運(yùn)用法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序技術(shù)偵破19年久冷案

張 馳，郭立亮，周 軻，宋 振，康克萊，韋 美甜，

高 悅1，卓文騰1，季安全1,*，王 樂(lè)1,*

（1.公安部物證鑒定中心，現(xiàn)場(chǎng)物證溯源技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；2.漢中市公安局，陜西 漢中723000； 3.陜西省公安廳刑偵局，西安 710018）

基于Y染色體STR（Y-STR）多態(tài)性的男性家系排查技術(shù)為諸多刑事案件的偵破提供了幫助[1-4]。然而在實(shí)際排查過(guò)程中，如果檢出的Y-STR基因座數(shù)量太少，比中的男性家系過(guò)多，就無(wú)法順利開(kāi)展男性家系的排查工作。微量降解檢材在冷案積案中很常見(jiàn)[5]，檢測(cè)時(shí)容易出現(xiàn)Y-STR基因座丟失，導(dǎo)致男性家系排查工作無(wú)法開(kāi)展。這是由于現(xiàn)有Y-STR檢測(cè)試劑盒多基于毛細(xì)管電泳 （capillary electrophoresis,CE）平臺(tái)研制，為了容納更多的基因座，不得不將部分基因座的擴(kuò)增子設(shè)計(jì)在大片段區(qū)域。如Thermo Fisher公司基于CE平臺(tái)的Yfi ler? Platinum PCR試劑盒可檢測(cè)38個(gè)Y-STR基因座和3個(gè)Y-InDel，其中有15個(gè)Y-STR基因座檢測(cè)長(zhǎng)度范圍在300 bp以上。針對(duì)降解檢材的Y-STR分型檢測(cè)，增加可檢測(cè)Y-STR基因座數(shù)量、縮短擴(kuò)增子長(zhǎng)度是較有效的應(yīng)對(duì)辦法[6]。

二代測(cè)序（next generation sequencing, NGS）技術(shù)在進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增設(shè)計(jì)時(shí)，將大量基因座設(shè)計(jì)在同樣短的片段區(qū)間內(nèi)[7]，以達(dá)到縮短擴(kuò)增子的目的，從而同時(shí)檢測(cè)更多的STR基因座。前期工作中，本團(tuán)隊(duì)以模擬的降解檢材和骨骼、陳年血斑、脫落細(xì)胞、煙頭、指甲等降解檢材為研究對(duì)象，證實(shí)了利用NGS技術(shù)檢測(cè)嚴(yán)重降解的檢材（DI = 8.947）相較CE技術(shù)更具優(yōu)勢(shì)[8-9]；近期研發(fā)的STRSeqTyperY68男性家系精細(xì)化排查試劑盒[10]，可單管實(shí)現(xiàn)52個(gè)單拷貝Y-STR基因座、6個(gè)二拷貝Y-STR基因座、1個(gè)三拷貝Y-STR基因座和1個(gè)性別基因座的分型檢測(cè)，并能報(bào)告長(zhǎng)度和/或序列多態(tài)Y-STR分型信息；68個(gè)基因座擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均在350 bp以下，而其中62個(gè)基因座擴(kuò)增子長(zhǎng)度更在300 bp以下，可用于冷案中降解DNA檢材檢驗(yàn)。

“冷案”一詞來(lái)自于英美法系國(guó)家，是指窮盡了所有偵查線索，仍然無(wú)法偵破而久置的案件[11]。新技術(shù)的涌現(xiàn)為冷案?jìng)善铺峁┝诵率侄危绶ㄡt(yī)系譜技術(shù)助力破獲了一起長(zhǎng)達(dá)14年未破的強(qiáng)奸殺人案[12]。本文中，一起發(fā)生在2002年的強(qiáng)奸殺人案，因一直缺乏有效偵查線索歷時(shí)19年而未偵破。但基于二代測(cè)序技術(shù)使用STRSeqTyperY68男性家系精細(xì)化排查試劑盒對(duì)該案已經(jīng)明顯降解的檢材再行檢驗(yàn)，結(jié)果檢出了全部68個(gè)Y染色體基因座的分型，為該案件進(jìn)一步開(kāi)展男性家系排查提供了充足數(shù)據(jù)，最終該案成功告破，冷案終結(jié)。

1 材料與方法

1.1 案情簡(jiǎn)介和前期檢驗(yàn)情況

2002年5月，陜西省某市發(fā)生一起強(qiáng)奸殺人案，受害人為當(dāng)?shù)匾桓咧信畬W(xué)生，公安機(jī)關(guān)在現(xiàn)場(chǎng)提取的檢材中檢出嫌疑人9個(gè)常染色體STR基因座分型信息，錄入DNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)未比中。

1.2 DNA檢驗(yàn)

1.2.1 DNA提取和毛細(xì)管電泳檢測(cè)

使用FL-案件專用磁珠法DNA提取試劑盒（長(zhǎng)春博坤生物科技有限公司）對(duì)現(xiàn)場(chǎng)提取的生物檢材進(jìn)行DNA提取和純化。按照Yfi ler? Plus PCR 試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司）和YFiler? Platinum PCR試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司）說(shuō)明書(shū)在ProFlex? PCR擴(kuò)增儀完成PCR反應(yīng)。毛 細(xì)管電泳平臺(tái)為3500型基因分析儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.2.2 二代測(cè)序DNA檢驗(yàn)

二代測(cè)序檢驗(yàn)流程遵照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GA/T 1693-2020《法庭科學(xué)DNA二代測(cè)序檢驗(yàn)規(guī)范》[13]進(jìn)行。

文庫(kù)構(gòu)建、定量和均一化：使用STRSeqTyper Y68男性家系精細(xì)化排查試劑盒（公安部物證鑒定中心）進(jìn)行靶向擴(kuò)增和文庫(kù)富集。靶向擴(kuò)增體系為20 μL ，其中降解檢材DNA模板用量8 μL，其他陽(yáng)性對(duì)照等DNA樣品稀釋到1 ng/μL，用量為1 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃、30 s，60 ℃、2 min，72 ℃、2 min，運(yùn)行25個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min；4 ℃保持。采用KAPA Library 定量試劑盒（瑞士Roche公司）進(jìn)行文庫(kù)定量。文庫(kù)均一化為4 nM，每個(gè)樣本文庫(kù)分別取樣5 μL后混合（降解檢材的文庫(kù)取樣量為 25 μL）。

文庫(kù)變性、稀釋及上機(jī)測(cè)序：使用Miseq?Reagent Kit v3（600 cycle，美國(guó)Illumina公司）、PhiX Control V3（美國(guó)Illumina公司）和0.2 M NaOH（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）完成文庫(kù)變性、稀釋等操作?；旌衔膸?kù)最終稀釋到10 pM，PhiX Control V3用量為15%。測(cè)序平臺(tái)為MiSeq FGx? 二代測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司），測(cè)序模式為雙向測(cè)序，正反向均300 bp。

數(shù)據(jù)分析：毛細(xì)管電泳結(jié)果數(shù)據(jù)分析軟件為GeneMapper ID-X。二代測(cè)序采用軟件STRait Razor v3.0對(duì)下機(jī)Fastq文件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到各STR基因座等位基因的長(zhǎng)度信息和序列信息，測(cè)序深度閾值設(shè)定為30×。以GRCh38（NCBIGenome:GCA_000001405）正義鏈作為參照，分析上、下游側(cè)翼序列的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序質(zhì)量參數(shù)與樣本測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量

測(cè)序質(zhì)量參數(shù)顯示簇密度（clusters density）為（1 148±50）K/mm2，檢測(cè)通過(guò)的簇（clusters PF）占比（73.13±14.88）%；正向測(cè)序Phasing/Prephasing rate數(shù)值為0.165/0.022，反向測(cè)序Phasing/Prephasing rate為0.122/0.038；Q30值為60%；此外，測(cè)序總reads數(shù)為25 350 330，質(zhì)量合格的reads數(shù)為18 507 346，占比66.6%。

現(xiàn)場(chǎng)生物檢材DNA樣品測(cè)序得到約151 M數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析后得到的68個(gè)Y染色體基因座分型結(jié)果，總測(cè)序深度為45 758×，平均測(cè)序深度為663×，測(cè)序深度最低為31×（DYF387S1a/b的37分型），測(cè)序深度最高為3 440×（DYS389-I），其中，測(cè)序深度在100×以下的檢出基因座為5個(gè)，在100～500×之間的檢出基因座為33個(gè)，在500～1000×之間的檢出基因座為15個(gè)，在1 000×以上的檢出基因座為16個(gè)。

使用2800M基因組DNA進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，得到68個(gè)Y染色體基因座的完整分型結(jié)果，且準(zhǔn)確無(wú)誤，總測(cè)序深度為38 813×，平均測(cè)序深度為571×。陰性對(duì)照未發(fā)現(xiàn)有明顯污染。

2.2 法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序技術(shù)增加了Y-STR信息量

本案在死者衣物上基于CE平臺(tái)用Yfi ler? Plus PCR試劑盒和Yfi ler? Platinum PCR試劑盒檢測(cè)后，綜合分析得到了DYS576等24個(gè)Y-STR基因座，DYS549等14個(gè)擴(kuò)增子片段大于300 bp的Y-STR基因座則未得到明確分型，而使用STRSeqTyperY68男性家系精細(xì)化排查試劑盒成功檢出了DYS19等68個(gè)基因座分型，其中包括CE檢測(cè)得到的DYS19等24個(gè)Y-STR基因座（表1、圖1），且分型結(jié)果一致，另還成功檢出CE丟失的DYS391等14個(gè)Y-STR基因座（表2、圖2）、本次CE檢測(cè)不包括的DYS388等29個(gè)Y-STR基因座（表3）和3個(gè)側(cè)翼序列SNP位點(diǎn)，分別是DYF387S1a/b下游側(cè)翼區(qū)第43位C＞T、DYS388上游側(cè)翼區(qū)第 24位 G＞A、DYS531上游側(cè)翼區(qū)第43和44位之間插入GCATG（表1、表3），上述67個(gè)Y-STR基因座分型結(jié)果均為STR序列多態(tài)性分型，序列多態(tài)STR等位基因命名結(jié)果遵照公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GA/T 1694-2020《序列多態(tài)STR等位基因命名規(guī)則》[14]對(duì)等位基因命名。

表2 CE方法丟失的14個(gè)Y-STR基因座的NGS分型結(jié)果Table 2 NGS typing results of the 14 Y-STR loci which dropped out from CE detection

表1 CE方法成功檢出的24個(gè)Y-STR基因座的NGS分型結(jié)果Table 1 NGS typing results of the 24 Y-STR loci which were also successfully detected with CE

2.3 成功鎖定嫌疑人男性家系

辦案單位根據(jù)68個(gè)Y染色體基因座分型數(shù)據(jù)迅速開(kāi)展了Y-STR比對(duì)工作，零容差成功鎖定了一唐姓家系（圖3）。經(jīng)使用AmpFLSTR? Identifi ler?PCR試劑盒進(jìn)一步比中了嫌疑人，檢測(cè)出了15個(gè)擴(kuò)增片段小于350 bp的常染色體STR基因座，且與現(xiàn)場(chǎng)檢材的該15個(gè)常染色體STR基因座分型完全一致。嫌疑人被抓獲后如實(shí)交代了犯罪事實(shí)，該命案歷時(shí)19年終于告破。

3 討論

Y-STR為男性特有，具父系縱向、單倍型遺傳的特點(diǎn)，故常用于男性家系的排查[1-4]。在本案中，CE結(jié)果顯示精斑檢材出現(xiàn)了明顯的降解特征，長(zhǎng)度大于360 bp的Y-STR基因座幾乎全部丟失，而其他Y-STR基因座的數(shù)據(jù)質(zhì)量不佳，綜合Yfi ler? Plus PCR試劑盒和Yfi ler? Platinum PCR試劑盒檢測(cè)結(jié)果，熒光峰高在100 RFU以上的基因座僅有24個(gè)，占可檢測(cè)基因座總數(shù)的58.5%。對(duì)于NGS檢測(cè)結(jié)果，測(cè)序深度越高，分型結(jié)果越可信。本次測(cè)序深度閾值設(shè)定為30×，測(cè)序深度在100×以上的基因座有64個(gè)，占可檢測(cè)基因座總數(shù)的92.8%。

基于NGS技術(shù)可將常規(guī)STR基因座作為mini-STR基因座使用，引物設(shè)計(jì)時(shí)各基因座片段長(zhǎng)度完全可以重疊在小片段區(qū)域且互不干擾[15]。STRSeq-TyperY68男性家系精細(xì)化排查試劑盒適用于血液、精斑、唾液（煙蒂）、肋軟骨組織、接觸DNA等法醫(yī)常見(jiàn)生物檢材，應(yīng)用于本案其優(yōu)勢(shì)在于：1）獲取基因座數(shù)目眾多。該試劑盒基因座覆蓋了公安部物證鑒定中心DNATyper?Y26，北京基點(diǎn)認(rèn)知公司Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)Y-Plus，Thermo Fisher公司Yfi ler? Platinum PCR試劑盒、Yfi ler?Plus PCR試劑盒和AmpFLSTR? Yfi ler? PCR試劑盒，Promega公 司 PowerPlex?Y23 System 等 CE平臺(tái)試劑盒全部的Y-STR基因座[10]。2）擴(kuò)增子長(zhǎng)度范圍較短，獲得了CE結(jié)果中丟失的長(zhǎng)片段基因座。CE檢測(cè)中丟失的14個(gè)基因座的擴(kuò)增子長(zhǎng)度范圍在358～538 bp，相應(yīng)基因座在本試劑盒中的擴(kuò)增子長(zhǎng)度范圍在92～290 bp。基于上述優(yōu)勢(shì)，STRSeqTyperY68男性家系精細(xì)化排查試劑盒成功檢出了本案中降解檢材的68個(gè)Y染色體基因座，為辦案單位迅速偵破此冷案提供了技術(shù)支持，實(shí)證了NGS技術(shù)在疑難案件中對(duì)降解檢材的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，充分證明了法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序技術(shù)在實(shí)戰(zhàn)中的應(yīng)用價(jià)值。隨著公安實(shí)戰(zhàn)中使用的Y-STR基因座數(shù)目越來(lái)越多，不同試劑盒之間可能存在STR等位基因命名不一致的情況[16-17]。為避免因此發(fā)生比對(duì)錯(cuò)誤，一方面應(yīng)遵照《序列多態(tài)STR等位基因命名規(guī)則》[14]等進(jìn)行規(guī)范命名，另一方面在使用來(lái)源于不同試劑盒的數(shù)據(jù)進(jìn)行分型比對(duì)時(shí)，可使用9947A、2800M等DNA標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行校驗(yàn)。