膀胱癌關(guān)鍵基因的篩選及預(yù)后相關(guān)性分析

高 鑫 張淑芳

（1. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570208；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院（清華大學(xué)醫(yī)學(xué)部）研究生院，北京 100005；3.吉首大學(xué)附屬第四醫(yī)院懷化市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 懷化 418000）

膀胱癌是男性的第四大常見癌癥，也是全球女性的第7位常見的實(shí)體瘤[1]。近年來，膀胱癌發(fā)病率仍有不斷上升趨勢(shì)，而且具有較高的復(fù)發(fā)率。在膀胱癌中非肌肉浸潤性膀胱癌約占75%，其中約80%的患者在初始治療后5年內(nèi)復(fù)發(fā)；另25%為肌肉浸潤性膀胱癌，即使在進(jìn)行根治性膀胱切除術(shù)后，該類患者的預(yù)后仍然很差[2]。膀胱癌局部浸潤轉(zhuǎn)移是膀胱癌復(fù)發(fā)和致死的重要原因[3]。然而，膀胱癌發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)的機(jī)制仍不完全清楚，因此，探討膀胱癌細(xì)胞凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲所涉及的分子機(jī)制對(duì)于膀胱癌預(yù)防、診斷和治療具有重要價(jià)值?；蛐酒卜Q微陣列，近年來得到了極大發(fā)展，現(xiàn)已成為腫瘤機(jī)制研究的新方法。GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫是龐大的基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，可以提供大量具有挖掘價(jià)值的高質(zhì)量芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)集。本研究中我們先通過GEO數(shù)據(jù)庫發(fā)掘具有研究價(jià)值的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，篩選與膀胱癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的差異基因并取交集，得到共同差異基因，然后借助DAVID在線分析工具對(duì)共同差異基因進(jìn)行功能及通路富集分析，并通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein protein interaction network，PPI網(wǎng)絡(luò)）來篩選關(guān)鍵基因，最后通過Oncomine數(shù)據(jù)庫和GEPIA在線分析工具分別對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)分析和預(yù)后分析，旨在了解所篩選的關(guān)鍵基因在膀胱癌中的作用和預(yù)后意義，為尋找膀胱癌治療靶點(diǎn)和藥物開發(fā)提供重要參考。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)的獲取 在GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中使用關(guān)鍵詞“bladder cancer”檢索膀胱癌相關(guān)的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集，挑選按照正常組織和膀胱癌組織分組的數(shù)據(jù)集，下載它們的基因表達(dá)譜矩陣文件，同時(shí)下載相應(yīng)數(shù)據(jù)集的平臺(tái)文件。在得到原始矩陣文件后使用Perl語言將基因ID與平臺(tái)文件的Gene symbol進(jìn)行轉(zhuǎn)換，得到含有國際標(biāo)準(zhǔn)化基因名的表達(dá)矩陣，以便于后續(xù)差異基因分析。

1.2 差異基因篩選 使用R語言軟件3.5.0（http://bioconductor.org/biocLite.R）對(duì)兩套數(shù)據(jù)集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后通過R語言limma包（http://www.bioconductor.org/）對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行差異基因篩選，并繪制韋恩圖（Venn diagram），取交集，得到兩個(gè)數(shù)據(jù)集共同差異表達(dá)的基因。差異基因篩選條件設(shè)置為矯正P值（djustP）＜0.05且取|log2FC|＞1，其中FC為變化倍數(shù)（fold change）。

1.3 差異基因GO和KEGG通路富集分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫6.7版（https://david.ncifcrf.gov/）這一目前常用的基因功能注釋數(shù)據(jù)庫，將所得的共同差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，GO分析分為生物學(xué)過程（biological process，BP）、 分 子 功 能（molecular function，MF）和細(xì)胞組分（cellular component，CC）3個(gè)部分。分析完成后下載分析結(jié)果進(jìn)行后續(xù)分析處理，結(jié)果均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因挑選 使用STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）分析蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系。將共同差異基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，下載分析結(jié)果數(shù)據(jù)，使用Cytoscape 3.6.1對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，按照度數(shù)（degree）、貼近度（closeness）和中介度（betweenness）條件篩選各自的排名前10位的基因，最后取交集，得到同時(shí)出現(xiàn)在3個(gè)篩選條件排名前10位的基因即為關(guān)鍵基因[4]。

1.5 關(guān)鍵基因的膀胱癌表達(dá)分析 基于癌癥基因組 圖 譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中膀胱癌標(biāo)準(zhǔn)化的mRNA表達(dá)值計(jì)算關(guān)鍵基因在膀胱癌和正常組織的表達(dá)差異。通過t檢驗(yàn)估計(jì)P值并通過錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）進(jìn)一步校正。

1.6 關(guān)鍵基因與膀胱癌患者的預(yù)后分析 在得到關(guān)鍵基因后需要進(jìn)一步了解其在臨床的預(yù)后意義，以便于分析其在臨床的應(yīng)用價(jià)值。預(yù)后分析采用由北京大學(xué)開發(fā)的GEPIA在線分析工具（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）分 析，該分析工具可將TCGA數(shù)據(jù)庫和基因-組織表達(dá)（genotype-tissue expression，GTEx）項(xiàng)目的數(shù)據(jù)聯(lián)合起來分析。采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，應(yīng)用Log Rank法比較生存率，可信區(qū)間為95%，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 獲取的芯片數(shù)據(jù) 在GEO數(shù)據(jù)庫中按照研究條件選擇GSE37815數(shù)據(jù)集和GSE65635數(shù)據(jù)集，正常組織一共10個(gè)樣本，腫瘤組織一共26個(gè)樣本。GSE37815的平臺(tái)為GPL6102，GSE65635的平臺(tái)為GPL14951，見表1。

表1 GEO數(shù)據(jù)集信息

2.2 差異基因的篩選 在對(duì)兩個(gè)表達(dá)譜數(shù)據(jù)集標(biāo)準(zhǔn)化后，按照djustP＜0.05且|log2FC|＞1條件篩選各個(gè)數(shù)據(jù)集的差異基因。GSE37815數(shù)據(jù)集共得到780個(gè)差異基因，其中包括247個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，533個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。GSE65635數(shù)據(jù)集共得到1 759個(gè)差異基因，其中包括773個(gè)高表達(dá)基因，986個(gè)低表達(dá)基因。通過繪制Venn圖篩選兩個(gè)數(shù)據(jù)集共同差異基因，共同上調(diào)表達(dá)差異基因?yàn)?13個(gè)，共同下調(diào)表達(dá)差異基因?yàn)?74個(gè)，見圖1。

圖1 GSE37815和GSE65635共同差異基因篩選

2.3 共同差異基因GO功能和KEGG通路分析通過使用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)共同差異基因進(jìn)行GO功能注釋，選擇BP、CC和MF 3個(gè)部分各自排名前5位的富集項(xiàng)目，發(fā)現(xiàn)共同差異基因在BP中主要富集在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖（regulation of cell proliferation），CC中主要富集在質(zhì)膜（plasma membrane），MF中主要富集在細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合（cytoskeletal protein binding）。GO前15個(gè)富集結(jié)果見圖2。KEGG通路富集主要涉及的前5位的通路有黏著斑通路（focal adhesion）、血管平滑肌收縮（vascular smooth muscle contraction）、緊密連接（tight junction）、細(xì)胞周期（cell cycle）和補(bǔ)體-凝血級(jí)聯(lián)（complement and coagulation cascades），見圖3。

圖2 共同差異基因排名前15位的GO功能富集結(jié)果

圖3 共同差異基因KEGG通路富集

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析和關(guān)鍵基因篩選 利用STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)共同差異基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析后，使用Cytoscape 3.6.1軟件按照度數(shù)、貼近度和中介度3個(gè)條件篩選各自前10位的基因，然后取交集，得到4個(gè)關(guān)鍵基因，分別為血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα[topoisomerase(DNA) Ⅱ alpha ，TOP2A]、細(xì)胞周期蛋白 B1（cyclin B1，CCNB1）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（actin α 2, α-smooth muscle actin，ACTA2），見表2。PPI網(wǎng)絡(luò)見圖4。

表2 3個(gè)篩選條件下得到的4個(gè)關(guān)鍵基因

圖4 共同差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)（劃線標(biāo)記為關(guān)鍵基因所在位置）

2.5 關(guān)鍵基因的表達(dá)分析 CCNB1和TOP2A在膀胱癌組織中顯著高表達(dá)（FDR分別為0.000 32和0.000 045）；ACTA2在膀胱癌中顯著低表達(dá)（FDR=0.008 7）；VEGFA在膀胱癌中的表達(dá)與正常組織相比差異并無顯著性（FDR=0.83），見圖5。

圖5 關(guān)鍵基因在膀胱癌組織和正常組織中表達(dá)的分析結(jié)果

2.6 關(guān)鍵基因與膀胱癌患者預(yù)后相關(guān)性分析 采用GEPIA在線分析工具分析，根據(jù)4個(gè)關(guān)鍵基因分別在膀胱癌中表達(dá)的中位值，將膀胱癌患者分為201例高表達(dá)患者和201例低表達(dá)患者，分別分析這些基因在膀胱癌中的預(yù)后作用，從而了解關(guān)鍵基因在膀胱癌患者臨床預(yù)后判斷中的應(yīng)用價(jià)值。該分析工作的數(shù)據(jù)來源和臨床資料均來自于TCGA數(shù)據(jù)庫。分析結(jié)果顯示，4個(gè)關(guān)鍵基因中有2個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后相關(guān)，分別為ACTA2（P=0.007 6）和VEGFA（P=0.019 0），見圖6。

圖6 關(guān)鍵基因ACTA2（A）和VEGFA（B）的表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后分析

3 討 論

膀胱癌是一種常見的惡性腫瘤，具有高侵襲性和高復(fù)發(fā)率，往往導(dǎo)致患者預(yù)后較差。生物信息學(xué)是一門計(jì)算機(jī)與醫(yī)學(xué)結(jié)合的綜合性學(xué)科，在近年隨著基因芯片技術(shù)的迅速發(fā)展和大數(shù)據(jù)時(shí)代的來臨而得到廣泛應(yīng)用。膀胱癌基因水平的生物信息學(xué)分析可以對(duì)該疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的研究提供新的角度。

在本研究中，我們使用GEO數(shù)據(jù)庫中的膀胱癌微陣列數(shù)據(jù)集GSE37815和GSE65635篩選出了兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的共同差異基因。在GO分析中我們發(fā)現(xiàn)，共同差異基因在BP中主要富集在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，CC中主要富集在質(zhì)膜，MF中主要富集在細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，提示這些差異基因主要影響膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移功能。KEGG分析主要涉及的前5位的通路有黏著斑通路、血管平滑肌收縮、緊密連接、細(xì)胞周期和補(bǔ)體-凝血級(jí)聯(lián)。黏著斑是一種具有將肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和整聯(lián)蛋白鏈接并與細(xì)胞外基質(zhì)鏈接的質(zhì)膜相關(guān)大分子集合，在維持細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)過程中的張力以及細(xì)胞生存的信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用。眾多研究表明，黏著斑相關(guān)結(jié)構(gòu)分子參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[7-9]。Kong等[10]研究表明，黏著斑激酶可參與膀胱癌侵襲和遷移的致癌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。緊密鏈接在人體中不僅起到屏障作用，還可控制離子和溶質(zhì)的細(xì)胞旁擴(kuò)散，在維持細(xì)胞間黏附作用和組織完整性方面發(fā)揮重要作用[11]。緊密連接蛋白1（tight junction protein 1，TJP1）是一種膜相關(guān)蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞接觸中發(fā)揮作用。Tsai等[12]發(fā)現(xiàn)，TJP1高水平表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良顯著相關(guān)，敲低TJP1基因表達(dá)可導(dǎo)致膀胱癌T24細(xì)胞的生長和侵襲能力顯著降低。以往的研究同樣發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體-凝血級(jí)聯(lián)通路在膀胱癌發(fā)展中發(fā)揮了調(diào)控作用[13-14]。綜上所述，我們篩選的共同差異基因主要通過影響?zhàn)ぶ咄贰⒀芷交∈湛s、緊密連接、細(xì)胞周期和補(bǔ)體-凝血級(jí)聯(lián)通路參與了膀胱癌細(xì)胞的生長周期調(diào)控和膀胱癌的進(jìn)展，本研究結(jié)果有助于我們進(jìn)一步了解膀胱癌進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制。

此外，我們還通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出4個(gè)關(guān)鍵基因VEGFA、TOP2A、CCNB1和ACTA2。生存分析發(fā)現(xiàn)，ACTA2和VEGFA的表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后相關(guān)。VEGFA能夠促進(jìn)血管新生，在血管生成中的功能最明確，占有最重要的地位[15]。Pignot等[16]的研究結(jié)果提示，VEGFA在膀胱癌組織中高表達(dá)，T3～T4期膀胱腫瘤和VEGFA過度表達(dá)的患者最有可能從抗血管生成療法中受益。VEGFA是一種很有前景的治療靶點(diǎn)，因而可能是肌肉浸潤性膀胱癌的良好預(yù)后因素。本研究的定量分析結(jié)果顯示，VEGFA在膀胱癌組織中的表達(dá)水平是高于正常組織的，但差異無顯著性，可能是由于本研究使用了更為嚴(yán)格的FDR校正的P值。TOP2A是一種在轉(zhuǎn)錄過程中控制和改變DNA拓?fù)錉顟B(tài)的酶。Kim等[17]發(fā)現(xiàn)TOP2A的增強(qiáng)表達(dá)與非肌肉浸潤性膀胱癌的高復(fù)發(fā)率和進(jìn)展率呈正相關(guān)，TOP2A可能成為非肌肉浸潤性膀胱癌的預(yù)后監(jiān)測(cè)標(biāo)志物。但TOP2A在膀胱癌的發(fā)生和進(jìn)展中的確切作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。CCNB1屬于細(xì)胞周期蛋白（CCN）基因家族。研究表明，CCNB1在多種腫瘤（如乳腺癌、結(jié)直腸癌和肝細(xì)胞癌）中過表達(dá)并促進(jìn)腫瘤增殖[18-19]。ACTA2有助于維持細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)械張力和細(xì)胞形狀。ACTA2已被發(fā)現(xiàn)在肺癌中與腫瘤進(jìn)展有關(guān)[20]，但ACTA2在膀胱癌中的具體調(diào)節(jié)作用機(jī)制及預(yù)后尚不完全清楚，仍需進(jìn)一步研究。

我們還注意到，目前國際上也有與我們類似的研究發(fā)表。Sarafidis等[21]通過薈萃分析，將來自GEO數(shù)據(jù)庫的18個(gè)微陣列基因表達(dá)數(shù)據(jù)集整合成一個(gè)合并的數(shù)據(jù)集，確定了815個(gè)穩(wěn)健的差異表達(dá)基因。然后同樣通過基于差異表達(dá)基因的PPI和WGCNA分析，篩選了膀胱癌患者尿液和血漿樣品中關(guān)鍵基因作為標(biāo)志物，其中包括了VEGFA和TOP2A。此外，Zheng等[22]用類似的方法鑒定出包括CCNB1在內(nèi)的膀胱癌患者預(yù)后關(guān)鍵基因。與類似的研究得到類似的研究結(jié)果，說明我們的結(jié)果是可靠的，與這些研究存在不同結(jié)果的可能原因是不同的研究采用的數(shù)據(jù)來源和算法有所不同，引入的批次效應(yīng)不同，從而造成結(jié)果和結(jié)論并不完全一致。不過，我們的研究和前人的研究均證實(shí)了所篩選出的關(guān)鍵基因和通路在膀胱癌患者預(yù)后中的重要性。

總之，本研究通過生物信息學(xué)對(duì)膀胱癌進(jìn)展相關(guān)的差異基因和通路進(jìn)行了深入分析，篩選出了幾個(gè)關(guān)鍵基因和通路，有助于我們對(duì)膀胱癌發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的理解，為臨床尋找膀胱癌治療靶點(diǎn)提供了重要的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為將來膀胱癌的研究提供了思路。本研究的局限性在于樣本量較少并缺少實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相關(guān)結(jié)果，未來還將進(jìn)行大量樣本研究驗(yàn)證。