利用β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶快速酶切分析中國倉鼠卵巢細胞表達的西妥昔單抗抗原結(jié)合區(qū)的聚糖比例

程 倩, 賈戴輝, 張博慧, 許俊彥, 邵 喆, 黃應峰, 鄒 洵

(寶船生物醫(yī)藥科技(上海)有限公司, 上海 201203)

治療性單克隆抗體(mAb)藥物是以一類γ型免疫球蛋白為結(jié)構(gòu)基礎的大分子蛋白類藥物,而西妥昔單抗(cetuximab,商品名愛必妥)是最早上市的被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的抗表皮生長因子受體(EGFR)單克隆抗體,用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和頭頸鱗狀細胞癌的治療。默克公司生產(chǎn)的原研藥采用的細胞系為小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0),該細胞系在糖基化的表達過程中會形成N-羥乙基神經(jīng)氨酸(NGNA)與α-半乳糖(α-Gal),據(jù)文獻[1,2]報道,SP2/0表達的西妥昔單抗在臨床上的副作用主要是出現(xiàn)嚴重的超敏反應,具體表現(xiàn)如呼吸困難、胸悶、皮膚瘙癢和視覺障礙等。而經(jīng)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表達的西妥昔單抗,雖具有相同的氨基酸序列,但在糖基的組成和種類上存在很大差異,主要表現(xiàn)為形成N-乙基神經(jīng)氨酸(NANA)的唾液酸化糖型修飾,且不再含有α-Gal,大大降低了潛在的免疫原性風險[3-5]。

截至目前,已上市的單克隆抗體藥物絕大多數(shù)都是含有2個糖基化位點,且對稱分布于兩條重鏈上[6-8]。而已上市的西妥昔單抗是唯一一個具有4個糖基化位點的單抗藥物,其中抗原結(jié)合片段(Fab)的2個糖基化位點位于高可變區(qū)(VH),可結(jié)晶片段(Fc)的2個糖基化位點位于恒定區(qū)2(CH2)。西妥昔單抗由SP2/0細胞表達,糖基化更加復雜,并伴隨大量的唾液酸化,導致其具有顯著的電荷異質(zhì)性[9,10]。目前國內(nèi)外許多研究者開始開發(fā)以CHO細胞表達的西妥昔單抗,相比于SP2/0細胞表達,在Fab和Fc段的糖基化修飾上會有比較大的差異,特別是Fab段,不再含有a-Gal和NGNA,取而代之的是大量的NANA。這種聚糖種類的變換以及聚糖含量不同的差異,對生物學活性及功能的影響,甚至在臨床上的表現(xiàn),還在進一步研究當中[11-14]。

本文以CHO細胞表達的西妥昔單抗為研究對象(CHO-cetuximab),從糖蛋白水平和聚糖水平對其糖基化修飾做了系列研究。主要利用β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo F2),結(jié)合質(zhì)譜對質(zhì)量數(shù)的歸屬分析,考察了抗體原液經(jīng)Endo F2不同時間處理后的聚糖釋放效果。結(jié)果顯示,Endo F2對抗體Fab段的糖基化位點具有很高的酶切效率,能快速切除Fab段的聚糖,而Fc段的聚糖不受影響。對經(jīng)Endo F2酶切下來的聚糖,進一步通過對氨基苯甲酰胺(2-AB)標記后使用親水相互作用色譜柱(HILIC)分離,在超高效液相色譜-熒光檢測器(UPLC-FLR)上實現(xiàn)了準確的聚糖比例分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

CHO-西妥昔單抗為本公司經(jīng)CHO穩(wěn)定細胞系表達的西妥昔單克隆抗體原液。高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive、蛋白質(zhì)分析軟件Biopharma Finder 3.2和液相系統(tǒng)Dionex U3000均購自Thermo Scientific公司(美國);超高效液相色譜Acquity UPLC H-Class plus系統(tǒng)、熒光檢測器2475 FLR均購自Waters公司(美國);糖苷酶Endo F2購自Agilent公司(美國);N-肽糖苷酶F(PNGase F)購自NEB公司(英國);乙腈(ACN)、2-AB(純度≥98%)購自Sigma-Aldrich公司(美國);甲酸胺購自Honey Well公司(美國);超純水Milli-Q系統(tǒng)購自Millipore公司(美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1釋放抗體Fab和Fc聚糖

Endo F2酶切[15]:將抗體原液用超純水稀釋至1.0 mg/mL,然后取100 μL,加入Endo F 21.0 μL,快速混勻后于37 ℃下孵育16 h。取50 μL用于LC-MS分析,剩余50 μL加入150 μL預冷的冰乙醇,于-20 ℃條件下沉淀蛋白質(zhì),以13 000 r/min離心5 min后取上清液用于聚糖的定性分析。

PNGase F酶切[15,16]:將抗體原液用8 mol/L鹽酸胍變性稀釋至1.0 mg/mL,然后取100 μL,加入PNGase F 2.0 μL,快速混勻后于37 ℃下孵育16 h。其余操作同Endo F2酶切。

1.2.2Fab聚糖的快速釋放以及熒光標記

將抗體原液用超純水稀釋至1.0 mg/mL,然后取100 μL,加1.0 μL Endo F2酶,快速混勻后于37 ℃下孵育5 min。取50 μL用于LC-MS分析,剩余50 μL加入150 μL預冷的冰乙醇,于-20 ℃放置40 min,沉淀蛋白質(zhì),以13 000 r/min離心5min后取上清液,經(jīng)真空濃縮干燥儀徹底干燥,加入2-AB標記液于65 ℃避光標記3 h(使聚糖具有熒光信號),用50 μL 70%乙腈水溶液復溶,然后進行UPLC-FLR聚糖比例的分析[15]。

1.2.3LC-MS分析

采用Waters BioResolve RP mAb多苯色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm),流動相A和B分別為0.1%(v/v)FA水溶液和含0.1%(v/v)FA的乙腈溶液,流速0.4 mL/min。梯度洗脫程序為0～2 min, 10%B; 2～6 min, 10%B～90%B。

質(zhì)譜采用正離子模式,噴霧電壓設為3.8 kV,毛細管加熱溫度320 ℃,輔助氣溫度350 ℃,鞘氣壓力40 arb,輔助氣壓力10 arb,一級質(zhì)譜掃描質(zhì)荷比(m/z)范圍1 800～5 000。采用BioPharma Finder 3.2軟件對原始譜圖進行去卷積化處理,m/z處理范圍:2 000～4 000;輸出質(zhì)量數(shù)范圍:130 000～160 000。

1.2.4UPLC-FLR分析

采用Waters BEH Amide親水色譜柱(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm),流動相A為100 mmol/L甲酸銨溶液(pH 4.5),流動相B為乙腈,流速0.5 mL/min,柱溫60 ℃。梯度洗脫程序為0～18 min, 2%A～22%A; 18～38 min, 22%A～44%A。熒光檢測器激發(fā)波長330 nm,接收波長420 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體Fab與Fc聚糖的釋放與分析

糖苷酶PNGase F是抗體糖基化研究過程中一種常用的聚糖釋放酶,能快速并完全釋放聚糖并進行相應的定量研究,特異性地切斷糖基化位點天冬酰胺(Asn)和與之相連N-乙酰葡糖胺之間的糖苷鍵,并將Asn轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?Asp)[17,18]。Endo F2也能實現(xiàn)聚糖的釋放,能切斷兩個N-乙酰葡糖胺之間β-1,4鍵,釋放截短的聚糖分子,同時另一個N-乙酰葡糖胺仍保留在糖基化位點的Asn上[19,20]。

CHO-西妥昔單抗蛋白分子為IgG1型,且共有4個糖基化位點,每條重鏈的Fab段和Fc段各有1個N-糖基化位點,可以通過糖苷酶PNGase F和Endo F2對其切糖,釋放出相應的聚糖后進行糖相關分析(見圖1)。

圖 1 西妥昔單抗結(jié)構(gòu)及釋放的聚糖Fig. 1 Structure of cetuximab and glycans released from antibody CHO: Chinese hamster ovary.

將變性后的抗體經(jīng)PNGase F酶切16 h后,使用LC-MS檢測,經(jīng)去卷積處理后(見圖2a),測得酶切后抗體分子的質(zhì)量數(shù)為145 277.66(理論相對分子質(zhì)量為145 277.67 Da),說明抗體的聚糖已經(jīng)被完全切除,同時糖基化位點的Asn轉(zhuǎn)變?yōu)锳sp。而未變性的抗體經(jīng)Endo F2酶切16 h后(見圖2b),測得酶切后抗體分子的質(zhì)量數(shù)為146 672.05(理論相對分子質(zhì)量為146 670.28 Da),說明抗體的聚糖也已經(jīng)被完全切除,同時糖基化位點上均保留了GnF。以上結(jié)果表明，在相同的酶切時間16 h的條件下,Endo F2與PNGase F的變性酶切均能實現(xiàn)聚糖的完全釋放。將釋放出來的聚糖,在HILIC柱上分離并與質(zhì)譜進行聯(lián)用分析,可以實現(xiàn)對抗體全部聚糖的鑒定,可以看到CHO-西妥昔單抗上有較多的唾液酸化糖型G2FS1和G2FS2,此外兩種酶切方式產(chǎn)生的糖譜非常相似(見圖3),說明對聚糖的定性和定量具有一致性的結(jié)果。

在以往對西妥昔單抗的糖基化研究中發(fā)現(xiàn),PNGase F在非變性條件下能切除Fc段Asn 299位置的糖基,但Fab段的Asn 88位置的糖基依然存在,而Endo F2能在非變性條件下切除Fab段的糖基[18]。這種選擇性的切除方式推測是與抗體的空間結(jié)構(gòu)有關,糖苷酶在進攻糖基化位點時需要突破空間位阻才能進行切糖。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn),使用Endo F2在非變性條件下處理CHO-西妥昔單抗,只要酶切時間足夠長,Endo F2既能完全切除Fab段的糖基,也能完全切除Fc段的糖基。我們推測抗體的空間位阻效應降低了Endo F2對Fc段糖的酶切效率,但無法阻止其對Fc段糖的酶切,因此我們后續(xù)考察了Endo F2的不同酶切時間。

圖 2 糖苷酶處理16 h后的TIC色譜圖和去卷積譜圖Fig. 2 TIC chromatograms and deconvoluted mass spectra after glycosylation 16 h a. PNGase F; b. Endo F2.

圖 3 聚糖的TIC色譜圖Fig. 3 TIC chromatograms of glycans a. PNGase F; b. Endo F2.

2.2 Endo F2酶切時間的考察

經(jīng)Endo F2酶切5 min(見圖4a),可以看到只有Ⅰ類質(zhì)量數(shù),通過對比理論分子量對照表(見附表S1,詳見http://www.chrom-China.com),確定為抗體的Fab段2個位點均被切除:Fab段聚糖被切除后均保留了巖藻糖化的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)殘基(GnF), Fc段上2個位點保留了G0F、G1F、G2F之間的聚糖組合。說明Endo F2對Fab段的酶切效率非常高,5 min就已經(jīng)將抗體Fab段2個位點上的聚糖完全切除,而Fc段的聚糖未受影響。酶切30 min后可以看到除了有Ⅰ類的質(zhì)量數(shù),還有Ⅱ類的質(zhì)量數(shù)(見圖4b), Ⅱ類質(zhì)量數(shù)確定為抗體的Fab段2個位點均被切除和Fc段1個位點被切除:Fab段的2個位點和Fc段的1個位點被切除后均保留了GnF,而Fc段還有1個位點保留了G1-GN、G0F、G1F、G2F。說明酶切時間至30 min時,有一部分抗體的Fc段中1個位點上的聚糖開始被切除了。進一步延長酶切時間至300 min后(見圖4c),可以看到有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類質(zhì)量數(shù),Ⅲ類質(zhì)量數(shù)確定為抗體的Fab段2個位點和Fc段2個位點均被切除:4個位點上均保留了GnF,相對應的質(zhì)量數(shù)為146 670.08。得出Endo F2對Fc段的酶切效率相對較低,酶切300 min后仍然有較多Fc聚糖未完全切除的抗體,若要完全切除Fc段的聚糖則需要更長的時間,如本實驗中的16 h。

抗體藥物的生產(chǎn)工藝非常復雜,而且批次間的質(zhì)量屬性可能會有一些波動,尤其是糖型方面,對西妥昔單抗這種具有復雜糖基化位點的藥物,分析各個位點上的糖基化顯得尤為重要。從本實驗的結(jié)果來看,使用Endo F2酶切5 min,抗體的Fab段2個位點的聚糖完全被切除,說明該條件下可以專一性地切除Fab段位點上的聚糖,本實驗也因此未做更短酶切時間的考察?？贵w經(jīng)Endo F2酶切后,后續(xù)可以通過UPLC-FLR準確分析Fab段位點上的聚糖比例,對抗體生產(chǎn)工藝的評估具有非常重要的意義。

圖 4 Endo F2不同酶切時間的質(zhì)譜圖Fig. 4 Mass spectra of Endo F2 for different digestion times a. 5 min; b. 30 min; c. 300 min.

圖 5 來自不同生產(chǎn)工藝的CHO-西妥昔單抗抗體Fab段的糖譜Fig. 5 Glycan profiles of CHO-cetuximab antibody Fab segments from different production processes G2(F)S1 terminal sialic acid has two linkages, labeled as G2(F)S(2,3)1 and G2(F)S(2,6)1. G2(F)S2 terminal sialic acid also has two linkages, labeled as G2(F)S(2,3)2 and G2(F)S(2,6)2.

2.3 UPLC-FLR對Fab段聚糖的比例分析

從糖蛋白上釋放的聚糖經(jīng)2-AB衍生化后,使用HILIC色譜柱在UPLC-FLR上可以實現(xiàn)聚糖的比例分析。CHO-西妥昔單抗抗體經(jīng)Endo F2酶切5 min,釋放的聚糖經(jīng)2-AB標記后,在HILIC色譜柱上具有良好的分離效果(見圖5),結(jié)果展示了Fab段的糖基化修飾結(jié)果,圖5a和圖5b的樣品產(chǎn)自兩個不同的生產(chǎn)工藝,分別是工藝Ⅰ和工藝Ⅱ,其中工藝Ⅱ是在工藝Ⅰ基礎上,在CHO細胞培養(yǎng)過程中額外加入了適量的糖型調(diào)節(jié)劑,從而調(diào)節(jié)了抗體的糖型。從結(jié)果可以看出,經(jīng)不同生產(chǎn)工藝表達的CHO-西妥昔單抗在Fab段的糖譜上具有非常明顯的差異。其中還可以看出含唾液酸化的聚糖比例也相差較大,工藝Ⅰ的G2(F)S1和G2(F)S2的總比例較低,約25.0%,而工藝Ⅱ的總比例較高,約41.4%。此外,為了考察本方法的穩(wěn)定可靠性,我們獨立做了3次試驗,工藝Ⅱ樣品的3次Endo F2酶切后的相對分子質(zhì)量基本一致(見附圖S1), RSD值幾乎為0, 3次試驗的聚糖在HILIC色譜柱上的比例分析譜圖也基本一致(見附圖S2),峰面積的RSD值均小于5.0%,表明本方法具有較好的穩(wěn)定性。

抗體的Fab區(qū)是識別抗原的關鍵區(qū)域,西妥昔單抗Fab上的糖基化位點處在抗體重鏈的可變區(qū),該位點上的糖基化可能參與免疫調(diào)節(jié),影響抗原抗體的親和力,因此對該位點的糖基化修飾分析具有非常重要的意義。通過Endo F2非變性酶切5 min,結(jié)合2-AB標記的方法可以實現(xiàn)對Fab段聚糖的糖型比例分析,對指導抗體生產(chǎn)工藝的優(yōu)化起到非常大的幫助。

3 結(jié)論

本文針對CHO細胞表達的西妥昔單抗,開發(fā)了Endo F2快速酶切結(jié)合UPLC-FLR檢測的糖型分析方法,不僅對Fab段糖基化修飾的分析具有很好的專一性,而且還具有較好的穩(wěn)定可靠性,大大提高了檢測效率。這對研發(fā)者研究具體的糖型構(gòu)成,抗體抗原的親和力等提供了數(shù)據(jù)支撐,對經(jīng)不同細胞表達的，以及經(jīng)不同的細胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)的西妥昔單抗,研究Fab段糖型的變化和電荷異質(zhì)性提供了一種非常方便、快捷、準確的分析手段,并能夠有效指導生產(chǎn)工藝的優(yōu)化以及后續(xù)工藝可比性的研究。