滇龍膽草抑制MAPK信號通路對小鼠肺纖維化的影響*

朱振東，皮娜，何琴，鐘燕，張旋

(1.云南省第三人民醫(yī)院/大理大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年病科，昆明 650011；2.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗室，昆明 650500)

肺纖維化是由多種原因引起，以肺泡上皮損傷、免疫細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞異常增殖分化、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特征的一種致命性疾病[1]。肺纖維化患者平均生存時間不到5年[2]。目前，美國食品藥品管理局(FDA)已批準(zhǔn)兩種治療肺纖維化的藥物尼達(dá)尼布和吡非尼酮，雖然能在一定程度上改善肺纖維化，但腹瀉、惡心、鼻咽炎、皮膚相關(guān)癥狀、肝功能損害等不良反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用[3]。而且這兩種藥物價格昂貴，普通患者難以承受。因此，研發(fā)高效、低毒、經(jīng)濟(jì)的抗肺纖維化新藥十分必要。

滇龍膽草(GentianarigescensFranch.ex Hemsl.)為龍膽科龍膽屬植物，也被稱為堅龍膽、苦膽草、小秦艽等，為云南道地中藥材，廣泛分布在世界各地，主產(chǎn)于云南，在四川、貴州、廣西、湖南等地也有分布[4]。滇龍膽草主要以根及根莖入藥，味苦、性寒，歸肝、膽經(jīng)，作為草藥已經(jīng)有很長的歷史。目前滇龍膽草已被《中華人民共和國藥典》2020年版收錄，作為傳統(tǒng)中藥材龍膽的重要基源植物。滇龍膽草(堅龍膽)與《中華人民共和國藥典》收錄的其他3中龍膽基源植物條葉龍膽(GentianamanshuricaKitag)、龍膽(GentianascabraBge)、三花龍膽(GentianatrifloraPall)的化學(xué)成分基本相同，僅在某些成分，如龍膽苦苷含量上有差異，其功效也相同，均為清熱燥濕、瀉肝膽火。研究表明，從龍膽屬植物中分離出的主要生物活性成分為環(huán)烯醚萜、黃酮類化合物，具有廣泛的藥理活性，包括保護(hù)肝臟、保護(hù)胃腸道、保護(hù)心血管、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等，此外，源于該植物的天然產(chǎn)物沒有明顯的動物毒性、細(xì)胞毒性和基因毒性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，源于龍膽屬植物的原料藥及環(huán)烯醚萜類化合物能夠明顯改善大鼠和小鼠肝纖維化程度[6-7]，源于龍膽屬植物的環(huán)烯醚萜苷類化合物龍膽苦苷能夠明顯改善肺纖維化小鼠肺部炎癥和纖維化病變[8]。滇龍膽草中含有龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、苦龍膽酯苷等成分，因此推測滇龍膽草對肺纖維化也有一定的改善作用。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路既參與肺纖維化早期炎癥反應(yīng)，又與轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路發(fā)生交互作用，作為TGF-β 信號通路中的非Smad依賴型通路，參與肺纖維化形成中多個環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，龍膽屬植物秦艽提取物可通過抑制MAPK信號通路減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕酒精性肝疾病[9]。因此，筆者在本研究在博萊霉素制備小鼠肺纖維化模型上觀察滇龍膽草的抗肺纖維化作用及其對MAPK信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性昆明種小鼠60只，5～7周齡，體質(zhì)量(20±2) g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物學(xué)部提供，實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滇)2020-0004。小鼠飼養(yǎng)條件：12 h明暗交替、溫度為18～26 ℃，日溫差≤3 ℃，相對濕度40%～70%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗。

1.2藥物與試劑 滇龍膽草購自昆明市螺螄灣中藥材市場，并經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院陸露教授鑒定為滇龍膽，樣本編號：20200625；吡非尼酮(批號：J1001A)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；鹽酸博萊霉素(BLM，批號：19012311)購自海正輝瑞制藥有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型，批號：090119191205)，SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(批號：071820200727)購于碧云天生物技術(shù)公司；Masson三色染色試劑盒(批號：1911278004)購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；p38MAPK抗體(貨號：8)，JNK抗體(貨號：7)，Erk1/2抗體(貨號：24)購自美國CST公司；白細(xì)胞介素(IL)-13 抗體(批號：GR40065-10)、Collagen I 抗體(批號：GR3334458-1)購自美國abcam公司；GAPDH 抗體(批號：10494-1-AP)，HRP-偶聯(lián)Goat Anti-Rabbit IgG(批號：20000243)購自美國 Proteintech公司；Bio-rad Clarity Western電致化學(xué)發(fā)光(ECL)底物(批號：170-5060)，購自美國Bio-rad公司；蛋白Marker(相對分子質(zhì)量11 000～180 000，批號：PL00001)購自美國 Proteintech公司。

1.3藥物配制、動物分組與處理

1.3.1藥物配制 將滇龍膽草粉末過四號篩后，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成0.5%，1%和2%滇龍膽草混懸液，將吡非尼酮用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成0.5%的溶液。

1.3.2動物分組與處理 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，開始實(shí)驗。小鼠按體質(zhì)量采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，正常對照組，模型對照組，吡非尼酮組，滇龍膽草小、中、大劑量組，每組10只。正常對照組一次性氣管內(nèi)滴注無菌0.9%氯化鈉溶液，其余組一次性氣管內(nèi)滴注博萊霉素5 mg·kg-1制備肺纖維化小鼠模型[8]。造模當(dāng)天，正常對照組和模型對照組小鼠灌胃給予相應(yīng)體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，吡非尼酮組灌胃給予50 mg·kg-1吡非尼酮，滇龍膽草小、中、大劑量組分別灌胃給予50，100，200 mg·kg-1滇龍膽草0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，各組給藥體積為10 mL·kg-1，每天1次，連續(xù)28 d，分別在給藥1，7，14，21，28 d稱量小鼠體質(zhì)量。

1.4樣本收集 給藥第28天，稱取小鼠體質(zhì)量，麻醉處死，收集肺組織標(biāo)本，將左肺置于10%中性甲醛固定液中固定，用于肺組織病理學(xué)觀察進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色、Masson染色，其余肺組織置于液氮中速凍，后置于-80 ℃冰箱中凍存用于Western blotting檢測。

1.5肺組織病理學(xué)觀察 取出10%甲醛固定液固定好肺組織，脫水，透明，石蠟包埋，切片(厚度約5 μm)，烤片，脫蠟，透明，脫水，進(jìn)行HE染色和Masson染色，中性樹膠封片，晾干，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。參照文獻(xiàn)[10]方法對肺泡炎進(jìn)行評分，參照文獻(xiàn)[11]方法對肺間質(zhì)纖維化程度進(jìn)行評分。

1.6Western blotting 檢測MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取肺組織充分研磨，加入RIPA裂解液裂解，離心，收集上清液，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，加入Loading buffer，沸水煮10 min使蛋白變性。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白組分，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，用10%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，TBST洗滌。加入一抗p38 MAPK(1：1000)、JNK(1：1000)、Erk1/2(1：1000)、IL-13(1：1000)、Collagen I(1：1000)、GAPDH(1：2500)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌。加入山羊抗兔 IgG-HRP 二抗(1：5000)室溫孵育2 h，TBST洗滌，將條帶置于成像儀中，滴入ECL顯影液進(jìn)行曝光。采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，以檢測蛋白與GAPDH蛋白的灰度值之比定量分析蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1小鼠生長曲線和28 d平均體質(zhì)量 從生長曲線結(jié)果可知，正常對照組小鼠體質(zhì)量增長最快，模型對照組體質(zhì)量增長最慢。從小鼠28 d平均體質(zhì)量可知，與正常對照組比較，模型對照組體質(zhì)量最低(P<0.01)，與模型對照組比較，各藥物治療組體質(zhì)量均顯著增高(P<0.01)。見圖1。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.吡非尼酮組；D.滇龍膽草小劑量組；E.滇龍膽草中劑量組；F.滇龍膽草大劑量組；①與正常對照組比較，t=4.75， P<0.01；②與模型對照組比較，t=-1.07～3.25，P<0.01。圖1 6組小鼠生長曲線和28 d 平均體質(zhì)量A.normal control group；B.model control group；C.pirfenidone group ；D.low-dose of Gentiana rigescens Franch group；E.medium-dose of Gentiana rigescens Franch group；F.high-dose of Gentiana rigescens Franch group；①Compared with normal control group，t=4.75，P<0.01；②Compared with model control group，t=-1.07-3.25，P<0.01.Fig.1 The growth curve and 28-day average body mass of six groups of

2.2滇龍膽草對小鼠肺組織病理學(xué)及膠原沉積的影響 HE 染色結(jié)果顯示，正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔內(nèi)無明顯的炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔纖細(xì)，分布均勻且結(jié)構(gòu)稍完整。與正常對照組比較，模型對照組肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)及肺間質(zhì)有大量的炎性細(xì)胞浸潤，部分肺泡斷裂，肺泡結(jié)構(gòu)完整性被破壞，病理學(xué)評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組比較，吡非尼酮組與滇龍膽草各劑量組肺組織破壞程度有較大改善，肺間隔變薄，肺泡腔及肺間質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤較模型對照組明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)完整，病理學(xué)評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2，圖3。

Masson 染色結(jié)果顯示，正常對照組小鼠肺組織中僅出現(xiàn)少量染色反應(yīng)，而模型對照組小鼠肺組織中可見大量藍(lán)色的膠原纖維，膠原沉積嚴(yán)重。與正常對照組比較，模型對照組膠原纖維明顯增多(P<0.01)；與模型對照組比較，吡非尼酮組與滇龍膽草各劑量組小鼠肺組織病變程度均減輕，膠原沉積顯著減少(P<0.05)。見圖2，圖3。

圖2 6組小鼠病理學(xué)形態(tài)(×200)Fig.2 Pathological morphology of lung tissues in six groups of mice(×200)

A.正常對照組；B.模型對照組；C.吡非尼酮組；D.滇龍膽草小劑量組；E.滇龍膽草中劑量組；F.滇龍膽草大劑量組；①與正常對照組比較，t=4.13～5.31， P<0.01；②與模型對照組比較，t=1.51～1.84，P<0.05；③與模型對照組比較，t=2.91～3.18，P<0.01。圖3 6組肺組織病理形態(tài)學(xué)評分Fig 3 The histopathological score of lung tissues in six groups of A.normal control group；B.model control group；C.pirfenidone group ；D.low-dose Gentiana rigescens Franch group；E.medium-dose Gentiana rigescens Franch group；F.high-dose Gentiana rigescens Franch group；①Compared with normal control group， t=4.13-5.31，P<0.01；②Compared with model control group， t=1.51-1.84，P<0.05；③Compared with model control group， t=2.91-3.18，P<0.01.

2.3滇龍膽草對小鼠肺組織中MAPK信號通路蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠肺組織p38、Erk1/2、JNK、IL-13、Collagen I蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型對照組比較，滇龍膽草各劑量組小鼠肺組織p38、Erk1/2、JNK、IL-13、Collagen I蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，滇龍膽草大劑量組蛋白表達(dá)下調(diào)效果與陽性藥物吡非尼酮組相當(dāng)。結(jié)果表明，滇龍膽草可顯著降低肺纖維化小鼠肺組織中p38、Erk1/2、JNK、IL-13、Collagen I蛋白表達(dá)。見圖4。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.吡非尼酮組；D.滇龍膽草小劑量組；E.滇龍膽草中劑量組；F.滇龍膽草大劑量組；①與正常對照組比較，t=4.41～7.12，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.16～2.42，P<0.05；③與模型對照組比較，t=3.15～5.60，P<0.01。圖4 6 組小鼠肺組織中p38、ERK1/2、JNK、IL-13、Collagen I蛋白表達(dá)A.normal control group；B.model control group；C.pirfenidone group ；D.low-dose of Gentiana rigescens Franch group；E.medium-dose of Gentiana rigescens Franch group；F.high-dose of Gentiana rigescens Franch group；①Compared with normal control group，t=4.41-7.12，P<0.01；②Compared with model control group，t=2.16-2.42，P<0.05；③Compared with model control group，t=3.15-5.60，P<0.01.Fig.4 Protein expression of p38， Erk1/2， JNK， IL-13 and Collagen I in lung tissues of six groups of

3 討論

肺纖維化的病理特征是肺組織反復(fù)損傷修復(fù)，造成肺泡持續(xù)損傷、成纖維細(xì)胞增生，最終導(dǎo)致肺間質(zhì)大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積，是許多肺部疾病的共同結(jié)局。肺纖維化早期以肺部炎癥為主，隨后進(jìn)入慢性炎癥和組織修復(fù)期，最終因成纖維細(xì)胞過度增殖、肺組織異常修復(fù)，導(dǎo)致大量膠原纖維沉積在肺間質(zhì)形成肺纖維化[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量滇龍膽草能夠明顯減輕肺纖維化小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤，抑制肺組織膠原纖維沉積，下調(diào) Collagen I表達(dá)，明顯降低肺纖維化小鼠肺泡炎、肺纖維化評分，提示滇龍膽草可減輕肺組織炎癥和間質(zhì)膠原纖維，從而減輕肺纖維化小鼠的纖維化程度。

體質(zhì)量減輕是肺纖維化的常見并發(fā)癥，而且體質(zhì)量減輕與肺纖維化患者的生存率呈負(fù)相關(guān)[13]。從小鼠28 d生長曲線可見，正常對照組小鼠體質(zhì)量增長最快，模型對照組小鼠體質(zhì)量增長最慢，提示肺纖維化對小鼠體質(zhì)量增長有一定影響，不同劑量滇龍膽草組小鼠體質(zhì)量增長明顯比模型對照組快，間接表明滇龍膽草能夠減輕肺纖維化。

MAPKs是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究證實(shí)，MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)(如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)的過程中具有至關(guān)重要的作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)哺乳動物主要有3條MAPK信號通路：Erk、 JNK和p38 MAPK信號通路。MAPK信號通路與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在肺纖維化發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號通路激活后可進(jìn)一步激活下游NF-κB信號通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和黏附分子，級聯(lián)放大肺纖維化早期炎癥反應(yīng)，還可促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分化，在肺纖維化形成中起著重要作用[15]。Erk信號通路的激活與許多致纖維化因子如 TGF-β、PDGF、CTGF有關(guān)，參與肺纖維化形成中成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[16]。JNK信號通路也參與了肺纖維化的形成，主要是通過上調(diào)促凋亡基因Bax、Fasl、p53表達(dá)從而促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞凋亡[17]。蛋白表達(dá)研究顯示，與正常對照組比較，模型對照組小鼠肺組織p38、JNK和Erk1/2蛋白表達(dá)明顯升高；與模型對照組相比，滇龍膽草各劑量組小鼠肺組織p38、JNK和Erk1/2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，呈濃度依賴效應(yīng)，提示滇龍膽草抗肺纖維化的作用機(jī)制與抑制p38/JNK/Erk MAPK信號通路有關(guān)。

IL-13是一種Th2細(xì)胞生成的促纖維化細(xì)胞因子，具有抗炎、促纖維化、免疫調(diào)節(jié)的作用，能夠抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，促使B細(xì)胞分泌抗體。研究發(fā)現(xiàn)，IL-13 與肺纖維化的發(fā)病關(guān)系密切，作為Th2細(xì)胞因子，IL-13 可促進(jìn)肺巨噬細(xì)胞由向M2型極化，產(chǎn)生促纖維化遞質(zhì)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分化[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對照組小鼠IL-13蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對照組，滇龍膽草各劑量組IL-13蛋白表達(dá)水平顯著低于模型對照組，提示滇龍膽草能夠下調(diào)肺纖維化時肺組織IL-13蛋白表達(dá)。

綜上所述，滇龍膽草能夠減輕博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，其作用機(jī)制與抑制MAPK信號通路和下調(diào)IL-13蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究可為滇龍膽草防治肺纖維化提供一定的實(shí)驗依據(jù)，為肺纖維化的治療提供新的治療策略，但由于肺纖維化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，滇龍膽草抗肺纖維化的確切作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。