑牡丹的研究主要集中在引種栽培[12]、遺傳學(xué)[7]、油用性能[13]等方面。關(guān)于其單瓣與重瓣花花粉結(jié)構(gòu)、萌發(fā)特性和儲(chǔ)存生理機(jī)制方面的系統(tǒng)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以甘肅省蘭州市榆中縣官灘溝紫斑牡丹培育基地紫斑牡丹‘象牙白’花粉為材料，觀測(cè)了單瓣和重瓣紫斑牡丹花粉的形態(tài)結(jié)構(gòu)、不同儲(chǔ)存條件下的壽命，及其儲(chǔ)存期間3種保護(hù)酶活性、MDA和蛋白質(zhì)的含量，以期確定‘象牙白’花粉經(jīng)濟(jì)、最佳的儲(chǔ)存溫度，探討單瓣和重瓣‘象牙白’花粉壽命與花粉保護(hù)酶活性、MDA以及蛋白質(zhì)含量的相關(guān)性，解析其花粉壽命在不同儲(chǔ)存環(huán)境下降低的生理機(jī)制，為紫斑牡丹重瓣不育性和雜交育種提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 花粉采集

紫斑牡丹‘象牙白’花粉采自甘肅省蘭州市榆中縣官灘溝紫斑牡丹培育基地，于 2021年6月中上旬9:00-11:00，采集同一株牡丹植株上同時(shí)具有單瓣與重瓣的將開(kāi)未開(kāi)的紫斑牡丹花朵，按單重瓣分別標(biāo)號(hào)，迅速放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室中將采回花朵的花萼與外輪花瓣剝?nèi)?，倒扣在硫酸紙上，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)散粉，24 h后取出，一只手用鑷子夾住倒置的花朵，另一只手輕彈花朵，收集散落的花粉。將收集好的花粉每個(gè)編號(hào)各分成兩份，一份用于花粉萌發(fā)的測(cè)定；另一份 30 ℃ 鼓風(fēng)干燥箱干燥 24 h 后，分裝至 10 mL 帶蓋離心管中儲(chǔ)存，寫(xiě)好標(biāo)簽，備用。

1.2 花粉儲(chǔ)存

將1.1中所得干燥花粉分成7份，每份分裝于2 mL帶蓋離心管中，加入1～2粒硅膠干燥劑后封口，分別存放于室溫(25 ℃)、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃下儲(chǔ)存。從儲(chǔ)存之日算起，分別于7、21、60、120、190 d后，分別從4個(gè)儲(chǔ)存溫度處理中取單瓣和重瓣花粉各1份(-20、-80 ℃下取出的花粉于35 ℃水浴5～10 min解凍)，取出一部分花粉采用前期實(shí)驗(yàn)所得最適培養(yǎng)基[14]測(cè)定花粉萌發(fā)率，統(tǒng)計(jì)花粉儲(chǔ)存壽命，另一部分用于測(cè)定生理生化指標(biāo)。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 花粉超微結(jié)構(gòu)將完全干燥的花粉均勻撒在貼有雙面膠的樣品臺(tái)上，在掃描電鏡下觀察拍照，記錄花粉粒極軸長(zhǎng)(P)、赤道長(zhǎng)(E)、萌發(fā)溝長(zhǎng)、萌發(fā)溝寬、脊寬度和網(wǎng)眼直徑，每個(gè)樣品隨機(jī)測(cè)量10個(gè)以上，并計(jì)算平均值。

1.3.2 花粉萌發(fā)率和花粉壽命花粉萌發(fā)培養(yǎng)基由蔗糖、硼酸和瓊脂配制而成。用移液管吸取所需用量加入容量瓶中，加蒸餾水定容后加熱至沸騰，冷卻至 30 ℃。用吸管吸取培養(yǎng)液，滴在載玻片上，待其凝固后，蘸取花粉均勻播種在液滴上，將播種有花粉的載玻片放在鋪有吸水紙的培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在(25±1) ℃ 、全光照下培養(yǎng) 6 h 后于顯微鏡下觀察。取 4 個(gè)視野，數(shù)取花粉總數(shù)及萌發(fā)數(shù)，計(jì)算萌發(fā)率。統(tǒng)計(jì)時(shí)，以花粉管長(zhǎng)度等于或大于花粉直徑者為萌發(fā)。每個(gè)儲(chǔ)存處理設(shè) 3 個(gè)重復(fù)。

花粉萌發(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)/觀察花粉數(shù)×100%。

1.3.3 花粉可溶性蛋白質(zhì)、丙二醛含量及保護(hù)酶活性準(zhǔn)確稱取0.100 g‘象牙白’花粉，放入4 ℃預(yù)冷研缽中，加入 2 mL 0.05 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.0)，勻速研磨 30～40 s，之后將研磨液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，定容至刻度線。將提取液于10 000 r/min、4 ℃離心 20 min，取出上清液作為提取粗酶液，保存至4 ℃冰箱備用待測(cè)?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)法、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用可見(jiàn)光分光光度法、丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法、超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法、過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法，通過(guò)天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司提供的試劑盒測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010、SPSS 24和Origin 2021進(jìn)行作圖與方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單瓣和重瓣花形態(tài)與花粉表觀特征比較

紫斑牡丹‘象牙白’花粉粒為長(zhǎng)橢圓形，兩端逐漸收縮呈截形；花粉粒的3個(gè)萌發(fā)溝基本到達(dá)兩端，極面觀為近圓形或三角形，網(wǎng)眼直徑大小不等，多為橢圓形、近圓形或不規(guī)則形。其中，單瓣‘象牙白’花瓣白色，花粉數(shù)多(圖 1，A、B)；花粉粒有3個(gè)萌發(fā)溝，是孢粉學(xué)研究的原始類型；花粉粒平均極軸長(zhǎng)為50.98 μm(47.07～57.34 μm)，平均赤道軸長(zhǎng)為23.51 μm(21.73～26.69 μm)，極軸長(zhǎng)(P)/赤道軸長(zhǎng)(E)≈2.18，萌發(fā)溝長(zhǎng)44.60 μm(40.10～ 50.16 μm)，萌發(fā)溝寬1.24 μm(0.71～2.19 μm)，網(wǎng)眼直徑1.39 μm(0.99～2.04 μm)，脊寬度0.68 μm(0.45～0.81 μm)(圖 1，C-F)。重瓣‘象牙白’花瓣為白色，花粉較少，部分雄蕊瓣化為花瓣(圖 1，G、H)?；ǚ哿Ｓ?個(gè)萌發(fā)溝，萌發(fā)溝幾乎達(dá)到兩級(jí)，是孢粉學(xué)研究的原始類型；花粉粒平均極軸長(zhǎng)為43.79 μm(39.63～48.00 μm)，平均赤道軸長(zhǎng)為23.42 μm(19.31～24.83 μm)，P/E≈1.88，萌發(fā)溝長(zhǎng)為44.60 μm(31.80～45.45 μm)，萌發(fā)溝寬1.24 μm(0.87～3.10 μm)，網(wǎng)眼直徑1.39 μm(0.96～1.71 μm)，脊寬度0.68 μm(0.51～0.92 μm)(圖 1，I-L)。另外，‘象牙白’畸形花粉長(zhǎng)在 10～40 μm 之間，總體觀不飽滿、空癟，多為勺狀、三棱狀、不規(guī)則狀等，單瓣和重瓣‘象牙白’畸形花粉分別約占觀察花粉總數(shù)的 20.50%和 35.40%。

A-F.單瓣花；G-L.重瓣花；A、G花形態(tài)；B、H.花粉群體；C、I.赤道面觀；D、J.萌發(fā)溝；E、K.極面觀；F、L.萌發(fā)溝細(xì)部圖1 單瓣和重瓣‘象牙白’花形態(tài)與花粉表觀特征A-F. Single flower; G-L. Double flower; A,G. The flower morphology; B,H. Pollen grain; C,I. Polar morphology; D,J. Germinal furrow; E,K. Equatorial morphology; F,L. Fine parts of germinating furrowFig.1 Flower characteristics and pollen grain morphology of single-petal and double-petal ‘Xiangyabai’

2.2 儲(chǔ)存溫度對(duì)單、重瓣花花粉壽命的影響

圖2顯示，新鮮紫斑牡丹‘象牙白’花粉萌發(fā)率表現(xiàn)為單瓣花高于重瓣花，單瓣和重瓣新鮮花粉萌發(fā)率分別為83.62%和72.06%。隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，單瓣和重瓣花花粉萌發(fā)率均逐漸下降，且總體呈現(xiàn)先快后慢的趨勢(shì)。隨著儲(chǔ)存溫度的降低，單瓣和重瓣花花粉萌發(fā)率均逐漸增加，且單瓣花在溫度處理間的差異更大。其中，在室溫條件下，花粉萌發(fā)率下降最快，這可能是較高溫度下呼吸作用較強(qiáng)，消耗了較多的營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致花粉很快喪失了萌發(fā)力。在儲(chǔ)存第21天前，花粉萌發(fā)率下降極為迅速，之后下降速度減緩；在第120天，單瓣和重瓣花花粉萌發(fā)率均降為0。即室溫條件下單瓣和重瓣花花粉壽命為120 d。在4 ℃儲(chǔ)存條件下，花粉萌發(fā)率下降呈現(xiàn)先快后慢的趨勢(shì)，第60天為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，單瓣花和重瓣花花粉的半衰期分別為40和60 d，半衰期前花粉活力下降較為迅速，之后逐漸減緩。在 -20 ℃儲(chǔ)存條件下，花粉萌發(fā)率下降呈現(xiàn)先緩后快的趨勢(shì)，第21天為分界點(diǎn)；單瓣和重瓣花花粉半衰期均為120 d。在-80 ℃儲(chǔ)存條件下，花粉萌發(fā)率下降速度最慢，單瓣花和重瓣花花粉萌發(fā)率在儲(chǔ)存190 d后分別為76.39%和65.17%，分別降低為最開(kāi)始的96.17%和90.44%?？梢?jiàn)，儲(chǔ)存溫度極大地影響著紫斑牡丹花粉萌發(fā)率，低溫有助于延長(zhǎng)花粉的儲(chǔ)存壽命，4種儲(chǔ)存溫度中-80 ℃最適合花粉的中長(zhǎng)期儲(chǔ)存,單瓣花花粉對(duì)低溫的適應(yīng)性高于重瓣。

不同小寫(xiě)字母表示同一溫度不同儲(chǔ)存時(shí)間0.05水平差異顯著性，下同圖2 不同儲(chǔ)存溫度下單瓣(A)和重瓣(B)‘象牙白’花粉萌發(fā)率的變化The different normal letters mean significant difference at 0.05 level among different storage time at the same temperature, the same as belowFig.2 Pollen germination rate of single-petal (A) and double-petal (B) ‘Xiangyabai’ under different storage temperatures

2.3 儲(chǔ)存溫度對(duì)單、重瓣花花粉可溶性蛋白含量的影響

從圖 3 可以看出，新鮮單瓣花花粉可溶性蛋白含量高于相應(yīng)的重瓣花花粉。各溫度處理下單瓣和重瓣花花粉可溶性蛋白含量均先下降后增加，并多在第21天達(dá)到最低值，之后隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，花粉可溶性蛋白含量逐漸增加。在儲(chǔ)存190 d時(shí)，單瓣和重瓣花花粉可溶性蛋白含量均隨著儲(chǔ)存溫度的降低而下降。其中，單瓣和重瓣花花粉蛋白質(zhì)含量在-80 ℃儲(chǔ)存條件下均較為穩(wěn)定，相較于其他溫度條件波動(dòng)幅度較?。辉谑覝貤l件下，花粉可溶性蛋白含量變化幅度最大。單瓣花花粉可溶性蛋白含量增速在室溫條件下最快，在4 ℃條件下較快，在第190天時(shí)分別已增加為初始值的3.59和1.75倍；而在-20 ℃和-80 ℃條件下增速較慢，第190天時(shí)仍低于初始值。重瓣花花粉可溶性蛋白含量在室溫條件下增速最快，在4 ℃條件下增速較快，于第190天時(shí)達(dá)到最高值，分別增加為初始值的3.31和2.60倍；在-20 ℃條件下，花粉可溶性蛋白含量于第60天時(shí)最高，為初始值的3.13倍；-80 ℃條件下，可溶性蛋白含量增速最慢，第190天時(shí)為初始值的1.63倍。由此可見(jiàn)，單瓣花花粉可溶性蛋白含量變化在4 ℃、-20 ℃和-80 ℃條件下趨勢(shì)較重瓣花更為穩(wěn)定，說(shuō)明單瓣花花粉受低溫脅迫影響的程度更??；但在常溫條件下，重瓣花花粉可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)比單瓣花花粉更為穩(wěn)定。

圖3 不同儲(chǔ)存溫度下單瓣(A)和重瓣(B)‘象牙白’花粉可溶性蛋白含量的變化Fig.3 Soluble protein contents in pollen of single-petal (A) and double-petal (B) ‘Xiangyabai’ under different storage temperatures

2.4 不同儲(chǔ)存條件對(duì)單重瓣花花粉 MDA 含量的影響

從圖 4 可知，新鮮紫斑牡丹‘象牙白’單瓣花花粉MDA含量低于重瓣花花粉；低溫儲(chǔ)存條件下，單瓣和重瓣花花粉MDA含量均隨儲(chǔ)存時(shí)間先增加后減少，但重瓣花花粉受低溫脅迫的影響較單瓣花花粉更小。其中，單瓣和重瓣花花粉MDA含量在室溫條件、-20 ℃和-80 ℃下均于儲(chǔ)存第21天達(dá)到最高峰，此時(shí)分別為初始值5.36倍和5.18倍、4倍和3.89倍、3倍和3.27倍。單瓣和重瓣花花粉MDA含量在4 ℃條件下均于第60天時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)分別為初始值的4倍和5.06倍。單瓣和重瓣花花粉MDA含量在室溫條件下變化最為顯著，相較而言均在-80 ℃條件下較為穩(wěn)定。

圖4 不同儲(chǔ)存溫度下單瓣(A)和重瓣(B)‘象牙白’花粉MDA含量的變化Fig.4 Malondial delyde content in pollen of single-petal (A) and double-petal (B) ‘Xiangyabai’ under different storage temperatures

2.5 儲(chǔ)存溫度對(duì)單、重瓣花花粉3種保護(hù)酶活性的影響

2.5.1 SOD 活性圖 5 顯示，新鮮紫斑牡丹‘象牙白’單瓣花花粉SOD活性低于重瓣花花粉。在室溫條件下，單瓣和重瓣‘象牙白’花粉SOD活性隨著儲(chǔ)存時(shí)間均呈現(xiàn)逐漸快速下降的趨勢(shì)，在第120天(花粉萌發(fā)率為0)時(shí)分別降為最高值的19.80%和16.39%；相較之下，重瓣花花粉SOD活性下降較單瓣花花粉更為迅速，單瓣花和重瓣花花粉SOD活性在190 d時(shí)分別為初始值的4.9%和2.1%。在4 ℃和-20 ℃條件下，單瓣花和重瓣花花粉SOD活性均先增加后減少，在第21天時(shí)達(dá)到最高峰，這可能與花粉萌發(fā)率的急速下降有關(guān)。在-80 ℃條件下，單瓣與重瓣花花粉SOD活性均呈現(xiàn)先緩慢增加后逐漸下降的趨勢(shì)，總體變化趨勢(shì)相較平穩(wěn)，在190 d后均保持在較高水平，而此時(shí)的花粉萌發(fā)率也相對(duì)較高?？傮w來(lái)看，重瓣花花粉SOD活性受低溫脅迫的影響大于單瓣花花粉。

圖5 不同儲(chǔ)存溫度下單瓣(A)和重瓣(B)‘象牙白’花粉SOD活性的變化Fig.5 Superoxide dismutase activity in pollen of single-petal (A) and double-petal (B) ‘Xiangyabai’ under different storage temperatures

2.5.2 POD活性從圖 6可知，新鮮紫斑牡丹‘象牙白’單瓣花花粉POD活性低于重瓣花花粉。單瓣和重瓣‘象牙白’花粉POD活性在不同儲(chǔ)存溫度下隨著時(shí)間的變化趨勢(shì)不同，并在室溫條件下變化趨勢(shì)最顯著，在-80 ℃條件下變化趨勢(shì)最為平緩；花粉POD活性在室溫、4 ℃和-20 ℃條件下均表現(xiàn)為先增加后降低，均在第21天達(dá)到最高值，在-80 ℃條件下先降低后增加，在第60天達(dá)到最低值。其中，第190天時(shí)，單瓣和重瓣花花粉POD活性在室溫、4 ℃和-20 ℃條件下分別為最高值的13.62%和17.99%、23.91%和33.30%、40.43%和54.98%；單瓣和重瓣花花粉POD活性在-80 ℃儲(chǔ)存第60天時(shí)達(dá)到最低值，此時(shí)分別降為最高值的38.13%和62.30%?？梢?jiàn)，各溫度條件下重瓣花花粉POD活性隨著儲(chǔ)存時(shí)間的變化較單瓣花花粉更為平緩，其受低溫脅迫的影響較單瓣花花粉更小。

圖6 不同儲(chǔ)存溫度下單瓣(A)和重瓣(B)‘象牙白’花粉POD活性的變化Fig.6 Peroxidase activity in pollen of single-petal (A) and double-petal (B) ‘Xiangyabai’ under different storage temperatures

2.5.3 CAT活性從圖 7 來(lái)看，新鮮紫斑牡丹‘象牙白’單瓣花花粉CAT活性低于重瓣花花粉。各溫度下單瓣和重瓣花花粉CAT活性隨著儲(chǔ)存時(shí)間的變化趨勢(shì)總體相近，但不同溫度下的CAT活性存在顯著性差異。其中，單瓣和重瓣花花粉CAT活性均在-80 ℃條件下變化幅度最小，在第60天時(shí)分別降為最高值的60.24%和70.51%；均在室溫條件下變化幅度最大，單瓣和重瓣花花粉最高值分別為最低值的5.09和4.14倍。重瓣花花粉CAT活性在低溫儲(chǔ)存過(guò)程中相較于單瓣花花粉更為穩(wěn)定。單瓣花花粉CAT活性在室溫、-20 ℃和-80 ℃條件下均先降低后增加，均在第60天達(dá)到最低值，而4 ℃條件下呈現(xiàn)增加-降低-增加的趨勢(shì)。重瓣花花粉CAT活性在室溫、4 ℃、-20 ℃條件下均呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢(shì)，在-80 ℃條件下為持續(xù)下降趨勢(shì)?？梢?jiàn)，在4種溫度儲(chǔ)存條件下，兩種花粉CAT活性變化幅度均在室溫條件下最大，均在-80 ℃條件下更為穩(wěn)定，且單瓣花花粉CAT活性受低溫脅迫的影響較重瓣更為明顯。

圖7 不同儲(chǔ)存溫度下單瓣(A)和重瓣(B)‘象牙白’花粉CAT活性的變化Fig.7 Pollen catalase activity in pollen of single-petal (A) and double-petal (B) ‘Xiangyabai’ under different storage temperatures

3 討 論

3.1 單瓣和重瓣花粉萌發(fā)率與儲(chǔ)存溫度的關(guān)系

室溫條件下的環(huán)境溫度較高且濕度較大，花粉的呼吸作用以及生理代謝活動(dòng)較強(qiáng)，導(dǎo)致花粉細(xì)胞失水嚴(yán)重，從而使花粉的生活力降低，最終使花粉的儲(chǔ)藏壽命縮短。而低溫干燥環(huán)境條件能夠抑制花粉的代謝活動(dòng)，降低酶活性和呼吸作用，從而減緩花粉生活力下降的速度。也有研究認(rèn)為低溫、低濕以及低氧的環(huán)境能夠延長(zhǎng)花粉的儲(chǔ)藏壽命[15]。低溫儲(chǔ)存是生物材料長(zhǎng)期保存最有前途的方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于作物、水果、蔬菜和觀賞植物[16]?；ǚ垡蝮w積很小而比較適用于儲(chǔ)存，單瓣花花粉與重瓣花花粉的儲(chǔ)存時(shí)間也不盡相同，且花粉壽命在自然條件下僅有9 d左右，適宜的儲(chǔ)存條件可以有效延長(zhǎng)花粉壽命，為日常雜交育種提供較高活力的花粉，滿足育種工作的各種需求，因此篩選適宜的花粉儲(chǔ)存條件具有重要的意義。研究表明，芍藥屬植物花粉壽命的長(zhǎng)短受多方面因素的制約，一是基因型的控制，基因型的差異嚴(yán)重影響花粉的壽命；二是花粉含水量，低含水量是延長(zhǎng)花粉壽命的有效措施[17-18]。除此之外，儲(chǔ)存環(huán)境對(duì)于花粉的壽命也尤為重要，低溫、干燥和低氧的環(huán)境可有效延長(zhǎng)花粉壽命。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)不同儲(chǔ)存溫度處理的紫斑牡丹花粉萌發(fā)率較新鮮花粉均有不同程度的降低，室溫儲(chǔ)存的花粉壽命僅有120 d，4 ℃和-20 ℃只適用于花粉的短期保存，而-80 ℃條件下儲(chǔ)存190 d的花粉仍有較高活性和萌發(fā)率，適用于花粉的長(zhǎng)期保存。而單瓣與重瓣花花粉的壽命也不同，單瓣花花粉對(duì)低溫的適應(yīng)性高于重瓣花花粉。

3.2 花粉萌發(fā)率與其可溶性蛋白質(zhì)含量的關(guān)系

蛋白質(zhì)是花藥發(fā)育過(guò)程中積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其作為細(xì)胞組成中重要的代謝物質(zhì)和能源物質(zhì)，對(duì)于花藥和小孢子的正常發(fā)育都極為重要[19]。曾乃燕等[20]對(duì)水稻研究的結(jié)果認(rèn)為低溫下可溶性蛋白含量的增加，可能是由于降解速率下降或合成的加強(qiáng)?？扇苄缘鞍缀渴侵匾臐B透調(diào)節(jié)物質(zhì)，一定量的可溶性蛋白能提高細(xì)胞的保水能力，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜的作用。本研究中紫斑牡丹單瓣和重瓣花花粉在儲(chǔ)存第21天可溶性蛋白含量達(dá)到最低，這可能與花粉前期的活力快速下降有關(guān)，儲(chǔ)存21 d后可溶性蛋白含量逐漸增加，溫度越高增加越快，這可能與花粉對(duì)不同溫度脅迫下產(chǎn)生了抗逆蛋白有關(guān)，抗逆蛋白一旦在植物體內(nèi)形成，植物體就會(huì)盡快適應(yīng)外界環(huán)境，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗逆性[21]。紫斑牡丹單瓣花花粉在4 ℃、-20 ℃和-80 ℃條件下受低溫脅迫的程度比重瓣花更小,重瓣花花粉在常溫條件下受到的脅迫程度比單瓣花更小，這可能與兩類花粉本身的遺傳基因有關(guān)。

3.3 花粉萌發(fā)率與丙二醛含量和抗氧化酶活性的關(guān)系

MDA是膜脂過(guò)氧化的一個(gè)重要指標(biāo)，在花粉發(fā)育時(shí)期的大量積累會(huì)使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞或損傷, 從而引起細(xì)胞內(nèi)生理生化代謝的紊亂。MDA含量的高低代表細(xì)胞質(zhì)膜透性的強(qiáng)度，與其是否受到傷害具有密切的相關(guān)性[22]。本研究中紫斑牡丹單瓣和重瓣花花粉MDA含量均在各溫度下儲(chǔ)存第21天之前快速上升，在第21天達(dá)到高峰，而花粉活力也在同一時(shí)間段快速下降，這說(shuō)明花粉細(xì)胞膜受到嚴(yán)重的破壞或損傷，膜脂過(guò)氧化程度較高[23]?；ǚ跰DA含量在室溫條件下變化程度最為顯著，說(shuō)明在高溫高濕條件下細(xì)胞受到破壞程度更大，而花粉MDA含量變化在-80 ℃儲(chǔ)存時(shí)較為平和，花粉萌發(fā)率下降速度極慢，可能是花粉細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶的協(xié)同作用有效地清除了多余的活性氧，重新達(dá)到氧化平衡。同時(shí)，植物花粉在利用氧的過(guò)程中會(huì)形成活性氧，這些活性氧會(huì)對(duì)植物本身產(chǎn)生毒害作用，從而會(huì)發(fā)生體內(nèi)相關(guān)組織的生理生化代謝紊亂的現(xiàn)象，SOD、POD、CAT等抗氧化酶可以幫助清除植物體內(nèi)積累的過(guò)剩有氧自由基，防止活性氧過(guò)度積累而造成膜質(zhì)受損。研究表明，保護(hù)酶活性一定程度上是生物體機(jī)能維持的重要指標(biāo)[24-25]。生物材料貯存過(guò)程中形成的活性氧引起的氧化應(yīng)激是造成細(xì)胞損傷，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要原因之一，也可能是不同貯存環(huán)境花粉壽命差異明顯的原因之一[26]。保護(hù)酶活性的穩(wěn)定與花粉保存質(zhì)量具有相關(guān)性，保護(hù)酶活性的大幅增加或降低可能預(yù)示著植物材料萌發(fā)率的下降[27]，在本研究花粉萌發(fā)率下降最快期間，花粉細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化加劇，活性氧、自由基增多，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)、脅迫加劇，3 種保護(hù)酶不足以消除細(xì)胞內(nèi)積累的活性氧，導(dǎo)致有害物質(zhì)積累，花粉細(xì)胞死亡，花粉萌發(fā)率隨之下降。-80 ℃儲(chǔ)存條件下，紫斑牡丹花粉3種保護(hù)酶活性在不同時(shí)間階段均保持較為平穩(wěn)，花粉萌發(fā)率接近新鮮花粉萌發(fā)率，這說(shuō)明-80 ℃儲(chǔ)存環(huán)境使花粉基本處于代謝平衡狀態(tài)，健康程度高，因此花粉仍然具有較高的萌發(fā)力。

4 結(jié) 論

紫斑牡丹‘象牙白’重瓣花花粉平均極軸長(zhǎng)、平均赤道軸長(zhǎng)、極軸長(zhǎng)/赤道軸長(zhǎng)均小于單瓣花花粉，其萌發(fā)溝長(zhǎng)和寬、脊寬度和網(wǎng)眼直徑與單瓣花花粉區(qū)別不大。紫斑牡丹花粉小粒、癟粒和畸形是導(dǎo)致其萌發(fā)率較低的主要原因，不同生存環(huán)境下花粉遺傳特性存在差異，僅花粉表觀不足以揭示其系統(tǒng)演化規(guī)律。儲(chǔ)存溫度直接影響紫斑牡丹‘象牙白’花粉壽命，室溫適合單瓣和重瓣花花粉1～120 d的短期儲(chǔ)存，4 ℃、-20 ℃適合花粉較長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存，-80 ℃適合花粉的長(zhǎng)期儲(chǔ)存。在室溫、4 ℃和-20 ℃儲(chǔ)存期間，單瓣和重瓣花粉可溶性蛋白含量顯著降低后再增高，抗逆蛋白的形成是花粉萌發(fā)率下降速率減緩的主要原因；花粉MDA含量和3種抗氧化酶SOD、POD、CAT活性隨著儲(chǔ)存時(shí)間顯著變化，清除活性氧自由基能力下降，細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度加劇，細(xì)胞損傷加重是花粉萌發(fā)率在儲(chǔ)存期間下降的主要原因?；ǚ墼?80 ℃儲(chǔ)存條件下基本處于代謝平衡狀態(tài)，健康程度較高，在長(zhǎng)期儲(chǔ)存后仍然具有較高的萌發(fā)力。重瓣花花粉受到低溫脅迫的影響程度高于單瓣花花粉，在相同儲(chǔ)存條件下相較于單瓣花花粉，重瓣花花粉細(xì)胞受損程度更高、萌發(fā)率下降速率更快。