超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析地芬尼多代謝產(chǎn)物

王 靈，侯建平

（巴中市公安局，四川 巴中636000）

地芬尼多( difenidol) 又名二苯哌丁醇，屬于芳烴類藥物，為 H1 受體拮抗劑，可以改善腦椎動(dòng)脈循環(huán)、擴(kuò)張痙攣血管、調(diào)節(jié)前庭神經(jīng)系統(tǒng)，并具有抗嘔吐作用，常作為暈車藥使用[1]。由于地芬尼多屬于非處方藥物，容易獲取，在自殺和誤服案事件中較為常見[2-3]。

目前在地芬尼多的檢測報(bào)道中，大多是基于氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、高效液相色譜和高效液相色譜質(zhì)譜法[4-8]對地芬尼多母體的檢測，而關(guān)于地芬尼多血液中代謝產(chǎn)物的檢測報(bào)道甚少，難以滿足法醫(yī)學(xué)鑒定及臨床檢測對代謝產(chǎn)物的鑒定需要。高分辨質(zhì)譜在藥物體內(nèi)檢測和代謝鑒別方面有廣泛的應(yīng)用[9-11]，本研究采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-HRMS）分析中毒人員血液中地芬尼多可能產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，并對這些代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和二級碎片離子進(jìn)行研究。在現(xiàn)有地芬尼多檢測方法中加入代謝產(chǎn)物，為地芬尼多中毒死亡案例和臨床中毒患者的快速檢驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Q Exactive超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配備HESI源、高壓二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、在線脫氣機(jī)（Thermo Fisher Scientifi c， 德國）；Xcalibur 2.2軟件（Thermo Fisher Scientifi c， 美國）。

地芬尼多標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；乙腈、甲醇（色譜級，Tedia 公司，美國）；甲酸（液質(zhì)級別，Thermo Fisher Scientifi c，美國）； 其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱取地芬尼多標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇配制成 1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液，再用甲醇稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)工作溶（1 μg/mL）備用。

1.3 樣品前處理

取服用鹽酸地芬尼多過量致死者的心血0.1 mL于一次性離心試管中，加入0.3 mL乙腈，渦旋振蕩混勻，10 000 xg/min離心10 min， 取上清液過0.22 μm尼龍濾膜（天津艾杰爾公司）后，置進(jìn)樣瓶中，供UPLC-HRMS分析。

1.4 UPLC-HRMS分析條件

1.4.1 液相條件

色譜柱： Waters BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1% 甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～2 min，90% A；2～12 min；90% A → 10% A ；12～14 min，10% A ；14～15 min，10% A → 90% A）；流速：0.3 mL/min；柱溫： 40 ℃ ；進(jìn)樣量 ：2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

HESI 源，采用正離子掃描模式，噴霧電壓3.5 kV，毛細(xì)管和霧化器溫度分別為250和350 ℃。鞘氣和輔助氣壓力分別設(shè)為275.8和103.4 kPa，S-lensRF電壓60 V，噴霧氣和碰撞氣均為氮?dú)狻Ｊ褂谜婋x校正液對質(zhì)譜質(zhì)量軸進(jìn)行校正，每7 d校正1次。掃描方式Full MS/dd-MS2模式，此模式包含一級準(zhǔn)確分子量全掃描（分辨率 70 000 FWHM）和數(shù)據(jù)依賴的二級子離子掃描（分辨率 17 500 FWHM）。一級全掃描范圍為m/z50～500，自動(dòng)增益控制（AGC）和離子注入時(shí)間（IT）分別為 1.0e6 和 100 ms，數(shù)據(jù)依賴的二級掃描（dd-MS2）AGC 設(shè)為2.0e5，最大IT設(shè)為50 ms， 同位素隔離窗口寬度（isolation window）設(shè)為1.0m/z，相對閾值（intensity threshold）設(shè)為1.0e5。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-HRMS分析結(jié)果

通過UPLC-HRMS檢測，采用數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析。推測出可能存在的代謝產(chǎn)物代謝途徑見圖1，三種可能代謝產(chǎn)物具體信息見表1。對可能為代謝產(chǎn)物的化合物，根據(jù)羥基化和脫水等代謝途徑及碎片離子信息分析其結(jié)構(gòu)及分子式。

2.2 代謝產(chǎn)物推測

地芬尼多的分子式為C21H27NO，其[M+H]+的m/z理論值為310.216 5，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣后得到地芬尼多及代謝產(chǎn)物的選擇離子色譜圖（圖2）與碎片離子圖（圖3），一級母離子離子流色譜圖（圖2a）和二級碎片譜圖（圖3a）與樣品中M的一級母離子選擇離子流色譜圖（圖2b）和二級碎片譜圖（圖3b）相匹配，且保留時(shí)間分別為7.54和7.63 min，推導(dǎo)出化合物M為地芬尼多。地芬尼多二級碎片離子譜 圖 中，m/z為 91.054 5、129.069 7、181.101 0和207.116 4的碎片離子是其特征碎片離子，其可能的結(jié)構(gòu)見圖4所示，根據(jù)這些特征離子對其可能存在的代謝產(chǎn)物進(jìn)行二級碎片比對鑒別。

通過分析，地芬尼多在血液中可能存在羥基化代謝產(chǎn)物M1、脫水代謝產(chǎn)物M2和先脫水后苯環(huán)羥基化的代謝產(chǎn)物M3。M1可能為羥基化產(chǎn)物[M+O]，推測分子式為C21H27NO2，其[M+H]+的m/z理論值為326.211 4，與地芬尼多母離子m/z310.216 5差16Da為O原子。根據(jù)以上信息在原始數(shù)據(jù)中對326.211 4進(jìn)行一級母離子提取選擇離子流色譜圖，質(zhì)量誤差設(shè)置為5 ppm ，得到圖2c中色譜峰，對其進(jìn)行二級碎片離子提取后得到圖3c。從圖3c可見91.054 6、129.069 7碎片與地芬尼多碎片相同，但是缺少了181.101 0和207.116 6碎片，增加了197.095 4和223.111 1碎片。推測產(chǎn)生的原因是代謝產(chǎn)物M1在地芬尼多母體結(jié)構(gòu)上增加了一個(gè)羥基，兩個(gè)增加的碎片符合[M+OH]，且整體質(zhì)荷比符合圖4中e和g結(jié)構(gòu)。推測223.111 1和197.095 4碎片的可能結(jié)構(gòu)見圖4e、g，為在181.101 0和207.116 6碎片基礎(chǔ)上增加一個(gè)羥基，其m/z差值也符合預(yù)測，綜合以上碎片信息，分析出代謝產(chǎn)物M1可能的分子結(jié)構(gòu)見圖4a。

地芬尼多在體內(nèi)還可能發(fā)生脫水反應(yīng)[M-H2O]，推測分子式為C21H25N，其[M+H]+的m/z的理論值為292.205 5,與地芬尼多母離子m/z310.216 5差18Da為脫H2O。根據(jù)以上信息在原始數(shù)據(jù)中對292.205 5進(jìn)行一級母離子提取選擇離子流色譜圖，質(zhì)量誤差設(shè)置為5 ppm，得到圖2d中色譜峰，對其進(jìn)行二級碎片離子提取后得到圖3d。從圖3d中可見m/z為91.054 6、129.069 7、181.099 9和207.116 9的碎片離子，與地芬尼多碎片離子一致，分析出代謝產(chǎn)物M2可能的分子結(jié)構(gòu)見圖4d。

在代謝產(chǎn)物M2的基礎(chǔ)上，還會繼續(xù)在產(chǎn)物M2的苯環(huán)上發(fā)生羥基化反應(yīng)[M+O]，推測分子式為C21H25NO，其[M+H]+的m/z的理論值為308.200 7，與M2母離子m/z292.205 5差16Da為加O。在原始數(shù)據(jù)中提取308.200 7的一級母離子色譜圖，質(zhì)量誤差設(shè)置為5 ppm，得到圖2e中色譜峰，對其進(jìn)行二級碎片離子提取后得到圖3e。從圖3e中可見m/z為91.054 6、129.069 7、197.095 4和223.111 1的碎片離子，與M1代謝產(chǎn)物碎片相同，其歸屬信息在前文已有推論，分析出代謝產(chǎn)物M3結(jié)構(gòu)見圖4c。

3 結(jié)論

運(yùn)用UPLC-HRMS技術(shù)，可以從復(fù)雜的血液樣品中獲取更多目標(biāo)物和代謝產(chǎn)物的色譜質(zhì)譜信息，尤其是在母體化合物基礎(chǔ)上極性增加的代謝產(chǎn)物。本文利用高分辨質(zhì)譜信息，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜碎片信息比對，同時(shí)與其他研究文獻(xiàn)進(jìn)行對比[12]，分析了不同的代謝途徑下可能的代謝產(chǎn)物及其碎片離子，推測出了中毒人員血液中三種代謝產(chǎn)物。地芬尼多在中毒人員血液中的主要代謝途徑包括羥基化和脫水。本文首次利用UPLC-HRMS技術(shù)對地芬尼多體內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析，為后期地芬尼多中毒案事件檢驗(yàn)和新代謝產(chǎn)物的鑒定提供了參考。