TLR4/NF-κB信號通路在鼻炎靈治療過敏性鼻炎中的作用分析

魏 然，姚玉廷

過敏性鼻炎(AR)是一類以噴嚏、鼻癢和流清涕等為主要臨床特征的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病，是耳鼻咽喉科的多發(fā)病之一，患病率為4%～38%，城市患病人數(shù)多于農(nóng)村[1]，易復(fù)發(fā)。AR發(fā)病機制為輔助性T細胞Th1/Th2比例及功能失調(diào)，干擾素-γ(IFN-γ)和白細胞介素-4(IL-4)分別是Th1和Th2細胞的主要執(zhí)行因子[2]。Toll樣受體4(TLR4)在機體免疫應(yīng)答中負責(zé)識別清除體內(nèi)的變應(yīng)原[3]，促使樹突狀細胞成熟及CD4+ T細胞分化。TLR4激活后，在細胞質(zhì)內(nèi)形成復(fù)合體，經(jīng)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)活化轉(zhuǎn)移至細胞核，介導(dǎo)炎癥和Th1/Th2分化調(diào)節(jié)[4]。鼻炎靈以蒼耳子、辛夷、白芷、黃芩等為基本組方，我們在此基礎(chǔ)上進行優(yōu)化改良，增強其解毒消腫、化痰通竅之功。本文探討TLR4/NF-κB通路在鼻炎靈治療AR中的可能作用機制，以期為AR的治療及機制研究提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2019年2月—2020年2月我院確診的35例AR作為觀察組，納入標(biāo)準：符合AR診斷標(biāo)準，臨床資料完整；入院前未行脫敏或相關(guān)藥物治療；未合并其他系統(tǒng)疾??；3個月內(nèi)未服用過抗生素。另選取同期入院體檢的35例健康者作為對照組。2組基本臨床資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2療效評估 觀察組入院后采用以鼻炎靈片為主的綜合治療，在鼻炎靈片(昆明中藥廠有限公司，國藥準字Z53020774)基礎(chǔ)上改良制成片劑，每次2～4片，每日3次；對照組服用同劑量安慰劑。對比觀察組治療前后臨床特征變化。

1.3免疫組織化學(xué)染色 患者治療前及治療后在鼻內(nèi)鏡下刮取鼻腔鼻丘區(qū)域黏膜組織，石蠟包埋、切片。切片抗原修復(fù)后滴加50 μl血清，室溫孵育10 min，滴加50 μl的IFN-γ、IL-4和免疫球蛋白E(IgE)一抗，濃度為10 μg/μl，4 ℃過夜后滴加50 μl二抗，室溫孵育10 min。DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察到棕色染色為陽性。蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，PBS液返藍后，干燥封片。

1.4血清相關(guān)因子檢測 取觀察組治療前后及對照組體檢時血清樣本檢測IFN-γ、IL-4和IgE表達水平。

1.5qRT-PCR檢測TLR4/NF-κB mRNA表達 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物。收集患者鼻腔鼻丘區(qū)域黏膜組織，Trizol提取總RNA，RNA純度以1.8～2.0為宜。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，51 ℃退火45 s，72 ℃延長45 s，擴增65個循環(huán)。

1.6Western blot法檢測TLR4/NF-κB蛋白表達 裂解患者鼻腔鼻丘區(qū)域黏膜組織，低溫12 000 r/min條件下離心5 min。取上清液以BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白與5×上樣緩沖液混合煮沸5 min后行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBST洗膜后加入TLR4一抗(1︰500)4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶，室溫避光作用1 h后X線膠片顯影。采用Bio-Rad Quantity 4.5.2軟件測定區(qū)帶感光密度。

2 結(jié)果

2.1觀察組臨床特征比較 觀察組患者治療后主要臨床癥狀明顯改善，外周血嗜酸粒細胞絕對值及百分比下降(P<0.01)。見表1。

表1 過敏性鼻炎患者治療前后臨床特征比較

2.2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 觀察組患者治療前鼻腔黏膜組織標(biāo)本均可見較多的IL-4和IgE陽性染色細胞，呈叢集性分布，多集中在上皮下，也可在間質(zhì)中散在分布。治療后IL-4和IgE陽性細胞數(shù)較治療前明顯減少，而IFN-γ陽性細胞數(shù)增多。見圖1。

圖1 IFN-γ、IL-4和IgE在過敏性鼻炎患者治療前后鼻黏膜組織中的表達(SP×400)

2.3ELISA法檢測IFN-γ、IL-4和IgE表達 觀察組患者治療前IFN-γ表達水平低于對照組，IL-4和IgE水平高于對照組(P<0.05)；觀察組患者治療后IFN-γ表達水平較治療前顯著升高，IL-4和IgE表達水平較治療前降低(P<0.05)。見表2。

表2 過敏性鼻炎患者和體檢健康者IFN-γ、IL-4和IgE表達水平比較

2.4TLR4/NF-κB mRNA表達 觀察組治療后TLR4和NF-κB mRNA表達顯著降低(P<0.01)。見圖2。

圖2 AR患者和體檢健康者TLR4/NF-κB mRNA表達

2.5TLR4/NF-κB蛋白表達 觀察組治療后TLR4和NF-κB蛋白表達顯著降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 過敏性鼻炎患者和體檢健康者TLR4/NF-κB蛋白表達

3 討論

研究認為AR主要由炎性介質(zhì)引發(fā)，在多種免疫細胞及細胞因子的參與下發(fā)病，屬于IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)[5]。目前AR常采用糖皮質(zhì)激素類藥物治療，但效果不佳，易反復(fù)發(fā)作[6]。憑借中醫(yī)藥治療AR的顯著效果，越來越多的中藥制劑開始應(yīng)用于臨床。本研究發(fā)現(xiàn)治療后患者主要臨床癥狀明顯改善，外周血嗜酸粒細胞絕對值及百分比下降，提示經(jīng)鼻炎靈治療后患者取得顯著療效；治療前患者鼻腔黏膜組織標(biāo)本可見較多的IL-4和IgE陽性細胞，呈叢集性分布，治療后IL-4和IgE陽性細胞數(shù)較治療前明顯減少，IFN-γ陽性細胞數(shù)較治療前增多；觀察組治療后IFN-γ表達水平較治療前顯著升高，IL-4和IgE表達水平較治療前降低。

Th1/Th2細胞比例和功能失衡是AR發(fā)病的關(guān)鍵因素。Th2細胞主要分泌IL-4等細胞因子，與遲發(fā)性免疫反應(yīng)相關(guān)[7]。人體接觸過敏源后，Th2細胞呈過度免疫狀態(tài)[8]。Th2細胞分泌的炎性因子可調(diào)節(jié)機體變態(tài)反應(yīng)，并與局部IgE形成相關(guān)[9]。IFN-γ是由Th1細胞產(chǎn)生的重要抗炎因子，通過激活巨噬細胞，吞噬病原體發(fā)揮抗炎作用[10]。本研究通過檢測患者IFN-γ和IL-4水平變化來間接反映Th1/Th2細胞功能，結(jié)果可知患者經(jīng)治療后Th1/Th2細胞比例逐漸恢復(fù)平衡。研究發(fā)現(xiàn)，AR患者IFN-γ水平下降，誘導(dǎo)IgE合成，促使嗜酸粒細胞水平升高，通過平衡Th1/Th2細胞比例達到治療效果[11]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)鼻炎靈治療后患者TLR4和NF-κB mRNA及蛋白表達水平顯著降低。提示鼻炎靈可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，減少Th1/Th2平衡偏移，進而改變炎性因子及免疫球蛋白的表達，改善AR患者臨床癥狀。TLR4為TLRs家族成員，在機體天然免疫中發(fā)揮重要作用[12]。有研究顯示，刺激TLR可活化多個炎癥相關(guān)信號通路，其中以NF-κB信號通路研究最為廣泛[13]。TLR4/NF-κB信號通路可能通過調(diào)節(jié)Th1細胞因子的表達，從而參與機體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答過程[14-15]。

總之，TLR4/NF-κB信號通路參與了AR患者免疫炎癥反應(yīng)過程，患者經(jīng)鼻炎靈治療后可以有效抑制TLR4/NF-κB信號通路活性，平衡Th1/Th2細胞比例，增強患者治療效果。