9 個(gè)抗稻瘟病基因在291 份水稻種質(zhì)資源中的分布及組合特征

桑世飛，王亞男，王君怡，曹夢(mèng)雨，孫曉涵，姬生棟

（1. 河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2. 河南省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新工程研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453007）

我國(guó)是世界上最大的水稻生產(chǎn)與消費(fèi)國(guó)，平均每年水稻生產(chǎn)與消費(fèi)量超過全世界總量的30%[1-2]。因此，確保水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)與國(guó)家糧食安全緊密相關(guān)。水稻稻瘟病是水稻生產(chǎn)中一種重要的病害，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量。在稻瘟病較流行的年份，其可致水稻減產(chǎn)10%～40%；在稻瘟病暴發(fā)的年份，其可致水稻減產(chǎn)50%～60%[3-4]。而生產(chǎn)上應(yīng)用的水稻品種由于稻瘟病菌生理小種的快速變異、栽培環(huán)境和生態(tài)環(huán)境的改變致使生態(tài)遺傳抗性減弱，品種的抗病性下降，極大地制約了水稻的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[5]。因此，為降低因稻瘟病暴發(fā)帶來的產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)損失，選育抗稻瘟病水稻品種顯得尤為重要。

近年來，關(guān)于廣譜稻瘟病抗性基因的克隆、鑒定與分析的研究已取得一系列突破，為水稻稻瘟病抗性改良奠定了基礎(chǔ)。目前，已鑒定出100 多個(gè)抗稻瘟病主效基因與500個(gè)稻瘟病抗性數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）[6-7]，其中有37 個(gè)基因被成功克隆和鑒定，NBS-LRR（Nucleotide binding site-leucine-rich repeats）類基因是水稻中應(yīng)用較廣泛的稻瘟病抗性基因，在水稻抗稻瘟病方面具有重要作用。例如，已經(jīng)克隆的廣譜稻瘟病抗性基因有Pi2、Pi9、Pi-kh、Pi50、Pi54、Pi54rh、Pi56（T）、Pi64、Pigm、Pizh和Pita-2等[8-11]。其中，位于6號(hào)染色體上的Pi50、Pigm、Pizh、Pi2、Pi9同為Piz 位點(diǎn)上的復(fù)等位基因[12]。一部分NBS-LRR 類基因已被應(yīng)用于水稻抗稻瘟病品種的選育，例如，吳婷婷等[13]應(yīng)用Pi9基因改良了水稻不育系豐源A的稻瘟病抗性。

隨著水稻功能基因組與分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合成為現(xiàn)代育種的趨勢(shì)，其克服了傳統(tǒng)育種效率低、周期長(zhǎng)等問題。目前，已經(jīng)利用分子標(biāo)記輔助選擇選育出一些稻瘟病抗性種質(zhì)。例如：何彎彎等[14]將含有Pib抗稻瘟病基因的品種津稻179 與徐稻3 號(hào)進(jìn)行雜交，通過水稻系譜法選育及田間接種和自然誘發(fā)鑒定，對(duì)受體的抗病性進(jìn)行改良，最終獲得具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀且水稻稻瘟病抗性增強(qiáng)的X13、X40、X41 和X42 四個(gè)品系；呂軍等[15]利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合水稻抗稻瘟病基因Pita和香味基因fgr，最終篩選出含有抗稻瘟病基因Pita和香味基因fgr的4 個(gè)遼粳香系列品系；何光明等[16]通過分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合回交轉(zhuǎn)育，首次成功地將抗衰老基因IPT（Isopentenyl transferase）、抗白葉枯病基因Xa23和抗稻瘟病基因Pi26聚合到一起；宋澤等[17]以攜帶Pi1和Pi9抗病基因的BC4F2群體為基礎(chǔ)材料，利用分子標(biāo)記輔助選擇完成BC5F5株系的構(gòu)建，改良了水稻特異種質(zhì)大粒溪香的稻瘟病抗性；曾曉強(qiáng)等[18]通過連續(xù)回交結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，將抗稻瘟病基因Pi2導(dǎo)入到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)晚粳品種長(zhǎng)農(nóng)粳1 號(hào)中，改良了長(zhǎng)農(nóng)粳1 號(hào)的稻瘟病抗性；姚姝等[19]利用分子標(biāo)記輔助選擇選育出產(chǎn)量高、抗病性好的品系南粳0051；潘存紅等[20]用攜帶Pizt和Pib基因的粳稻品種武運(yùn)粳21 號(hào)與優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、感稻瘟病的中間材料L0 雜交，通過分子標(biāo)記輔助選擇獲得6 個(gè)不同類型的穩(wěn)定株系，顯著提高了L0的稻瘟病抗性。然而對(duì)于品種或品系內(nèi)的稻瘟病抗性基因組合特征缺乏系統(tǒng)性研究。為進(jìn)一步深入研究當(dāng)前水稻品種（品系）中稻瘟病抗性基因的組合特征，對(duì)收集的291份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行抗稻瘟病基因組合分析，系統(tǒng)分析當(dāng)前生產(chǎn)上水稻品種（品系）中的稻瘟病抗性基因組合特征，為今后抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助選擇育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為來自河南（177份）、江蘇（39份）、天津（23 份）、浙江（9 份）、國(guó)際水稻所（8 份）、寧夏（4份）、山東（5 份）、安徽（5 份）、湖南（3 份）、河北（2份）、福建（2份）、上海（1份）及東北三省（黑龍江、吉林、遼寧）（13 份）等?。ㄊ?、區(qū)）的共計(jì)291 份水稻種質(zhì)資源，以黃淮海區(qū)域種質(zhì)為主，主要由新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、鹽城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、河南師范大學(xué)水稻新種質(zhì)研究所等單位提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗稻瘟病基因分子標(biāo)記收集及Pib基因分子標(biāo)記開發(fā) 通過查閱文獻(xiàn)收集相關(guān)稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記（表1）。其中，有5 個(gè)共顯性標(biāo)記，分別為Pi9、Pi5、Pi2、Pita、Pi-kh；3個(gè)顯性分子標(biāo)記，分別為Pikm、Pit、Pb1。所有分子標(biāo)記的引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

從 GenBank（https://www. ncbi. nlm. nih. gov/genbank/）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索下載Pib抗病基因型序列（登錄號(hào)：AB013448.1）以及感病種質(zhì)資源9311的Pib等位基因序列，設(shè)計(jì)引物（F:5＇-TCCTGTCCCAGAAGACATAT-3＇；R:5＇-GTGACGGCGGATGCCTGACG-3＇）擴(kuò)增收集的種質(zhì)資源津稻10 號(hào)（Jindao 10）、新科稻29（Xinkedao 29，簡(jiǎn) 稱XKD 29）、新 科 稻89（Xinkedao 89，簡(jiǎn)稱XKD 89）的基因組序列，擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，采用MEGA 5.1 進(jìn)行序列比對(duì)分析，以Pib感病、抗病基因型差異位點(diǎn)開發(fā)特異引物。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增及電泳檢測(cè) 采用CTAB 法[25]提取水稻幼嫩葉片基因組DNA，以諾唯贊GreenTaqMix推薦濃度，設(shè)置10 μL PCR體系，根據(jù)各分子標(biāo)記引物的Tm 值設(shè)定退火溫度進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。150 V 電壓、1%瓊脂糖凝膠電泳15 min 檢測(cè)擴(kuò)增的目的條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pib分子標(biāo)記開發(fā)

將Pib基因抗病基因型序列與水稻9311、津稻10 號(hào)、新科稻29、新科稻89 中的Pib等位基因序列進(jìn)行比對(duì)（圖1），發(fā)現(xiàn)序列比對(duì)區(qū)間存在多處變異，基于變異序列設(shè)計(jì)2 個(gè)分別針對(duì)性擴(kuò)增Pib感病與抗病基因型的分子標(biāo)記，且互相不干擾，能夠混合在一起實(shí)現(xiàn)共顯性擴(kuò)增。在Pib抗病基因型特異區(qū)域 開 發(fā) 出1 個(gè) 顯 性 抗 病 分 子 標(biāo) 記（PibFk：5＇-AGCGAGGAAGCGGAGGGTGG-3＇，PibR：5＇-CAATGCATTTAA（G/A）CGTGCTCAC-3＇）；同時(shí)在Pib感病基因型特異區(qū)域設(shè)計(jì)1 個(gè)顯性感病分子標(biāo)記（PibF：5＇-CTGCTCGTTTGCGACCAATG-3＇，PibRg：5＇-GTTGAAGCCCTAGGATCCGCT-3＇）。理論上抗病材料可擴(kuò)增出500 bp 的目的片段，感病材料可擴(kuò)增出350 bp的目的片段。

圖1 不同水稻種質(zhì)資源Pib基因序列比對(duì)分析Fig.1 Sequence alignment analysis of Pib gene in different rice germplasm resources

將上述2 對(duì)引物混合在一起，選取12 份種質(zhì)資源進(jìn)行Pib基因型檢測(cè)，結(jié)果篩選出6 份含有Pib抗病基因型的水稻種質(zhì)（玉粳3、聯(lián)豐88、華粳5 號(hào)、新稻59、新糧310、武運(yùn)粳21），擴(kuò)增出500 bp 的目的條帶，6 份含有Pib感病基因型的水稻種質(zhì)（圣稻806、鎮(zhèn)稻99、新稻89、菡香1 號(hào)、新豐5 號(hào)、華粳5號(hào)），擴(kuò)增出350 bp 的目的條帶（圖2），表明Pib分子標(biāo)記可應(yīng)用于水稻抗稻瘟病基因型的檢測(cè)。

圖2 基于Pib基因分子標(biāo)記的抗（感）稻瘟病水稻種質(zhì)資源中Pib基因型鑒定Fig.2 Identification of Pib genotype in rice germplasm resources with blast resistance（susceptibility）based on molecular markers of Pib gene

2.2 9個(gè)抗稻瘟病基因在水稻種質(zhì)資源中的分布

本研究利用前人報(bào)道以及本研究開發(fā)的Pib基因分子標(biāo)記（2 對(duì)引物混合）共計(jì)9 個(gè)抗稻瘟病基因分子標(biāo)記對(duì)291份水稻種質(zhì)資源中的抗稻瘟病基因進(jìn)行檢測(cè)（部分結(jié)果見圖3），發(fā)現(xiàn)Pi9、Pi2、Pib、Pikh、Pita、Pi5這6 個(gè)基因的分子標(biāo)記具有共顯性標(biāo)記特征。

圖3 部分水稻種質(zhì)資源中9個(gè)抗稻瘟病基因的分子檢測(cè)Fig.3 Molecular detection of nine blast resistance genes in some rice germplasm resources

對(duì)水稻種質(zhì)資源攜帶的抗稻瘟病基因數(shù)目進(jìn)行分析（圖4），發(fā)現(xiàn)單份水稻種質(zhì)資源攜帶的抗稻瘟病基因數(shù)目為0～6 個(gè)，其中攜帶6 個(gè)抗稻瘟病基因的種質(zhì)資源僅有1 份，即墾香48，占比最低，為0.4%；攜帶5 個(gè)抗稻瘟病基因的種質(zhì)資源有26 份，占比8.9%，包括武運(yùn)粳80、玉粳3、新稻59、藝稻628、新稻58 等；攜帶4 個(gè)抗稻瘟病基因的種質(zhì)資源有56份，占比19.2%；攜帶3個(gè)抗稻瘟病基因的種質(zhì)資源有119份，占比最高，為40.9%；攜帶2個(gè)抗稻瘟病基因的種質(zhì)資源有59份，占比20.3%；攜帶1個(gè)和0 個(gè)抗稻瘟病基因的種質(zhì)資源分別有24 份和6 份，分別占比8.2%和2.1%。

圖4 水稻種質(zhì)資源攜帶抗稻瘟病基因數(shù)目分析Fig.4 Analysis on the number of rice blast resistance genes carried by rice germplasm resources

對(duì)291份水稻種質(zhì)資源中各個(gè)抗稻瘟病基因的出現(xiàn)頻率進(jìn)行分析（圖5），發(fā)現(xiàn)9 個(gè)抗稻瘟病基因在水稻種質(zhì)資源中出現(xiàn)的頻率存在較大差異，介于7.2%～59.1%。其中，Pi9基因出現(xiàn)頻率最高，為59.1%；Pi-kh次之，為50.8%；Pib基因出現(xiàn)頻率為41.2%；Pi5基因出現(xiàn)頻率為36.4%；Pita基因出現(xiàn)頻率為29.2%；Pb1基因出現(xiàn)頻率為28.8%；Pi2基因出現(xiàn)頻率為19.5%；Pikm基因出現(xiàn)頻率為17.1%；Pit基因出現(xiàn)頻率最低，為7.2%。

圖5 9個(gè)抗稻瘟病基因在水稻種質(zhì)資源中的出現(xiàn)頻率Fig.5 Occurrence frequency of nine blast resistance genes in rice germplasm resources

2.3 291份水稻種質(zhì)資源中9個(gè)抗稻瘟病基因的組合類型

對(duì)291份水稻種質(zhì)資源的抗稻瘟病基因組合進(jìn)行分析（表2），發(fā)現(xiàn)291 份水稻種質(zhì)資源中共有抗稻瘟病基因組合93 個(gè)。其中，Pi9+Pi-kh+Pita組合水稻種質(zhì)資源最多，有18 份；其次為Pi9+Pi-kh+Pib組合，有17 份；組合為Pi9+Pb1的水稻種質(zhì)資源有11份；組合為Pi9+Pi5+Pb1、Pi9+Pi-kh和Pi-kh+Pita的種質(zhì)資源各有9 份；含有Pi9+Pi5+Pi-kh+Pib+Pita、Pi9+Pi5+Pi-kh和Pi-kh組合的種質(zhì)資源各有8份；含有Pi9+Pi5+Pib和Pi9組合的種質(zhì)資源各有7份；含有Pi2+Pib+Pit、Pi2+Pi5+Pi-kh和Pi5+Pi-kh組合的種質(zhì)資源各有6份。而其余組合數(shù)目則相對(duì)較少，如含有Pi9+Pi-kh+Pib+Pb1和Pi5+Pi-kh+Pib組合的種質(zhì)資源各有5份；含有Pi9+Pib+Pita+Pikm+Pb1、Pi9+Pi-kh+Pib+Pita、Pi9+Pi5+Pi-kh+Pib、Pi2+Pi-kh+Pib+Pb1、Pi2+Pib+Pikm+Pb1、Pi9+Pi5+Pikm、Pi2+Pita+Pikm、Pi5+Pb1、Pi9+Pi5和Pi5組合的種質(zhì)資源各有4份；含有Pi9+Pi5+Pib+Pita+Pikm、Pi2+Pib+Pita+Pikm+Pit、Pi9+Pi5+Pi-kh+Pb1、Pi9+Pi5+Pikm+Pb1、Pi9+Pi-kh+Pita+Pb1、Pi2+Pi5+Pi-kh+Pib、Pi9+Pib+Pb1、Pi9+Pita+Pb1、Pi9+Pi-kh+Pb1、Pi2+Pib+Pikm、Pi2+Pi-kh+Pib、Pi5+Pib和Pi9+Pib組合的種質(zhì)資源各有3 份；含有Pi9+Pi5+Pi-kh+Pib+Pb1、Pi9+Pi5+Pita+Pikm+Pb1、Pi9+Pi5+Pi-kh+Pita、Pi9+Pib+Pikm+Pit、Pi9+Pi5+Pib+Pb1、Pi2+Pib+Pikm+Pit、Pi2+Pi-kh+Pib+Pit、Pi9+Pib+Pita、Pi2+Pi5+Pib、Pi2+Pi-kh、Pib+Pita、Pb1和Pita組合的種質(zhì)資源各有2份；其余均僅有1份，如表2所示。

表2 291份水稻種質(zhì)資源9個(gè)抗稻瘟病基因組合分布Tab.2 Distribution of nine blast resistant gene combinations in 291 rice germplasm resources

續(xù)表2 291份水稻種質(zhì)資源9個(gè)抗稻瘟病基因組合分布Tab.2（Continued） Distribution of nine blast resistant gene combinations in 291 rice germplasm resources

3 結(jié)論與討論

稻瘟病是當(dāng)前水稻生產(chǎn)中威脅最大的一個(gè)真菌性病害，且稻瘟病菌變異快，育成品種稻瘟病抗性容易喪失[11]。因此，解析水稻稻瘟病抗性、選育抗稻瘟病水稻新品種已經(jīng)成為當(dāng)前解決稻瘟病的一個(gè)重要途徑。

利用廣譜抗性基因分子標(biāo)記檢測(cè)水稻品種中含有的抗稻瘟病基因類型、組合，分析各地區(qū)抗稻瘟病基因的分布比例，對(duì)特定地區(qū)種質(zhì)資源的稻瘟病抗性改良具有重要的指導(dǎo)意義。研究發(fā)現(xiàn)，在不同地區(qū)抗稻瘟病基因的利用頻率存在一定的差異。王亞等[22]對(duì)河南省139 份水稻種質(zhì)資源中的Pi-kh和Pi5基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Pi-kh基因出現(xiàn)頻率為48.4%，而浙江省水稻種質(zhì)資源中Pi-kh基因出現(xiàn)頻率則為41.3%[24]。說明不同地區(qū)可能由于稻瘟病生理小種的不同選育出來的水稻品種所攜帶的抗稻瘟病基因存在一定的差異。本研究發(fā)現(xiàn)，Pi9和Pi-kh基因在291 份水稻種質(zhì)資源中的出現(xiàn)頻率均高于50%，Pib基因出現(xiàn)頻率超過40%，表明這些基因在收集的種質(zhì)資源中的應(yīng)用頻率較高，另外這些種質(zhì)分布較廣，可選擇部分?jǐn)y帶這類抗稻瘟病基因的種質(zhì)作為以后育種的主要抗性材料。本研究還發(fā)現(xiàn)，Pi5、Pit、Pi2、Pb1、Pita、Pikm基因在291 份水稻種質(zhì)資源中的出現(xiàn)頻率相對(duì)較低，在未來抗稻瘟病基因改良中有必要加大對(duì)Pi5、Pit、Pi2、Pb1、Pita、Pikm基因的利用率，以便提高稻瘟病抗性及持久性。

在育種實(shí)踐中，聚合抗稻瘟病基因可以提高水稻種質(zhì)資源稻瘟病抗性。例如：陳紅旗等[26]利用分子標(biāo)記技術(shù)聚合Pi-1、Pi-2和Pi-33三個(gè)抗稻瘟病基因，提高了金23B 的稻瘟病抗性。然而水稻種質(zhì)資源中聚合過多的抗稻瘟病基因可能會(huì)出現(xiàn)連鎖負(fù)效應(yīng)[27]；聚合數(shù)目過少，則難以維持水稻種質(zhì)資源的稻瘟病長(zhǎng)期抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，含有3～4 個(gè)抗稻瘟病基因的水稻種質(zhì)資源共占60.1%，意味著在水稻抗稻瘟病基因聚合育種時(shí)，聚合3～4 個(gè)稻瘟病抗性主效基因基本可以滿足生產(chǎn)或品種審定的需求，然而聚合稻瘟病抗性基因數(shù)目大于4的種質(zhì)資源依舊相對(duì)稀少，若要繼續(xù)維持老舊品種的生命力，則有必要對(duì)當(dāng)前推廣的品種做進(jìn)一步的抗稻瘟病基因聚合，以提升對(duì)多種稻瘟病生理小種的抗性，延長(zhǎng)水稻品種的生命周期。吳云雨等[28]研究發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)區(qū)選擇合適的抗性基因組合，才能夠保證水稻稻瘟病的持久抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶Pi9+Pi-kh+Pib和Pi9+Pi-kh+Pita2 種組合的水稻種質(zhì)資源較多。由于本研究選取的黃淮海區(qū)域的水稻種質(zhì)資源較多，或許意味著這2 種抗稻瘟病基因組合較適宜黃淮海區(qū)域的生態(tài)環(huán)境，這為今后黃淮海區(qū)域的抗稻瘟病育種提供了較有價(jià)值的參考，有助于加速黃淮海區(qū)域的抗稻瘟病育種進(jìn)程。