綿羊源十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲的分子鑒定

睢攀博，徐菲菲，梁冠達，杜海利，郎家抒，李俊強

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽類產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450046；2. 河南省滑縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 滑縣 456400）

十二指腸賈第蟲（Giardia duodenalis）和隱孢子蟲（Cryptosporidiumspp.）是可以感染人類和多種家畜的重要人獸共患寄生性腸道原蟲[1]。這2 種原蟲主要通過糞口途徑傳播，在世界范圍內(nèi)曾引起多起食源性和水源性的暴發(fā)和流行，對其防控具有重大的公共衛(wèi)生意義[2-3]。當前我國大力支持發(fā)展養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)，同時也伴隨著各種疾病的發(fā)生和傳播，寄生蟲感染往往導(dǎo)致慢性消耗性疾病，造成飼料轉(zhuǎn)換率降低，經(jīng)濟效益下降[4]。

人獸共患賈第蟲和隱孢子蟲的感染一方面對家畜造成一定的危害，同時還伴隨引起人類寄生蟲病暴發(fā)的風險[2-3]。賈第蟲和隱孢子蟲是羊常見的腸道寄生蟲，整個生產(chǎn)階段均可感染。分子流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，羊是十二指腸賈第蟲人獸共患集聚體A 和集聚體B 的重要保蟲宿主，其感染的十二指腸賈第蟲具有人獸共患傳播的潛在威脅[5]。隱孢子蟲作為引起幼齡動物腹瀉的主要腸道病原之一，同樣能夠?qū)е赂嵫蝻@著臨床癥狀甚至死亡，給養(yǎng)羊業(yè)帶來較大經(jīng)濟損失，同時也具有重要的人獸共患傳播風險[5-6]。

目前，我國多地已經(jīng)報道了綿羊源十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲的分子鑒定，然而對于安陽市的報道較少。為此，采用特異性巢式PCR 檢測方法，對獲得的安陽市綿羊源賈第蟲和隱孢子蟲分離株進行PCR 鑒定、分子特征分析以及種系發(fā)育進化分析，以期了解安陽市屬5 縣（市）綿羊源十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲的分子生物學(xué)特征，及潛在人獸共患傳播風險奠定基礎(chǔ)，為該地人獸共患風險評價提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

基于盧戈氏碘液染色法和飽和蔗糖溶液漂浮法分別對安陽市屬5縣（市）（滑縣、內(nèi)黃縣、湯陰縣、林州市、安陽縣）采集的880 份綿羊新鮮糞便樣品，進行顯微鏡形態(tài)學(xué)的鏡檢，觀察寄生蟲感染情況，共獲得16 份綿羊源十二指腸賈第蟲和3 份隱孢子蟲陽性糞便樣品，保存于2.5%的重鉻酸鉀溶液。

1.2 糞便中病原DNA的提取

使用商業(yè)化糞便DNA 提取試劑盒Stool DNA Kit（D4015-02，OMEGA Bio-Tek 公司）提取糞便樣品中病原DNA。在DNA 提取之前，將糞便樣品中的重鉻酸鉀沖洗完全，然后取200 mg 樣品，嚴格按照試劑盒推薦的DNA 提取步驟進行操作。提取獲得的病原基因組DNA，溶解并保存于200 μL Elution Buffer（10 mol/L Tris Buffer，pH 值8.5）溶液中，備用。

1.3 巢式PCR擴增

十二指腸賈第蟲的巢式PCR 擴增基于16S rRNA 基因位點，參照APPELBEE 等[7]設(shè)計的引物和擴增條件，擴增酶為TaKaRa LATaq?擴增酶（購自鄭州久是生物技術(shù)有限責任公司），使用GC BufferⅡ（含Mg2+），擴增目的片段約長298 bp。隱孢子蟲的巢式PCR 擴增基于18S rRNA 基因位點，參照XIAO 等[8]設(shè)計的引物和擴增反應(yīng)條件，擴增酶使用高保真KOD-plus（KOD-201），擴增目的片段約長850 bp。PCR 反 應(yīng) 體 系 均 為25 μL，包 括Buffer 2.5 μL（十二指腸賈第蟲為GC Buffer，隱孢子蟲為KOD-plus Buffer）、dNTP（10 mmol/L）2.5 μL、上下游引物（20 μmol/L）各1.5 μL、模板DNA（約50 ng/μL）2 μL、DNA 聚合酶1 μL 和ddH2O 14 μL。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成部合成。每次PCR 擴增反應(yīng)均分別設(shè)置陽性對照（分別為綿羊源十二指腸賈第蟲DNA 和泛在隱孢子蟲DNA）和陰性對照（不含任何DNA的去離子水）。

1.4 擴增產(chǎn)物電泳和測序鑒定

分別取5 μL 第2 次PCR 擴增產(chǎn)物與2 μL 溴酚藍上樣緩沖液（Loading Buffer）充分混勻，并將其置入1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，然后轉(zhuǎn)移到凝膠成像系統(tǒng)儀中成像。對于電泳陽性樣本分別使用DNA 測序儀（ABI PRISMTM3730 XL DNA Analyzer），基于測序反應(yīng)試劑盒（ABI PRISMR BigDyeTMTerminator V3.1 Cycle Sequencing Kit）進行測序鑒定，測序過程委托北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。為保證序列的準確性，陽性DNA 樣本擴增子均采用正、反雙向測序鑒定。所獲得下機數(shù)據(jù)使用Chromas 軟件進行可視化，并使用DNAstar-EditSeq軟件包進行序列的拼接與校準。

1.5 種系發(fā)育進化分析

將本研究獲得的十二指腸賈第蟲16S rRNA 基因序列和隱孢子蟲18S rRNA 基因序列分別與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行BLAST（Basic local alignment search tool）比對，確定其種類或基因亞型。所獲得的序列和參考序列使用ClustalX 2.1軟件進行序列比對分析，采用MEGA 7.0 基于鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育進化樹，系統(tǒng)發(fā)育進化樹分枝可信度的檢驗使用bootstrap進行分析，用1 000個重復(fù)進行檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲PCR擴增鑒定

十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲陽性糞便樣品，經(jīng)過巢式PCR 分別在目的片段附近成功擴增16 份和3 份，擴增成功率均達到100%。部分瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 綿羊源十二指腸賈第蟲16S rRNA基因位點和隱孢子蟲18S rRNA基因位點的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of 16S rRNA gene for G.duodenalis（A）and 18S rRNA gene for Cryptosporidium spp.（B）in sheep

2.2 十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲序列分析

基于十二指腸賈第蟲16S rRNA 基因位點對16份PCR 產(chǎn)物進行測序鑒定，所得序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中用BLAST 進行同源序列比對，使用MEGA 7.0 軟件進行16S rRNA 序列間的比對分析，結(jié)果顯示，分離的十二指腸賈第蟲為集聚體A（n=1）和集聚體E（n=15）。本研究中獲得的集聚體A 分離株與荷蘭狍子（Roe deer）十二指腸賈第蟲分離株集聚體A（登錄號：DQ100287）序列同源性為100%，且無堿基差異；獲得的15 條集聚體E 序列之間無堿基差異，且均與荷蘭山羊十二指腸賈第蟲分離株集聚體E（登錄號：AY826208）序列100%一致。

基于隱孢子蟲18S rRNA 基因位點對3 份PCR產(chǎn)物進行測序，所得序列同樣在GenBank 中用BLAST 進行同源序列比對。使用MEGA 7.0 軟件進行18S rRNA 序列間的比對分析，結(jié)果顯示，分離的隱孢子蟲鑒定為泛在隱孢子蟲C.ubiquitum（n=2）和豬隱孢子蟲C.suis（n=1）。本研究中獲得的2條泛在隱孢子蟲序列之間無差異，均與河南綿羊分離株C.ubiquitum（登錄號：MH794165）序列100%一致。本研究中獲得的豬隱孢子蟲與河南之前分離的豬隱孢子蟲分離株（登錄號：MH178034）序列100%一致。

2.3 十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲分離株的地理分布

基于PCR 擴增的分子鑒定顯示，安陽市綿羊源十二指腸賈第蟲的總體平均感染率為1.82%（16/880），隱孢子蟲的總體平均感染率為0.34%（3/880）。從地理分布上來說，在滑縣（3）、內(nèi)黃縣（5）、林州市（6）和安陽縣（2）等4個采樣地區(qū)的綿羊糞便樣品中共檢測到16份十二指腸賈第蟲；在滑縣（1）、內(nèi)黃縣（1）和林州市（1）等3個采樣地區(qū)的綿羊糞便樣品中共檢測到3份隱孢子蟲。本研究中無十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲混合感染情況（表1）。

表1 河南省安陽市屬5縣（市）綿羊十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲的感染情況Tab.1 The infection of Giardia duodenalis and Cryptosporidium spp.from sheep in five counties of Anyang，Henan Province

2.4 十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲分離株種系發(fā)育進化分析

16 份羊賈第蟲的16S rRNA 基因PCR 擴增產(chǎn)物長度約為298 bp。種系發(fā)育分析表明，本研究分離的16 份綿羊源賈第蟲分離株均與之前報道的G.duodenalis在同一進化分枝上，并與作為外群的組織滴蟲16S rRNA 基因序列（Histomonas meleagridis：AJ920323）在不同進化分枝上（圖2）。

圖2 基于十二指腸賈第蟲16S rRNA基因序列構(gòu)建的鄰接進化樹Fig.2 Neighbor-joining tree based on 16S rRNA gene sequences of Giardia duodenalis

3 份羊隱孢子蟲的18S rRNA 基因的PCR 擴增產(chǎn)物長度約為850 bp。種系發(fā)育進化分析表明，本研究所分離的3份羊隱孢子蟲分離株均與隱孢子蟲在同一進化分枝上。其中2份分離株與泛在隱孢子蟲（C.ubiquitum）進化關(guān)系較近，剩余1 份分離株與豬隱孢子蟲（C.suis）進化關(guān)系較近。本研究的分離株與作為外群的組織滴蟲18S rRNA 基因序列（Histomonas meleagridis：AJ920323）在不同進化分枝上（圖3）。

圖3 基于隱孢子蟲18S rRNA基因序列構(gòu)建的鄰接進化樹Fig.3 Neighbor-joining tree based on 18S rRNA gene sequences of Cryptosporidium spp.

3 結(jié)論與討論

十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲均是綿羊感染的常見腸道寄生性原蟲，主要引起宿主腹瀉、腹脹、營養(yǎng)不良和體質(zhì)量減輕等臨床癥狀。前人研究結(jié)果顯示，羊源十二指腸賈第蟲感染以集聚體E為主，常伴有集聚體A 和E 或集聚體A、B 和E 的混合感染[5-6]。本研究中，基于16S rRNA基因位點對綿羊源賈第蟲陽性樣品進行巢式PCR 擴增和序列分析，共發(fā)現(xiàn)2 種十二指腸賈第蟲集聚體，分別為集聚體A和E，并且集聚體E 是優(yōu)勢蟲種（93.75%，15/16）。希臘、挪威、伊朗、阿爾及利亞和澳大利亞等國家報道的綿羊源十二指腸賈第蟲均以集聚體E 感染為主[9-13]。國內(nèi)的內(nèi)蒙古、黑龍江、安徽和河南等省區(qū)羊感染的基因型主要為集聚體A 和集聚體E，以集聚體E 為主，與本研究結(jié)果一致[14-17]。十二指腸賈第蟲集聚體A 具有較寬的宿主范圍，可感染包括人在內(nèi)的多種哺乳動物，如犬、貓、家畜和野生動物，擁有較大的人獸共患潛力[18]。集聚體E 通常發(fā)現(xiàn)于奶牛、綿羊和山羊等反芻動物。然而也有報道從人類中獲得集聚體E分離株，但其感染率較低[19]。

目前，在綿羊中已鑒定9種隱孢子蟲，但常見的隱孢子蟲病原株有3 種，即微小隱孢子蟲（C.parvum）、泛在隱孢子蟲（C.ubiquitum）和肖氏隱孢子蟲（C.xiaoi），這3 種隱孢子蟲在流行程度、地理分布和公共衛(wèi)生重要性等方面都有所不同[5]。本研究中，基于18S rRNA基因位點對隱孢子蟲陽性樣品進行巢式PCR 擴增和序列分析，共發(fā)現(xiàn)2 種隱孢子蟲種類，分別為泛在隱孢子蟲和豬隱孢子蟲，且泛在隱孢子蟲是優(yōu)勢蟲種。在之前的報道中，泛在隱孢子蟲在野生和馴養(yǎng)的反芻動物、嚙齒動物、食肉動物和包括人類在內(nèi)的靈長類動物中都有報道，具有重要的人獸共患潛力[6]。豬隱孢子蟲是感染豬的主要隱孢子蟲種[20]。然而，涂蕊[21]在四川地區(qū)的山羊糞便樣品中也檢測到豬隱孢子蟲，且序列與英國人源豬隱孢子蟲的序列具有100%的同源性。因此，本研究中檢出的綿羊源豬隱孢子蟲亦具有人獸共患傳播風險。

本研究進一步豐富了河南省安陽市屬5縣（市）綿羊源十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲的流行病學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，將有助于了解這2種病原的感染流行情況，從而為今后制定適當?shù)目刂坪皖A(yù)防計劃奠定基礎(chǔ)。鑒定的病原均具有一定的人獸共患潛力，提示綿羊腸道寄生蟲的防控也具有重要的公共衛(wèi)生意義。