刺五加苷E對野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓模型大鼠的治療作用

田京輝，郭姍姍，陳靜靜，徐炳欣，趙亮

(1.河南科技大學(xué)附屬許昌市中心醫(yī)院藥學(xué)部，許昌 461000；2.許昌市分子醫(yī)學(xué)重點實驗室，許昌 461000；3.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生化藥學(xué)教研室，上海 200433)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)指肺動脈壓力升高超過一定界值的一種血流動力學(xué)和病理生理狀態(tài)，預(yù)后惡劣，嚴重威脅人類健康[1-2]。近年來出現(xiàn)的靶向治療藥物盡管改善患者的預(yù)后，但其短期療效好，長期療效欠佳，僅僅起到對“癥”治療的效果，遠不能滿足臨床需求[3-4]。因此，尋找新穎有效的PAH治療藥物具有重要意義。刺五加苷E是從傳統(tǒng)補“氣”中藥刺五加中分離和鑒定出的一種酚苷類化合物，是五加科植物刺五加的主要活性成分之一，具有固本強體、抗衰老、抗疲勞、提高機體適應(yīng)能力、改善血液循環(huán)等多種藥理學(xué)作用[5-8]。刺五加苷E能否對PAH起到防治作用，以及其潛在的作用機制尚有待研究。筆者在本研究旨在觀察和探討刺五加苷E對野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)PAH大鼠的治療作用及其機制，以期為PAH的防治提供新穎的候選化合物。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性無特定病原體(SPF)級Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，體質(zhì)量180～220 g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0010。SD大鼠飼養(yǎng)于25 ℃恒溫，相對濕度50%，常規(guī)飼料與自由飲水，以及光照/黑暗12 h交替循環(huán)的屏障環(huán)境中。

1.2試劑 刺五加苷E(中國食品藥品檢定研究院，批號：111713-201804)；MCT[Sigma-aldrich(上海)貿(mào)易有限公司，批號：C2401]；細胞核染料4’，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI，德國Partec Flow Cytometry Technology公司，批號：05-5005)；RIPA裂解液(Cell Signaling Technology公司，批號：9806)；超敏型電化學(xué)發(fā)光顯色(ECL)試劑盒(賽默飛世爾科技公司，批號：32134)；SDS、Tris-base、甘氨酸、丙烯酰胺、聚山梨酯-20等試劑購自美國Amresco公司。

1.3儀器 蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及Quantity One 1-D分析軟件購自Bio-Rad公司；熒光顯微系統(tǒng)Nikon ECLIPSE Ti購自尼康公司；HistoCore Arcadia 包埋機(EG1150H)、石蠟切片機(RM2235)購自上海萊卡儀器有限公司；PowerLab多導(dǎo)生理記錄儀購自埃德儀器國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.4動物分組及處理 48只SD大鼠預(yù)適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，按數(shù)字隨機分為2組，每組24只。其中模型組給予頸背部皮下注射MCT(60 mg·kg-1)造模，對照組同步給予等體積0.9%氯化鈉溶液。誘導(dǎo)后1周，模型組和對照組分別按數(shù)字隨機取12只進行刺五加苷E干預(yù)(10 mg·kg-1，腹腔注射，qd)，分別為模型+刺五加苷E組和對照+刺五加苷E組，剩余12只同步給予等體積0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)給藥2周后進行右心導(dǎo)管等評估實驗。

1.5右心導(dǎo)管實驗 給藥2周后采用右心導(dǎo)管法測定各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)。大鼠稱定質(zhì)量后腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉。將大鼠固定于手術(shù)臺，氣管插管后，連接肺動脈壓力測量儀器，暴露出右側(cè)頸外靜脈。插入PE50導(dǎo)管，將導(dǎo)管緩慢推送入心腔，向左下轉(zhuǎn)動導(dǎo)管，觀察、記錄波形，分析各組動物平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)、右心室收縮壓(right ventricle systolic pressure，RVSP)等血流動力學(xué)指標(biāo)。

1.6右心肥厚指數(shù)評估 處死大鼠取出完整心臟，預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液沖洗后汲干水分，分離并稱取右心室(right ventricle，RV)、左心室(left ventricle，LV)及室間隔(septum，S)質(zhì)量，采用下述公式計算并比較各組大鼠右心肥厚指數(shù)(right ventricle hypertrophy index，RVHI)[9]，即Fulton’s指數(shù)，RVHI=RV/(LV+S)。

1.7組織病理學(xué)實驗 取各組大鼠肺組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h后，進行脫水和石蠟包埋。使用手動轉(zhuǎn)輪石蠟切片機進行連續(xù)切片(厚度為4 μm)，將組織切片置于烤片機上烘烤，隨后進行脫蠟、蘇木精染色、1%鹽酸乙醇分化、返藍、伊紅染色、脫水、透明、中性樹膠封片等[10]，顯微鏡下觀察肺組織血管形態(tài)。

1.8抗血漿血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)和抗α-平滑肌抗體(α-SMA)免疫熒光雙染法檢測肺小動脈肌化水平 將組織切片用EDTA高壓抗原修復(fù)后，依次進行磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌和封閉打孔。隨后，與一抗(抗vWF兔多克隆抗體，1：1500稀釋；抗α-SMA小鼠多克隆抗體，1：1000稀釋)4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫。PBS洗滌后，將組織切片與二抗[Fluorescein-Conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)和Goat anti-Mouse IgG/Alexa Fluor?594，均1：500稀釋]在避光條件下孵育2 h，洗滌，DAPI染核封片，保存于4 ℃干燥、避光環(huán)境下，于顯微鏡下觀察攝像。

1.9Western blotting實驗 用RIPA(含0.1 mmol·L-1的PMSF)裂解液提取大鼠肺組織總蛋白，取樣10 μL(總蛋白約4 mg)進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析，首先用80 V電壓電泳，當(dāng)溴酚藍泳動至分離膠，調(diào)整電壓為120 V繼續(xù)電泳至溴酚藍達分離膠底部。轉(zhuǎn)膜，在冰浴中用200 mA電流持續(xù)作用2 h，將蛋白從PAGE膠上轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜；將膜浸泡于5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)中，室溫下封閉2 h。將磷酸化信號通路抗體(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K；RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，Akt)用5% BSA稀釋至工作濃度，與封閉后PVDF 膜于4 ℃孵育過夜。洗膜，將辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)結(jié)合的二抗用5% BSA稀釋至工作濃度，與PVDF膜于室溫下作用1 h；再次洗膜，在PVDF膜上滴加適量的ECL發(fā)光試劑，室溫下作用1 min，用GelDocTM+系統(tǒng)進行曝光。用Quantity One 1-D分析軟件對條帶進行灰度掃描，并對其進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1刺五加苷E對MCT誘導(dǎo)SD大鼠肺血流動力學(xué)影響 MCT誘導(dǎo)后3周，模型組大鼠RVSP(44.95±3.59) mmHg，mPAP(42.20±3.18) mmHg，均較對照組[(19.09±3.89)和(18.07±2.08) mmHg]顯著升高(均P<0.01)，提示經(jīng)過MCT的誘導(dǎo)，SD大鼠已出現(xiàn)明確的PAH表型。模型+刺五加苷E組大鼠RVSP和mPAP均顯著下降，分別為(33.18±4.85)和(31.77±5.41) mmHg，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，說明刺五加苷E能夠顯著降低SD大鼠肺血管壓力。對照+刺五加苷E組RVSP和mPAP分別(18.00±3.59)和(17.94±2.34) mmHg，與對照組比較未見明顯變化，說明刺五加苷E對于正常大鼠的血流動力學(xué)并不產(chǎn)生明顯的影響。

2.2刺五加苷E對MCT誘導(dǎo)SD大鼠RVHI的影響 模型組大鼠RVHI(0.41±0.07)較對照組(0.23±0.03)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示PAH大鼠出現(xiàn)明顯的右心肥厚現(xiàn)象；模型+刺五加苷E組RVHI顯著下降至(0.29±0.03)(P<0.01)，說明刺五加苷E能夠顯著改善PAH大鼠右心肥厚。對照+刺五加苷E組RVHI為(0.22±0.03)，與對照組比較未見明顯變化，說明刺五加苷E對于正常大鼠的右心并不產(chǎn)生明顯的影響。

2.3刺五加苷E對MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈中膜厚度影響 光鏡下觀察HE染色結(jié)果見圖1。對照組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肺小動脈(直徑<100 μm)血管中層約占血管總橫截面積(22.32±4.40)%，而模型組血管中層明顯增厚，其占比高達(47.67±2.88)%(P<0.01)，模型+刺五加苷E組肺小動脈血管中層約占血管總橫截面的(34.88±3.24)%，較模型組顯著降低(P<0.01)，提示刺五加苷E能夠顯著改善肺小動脈中膜肌層病理性增生，對照+刺五加苷E組占比為(23.17±3.56)%，無明顯變化。

A.對照組；B.對照+刺五加苷E組；C.模型組；D模型+刺五加苷E組；①與對照組比較，P<0.01；②與模型組比較，P<0.01。圖1 4組大鼠肺動脈中膜病理圖(HE)A.Control group；B.Control + eleutheroside E group；C.Model group；D.Model + eleutheroside E group；①Compared with control group，P<0.01；②compared with model group，P<0.01.Fig.1 Pathological images of membrane in pulmonary artery of four groups of rats (HE)

2.4刺五加苷E對MCT誘導(dǎo)大鼠肺小動脈肌化影響 熒光顯微鏡下觀察肺小血管肌化程度見圖2。對照組完全肌化肺小血管比例為(10±2.83)%，模型組完全肌化肺小血管比例高達(53.80±6.76)%(P<0.01)，模型+刺五加苷E組完全肌化肺小血管比例降至(38.8±3.42)%，較模型組肺小血管完全肌化比例顯著下降(P<0.01)，對照+刺五加苷E組完全肌化肺小血管比例為(11.5±3.79)%。對于非肌化肺小血管比例而言，模型+刺五加苷E組(32.2±3.90) %較模型組(15.8±4.92)%顯著升高(P<0.01)，提示刺五加苷E能夠改善MCT誘導(dǎo)的肺血管病理性重構(gòu)。這一結(jié)果與上述H&E染色結(jié)果相吻合，進一步證實刺五加苷E對MCT誘導(dǎo)PAH大鼠的治療作用。

A.對照組；B.對照+刺五加苷E組；C.模型組；D模型+刺五加苷E組；紅色指示平滑肌細胞標(biāo)志物α-SMA；綠色指示內(nèi)皮細胞標(biāo)志物vWF；藍色指示細胞核標(biāo)志DAPI； NM：未肌化； PM：部分肌化； FM：完全肌化；①與對照組比較，P<0.01；②與模型組比較，P<0.01。圖2 刺五加苷E對MCT誘導(dǎo)SD大鼠肺小動脈肌化的影響A.Control group；B.Control + eleutheroside E group；C.Model group；D.Model + eleutheroside E group；Red indicates the smooth muscle cell marker α-SMA；Green indicates the endothelial cell marker vWF；Blue indicates the cell nucleus marker DAPI；NM: non-muscularized；PM: partial muscularized；FM: full muscularized；① Compared with the control group，P<0.01；② Compared with the model group，P<0.01.Fig.2 Effects of eleutheroside E on MCT-induced pulmonary arteriole muscularization in SD rats

2.5刺五加苷E抑制PI3K/Akt信號通路激活 MCT誘導(dǎo)3周后，與對照組比較，模型組肺組織PI3K和Akt磷酸化明顯增加(均P<0.01)，刺五加苷E治療后磷酸化PI3K蛋白表達下調(diào)至模型組74%(P<0.05)(圖3)。同時，觀察到刺五加苷E能夠顯著減少MCT誘導(dǎo)后肺組織Akt的磷酸化(圖3)，干預(yù)后僅為模型組54%(P<0.01)，提示刺五加苷E可能通過抑制PI3K和Akt通路逆轉(zhuǎn)PAH表型。

A.對照組；B.對照+刺五加苷E組；C.模型組；D模型+刺五加苷E組；①與對照組比較，P<0.01；②與模型組比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.01。圖3 刺五加苷E對MCT誘導(dǎo)SD大鼠肺組織PI3K/Akt信號通路影響A.Control group；B.Control + eleutheroside E group；C.Model group；D.Model + eleutheroside E group；①Compared with control group，P<0.01；②compared with model group，P<0.05；③compared with model group，P<0.01.Fig.3 Effects of eleutheroside E on PI3K/Akt signaling pathway in lung tissues of SD rats induced by MCT

3 討論

近年來，已有多種靶向藥物陸續(xù)進入臨床，但PAH患者的長期預(yù)后依然不容樂觀[11]。隨著中醫(yī)中藥事業(yè)的蓬勃發(fā)展，多種中藥及提取成分已被證實有益于PAH的治療[12]。刺五加苷E作為刺五加中最具藥理活性的主要成分之一，近年來受到越來越多的關(guān)注。然而，既往的研究主要集中在其對免疫性疾病、腦血管痙攣、糖尿病等疾病的治療，而對刺五加苷E防治PAH的研究，缺乏系統(tǒng)的功能評價。在本研究中，筆者通過建立MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠模型，并進行刺五加苷E干預(yù)；通過血流動力學(xué)、右心肥厚指數(shù)、肺血管重構(gòu)與肌化水平的檢測，評估了刺五加苷E對MCT誘導(dǎo)PAH大鼠疾病進程的影響，首次發(fā)現(xiàn)刺五加苷E對PAH的治療作用。

通常情況下，為了確證候選藥物或靶點的功能，僅僅采用一種動物模型是不充分的。目前PAH基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，常用的動物模型包括：MCT-PAH大鼠模型、低氧-PAH大鼠模型和低氧+sugen5416-PAH大鼠模型等。低氧+sugen5416-PAH大鼠模型周期較長、操作相對繁瑣，但能夠很好模擬臨床PAH患者肺組織叢樣病變特征。在筆者當(dāng)前的研究中，由于缺乏合適的低氧艙等設(shè)備，難以給予大鼠合適的低氧誘導(dǎo)環(huán)境，因此僅僅使用MCT誘導(dǎo)的方式進行模型的建立，這是本研究的一個局限性和不足。在未來的研究中，刺五加苷E對PAH的治療作用還應(yīng)進一步通過低氧、低氧+sugen5416等經(jīng)典模型進行驗證。

為了探索刺五加苷E發(fā)揮PAH治療作用的分子機制，檢測了肺組織中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，刺五加苷E顯著抑制PAH大鼠肺組織PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平。PI3K/Akt被認為是JAK下游的信號分子，PI3K磷酸化以后可迅速激活其下游的信號分子AKT，并使其活化?；罨蟮腜I3K/Akt可進一步激活其下游mTOR(mammalian target of rapamycin)，并使其轉(zhuǎn)導(dǎo)入核，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡等生理病理學(xué)作用[13-14]。本研究結(jié)果進一步證實PI3K/Akt通路在介導(dǎo)PAH發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[15]，同時，也提示抑制PI3K/Akt通路可能是刺五加苷E發(fā)揮PAH治療作用的潛在機制。誠然，當(dāng)前這些結(jié)果還僅僅是一個線索和提示，為了確證PI3K/Akt通路正是刺五加苷E介導(dǎo)的調(diào)控途徑，還應(yīng)采用PI3K/Akt抑制劑如Capivasertib (AZD5363)、或其特異性干擾RNA等材料對該通路進行干預(yù)，以解析刺五加苷E明確的作用機制。

綜上所述，本研究首次揭示傳統(tǒng)中藥提取物刺五加苷E可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑對PAH起到治療作用，這將為開發(fā)PAH的治療策略提供一個新穎的選項。