TGF-β1、Smads在子宮內膜異位癥中的表達和意義

李冰冰 謝苗 郭亞楠 和翔宇 劉雁峰

子宮內膜異位癥(Endometriosis，EMs)為子宮內膜組織(腺體和間質)在子宮腔被覆內膜及子宮以外的部位出現、生長、浸潤，反復出血，繼而引發(fā)疼痛、不孕及結節(jié)或包塊等[1]。卵巢子宮內膜異位囊腫(又稱巧克力囊腫)的形成是由種植于卵巢表面的子宮內膜組織向卵巢皮質的浸潤內陷生長，在卵巢激素的影響下，異位內膜周期性出血，逐漸長大形成假囊，向卵巢深部擴張，壓迫周圍卵巢組織，誘發(fā)局部炎癥反應，伴纖維細胞增生及纖維化[2]。研究[3]顯示巧克力囊腫囊壁中存在的致密纖維化帶，增加了手術過程中囊腫與卵巢的剝離困難程度，同樣也導致了剝離正常卵巢組織的風險。所以巧克力囊腫對卵巢功能損傷的主要原因，一是異位病灶本身對卵巢皮質的浸潤直接損傷了卵巢組織，異位囊腫的壓迫和周圍纖維化的形成和炎癥反應又影響了卵巢的正常血供；再者就是異位囊壁中致密纖維化帶的存在增加了手術剝離的困難，導致剝離時難免攜帶正常卵巢組織[4-5]。

目前關于子宮內膜異位癥纖維化形成的機制尚不清楚，TGF-β1是引發(fā)纖維化形成的關鍵因子，可通過Smads蛋白家族的介導引發(fā)致纖維作用，研究顯示在多種纖維化疾病中起著重要的作用[6-8]。本研究采集巧克力囊腫患者異位囊腫囊壁組織、在位內膜和其它卵巢良性腫瘤患者的內膜組織，通過檢測三種組織纖維化形成情況及TGF-β1、Smads的表達水平，初步探討TGF-β1、Smads在EMs中的表達和意義。

對象與方法

一、研究對象

收集2016年9月至2019年1月收治的巧克力囊腫腹腔鏡手術患者20例(Ⅲ～Ⅳ期)，取其卵巢子宮內膜異位囊腫囊壁組織作為卵巢異位癥囊壁組，對于其中9例行宮腹腔鏡聯合手術的患者，再取其在位內膜組織作為子宮在位內膜組；同時期因其他卵巢良性腫瘤行宮腹腔鏡聯合術者9例，取其子宮內膜組織作為子宮內膜對照組。所有納入本研究的患者術后均經病理明確診斷。

1. 納入標準：(1)年齡20歲～49歲，未絕經者；(2)術前均行彩超或者CT等影像學檢查，支持卵巢腫瘤的診斷；(3)病理檢查明確診斷為卵巢子宮內膜異位囊腫或其他卵巢良性腫瘤。

2. 排除標準：(1)術前3個月內接受激素治療；(2)合并有心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等疾病、精神病患者；(3)合并生殖道惡性腫瘤、乳腺癌等雌激素依賴性疾病、腫瘤或急性炎癥。

3. EMs診斷標準：EMs診斷標準參照2015年中華醫(yī)學會婦產科學分會子宮內膜異位癥協作組制定的《子宮內膜異位癥診治指南》[1]：經腹腔鏡手術肉眼可見典型病灶，并結合病理檢查確診為EMs；病理診斷標準：病灶中可見子宮內膜腺體和間質，伴有炎癥反應及纖維化。

二、方法

1.信息采集：所有研究對象采集年齡、月經婚育史、現病史、既往病史及用藥史等信息。

2.樣本采集：巧克力囊腫患者共20例，術后采集其異位囊腫囊壁組織；其中有9例巧克力囊腫患者行宮腹腔鏡聯合術，同時采集其宮腔刮出物；其它行宮腹腔鏡聯合術的卵巢良性腫瘤患者9例，采集宮腔刮出物。將獲取的組織放置于多聚甲醛溶液中進行固定。

3.觀察指標與評價標準：以蘇木精和伊紅染色方法(HE染色法)染色，采用顯微鏡觀察卵巢異位癥囊壁組、子宮在位內膜組和子宮內膜對照組的組織形態(tài)學；采用Masson染色法來判斷卵巢異位癥囊壁組、子宮在位內膜組和子宮內膜對照組的纖維化形成情況；采用免疫組織化學法檢測卵巢異位癥囊壁組、子宮在位內膜組、子宮內膜對照組組織中TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7的表達情況。專業(yè)圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus對三組的免疫組化切片進行分析，以平均光密度值(MOD，MOD=IOD/Area)作為TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7表達強度的評價參數,在200倍拍攝倍數下，每張切片隨機觀察3個視野,取平均值作為每張切片的觀察結果。

4.主要實驗試劑：MASSON三色染色試劑盒(珠海貝索生物技術有限公司，BA-4079A)，一抗(Tgfb1)(Abcam,ab92486)，一抗(p-samd2/3)(Abcam,ab63399)，一抗(samd7)(Santa,sc-365846)。

5.主要實驗器材：石蠟包埋機(沈陽市龍首電子儀器有限公司，LS-100)，全景掃描儀(3DHISTECH，Pannoramic MIDI)，顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團公司，BA400)，攝像裝置(麥克奧迪實業(yè)集團公司，Moticcam 2306)，成像軟件系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團公司，Motic Images Advanced 3.2)。

結 果

一、基線資料比較

卵巢異位癥囊壁組、子宮在位內膜組、子宮內膜對照組患者的年齡、初潮年齡、月經周期、妊娠史均無統(tǒng)計學差異。見表1。

表1 三組患者的基線資料

二、組織學表現

1.HE染色：子宮內膜異位癥的異位內膜組織包含子宮內膜腺體、子宮內膜間質、纖維素以及富含含鐵血黃素的巨噬細胞等4種成分[2]。HE染色結果顯示，卵巢子宮內膜異位囊腫內壁可見子宮內膜樣上皮細胞，上皮層下可見內膜間質細胞，部分異位囊內壁上皮細胞不完整、稀少；囊壁可見致密結締組織，存在纖維組織的增生，伴有間質內灶狀新鮮出血或陳舊出血。見圖1。

2. Masson染色：組織切片經Masson染色后，鏡下觀察表現藍染區(qū)域為纖維化。染色結果顯示卵巢異位癥囊壁組織內均可見明顯的藍染區(qū)域，即表明纖維化沉積；而子宮在位內膜組、對照內膜組的組織中，均未見到明顯纖維化藍染區(qū)域。見圖1。

圖1 組織形態(tài)學

三、免疫組織化學結果

1.表達定位：TGF-β1、p-Smad2/3在卵巢異位癥囊壁組、子宮在位內膜組和子宮內膜對照組中均有表達，主要表達在腺上皮細胞和間質細胞細胞質中；Smad7在卵巢異位癥囊壁組、子宮在位內膜組和子宮內膜對照組中均有表達，但在卵巢異位癥囊壁組表達較弱，主要表達在腺上皮細胞細胞質中。見圖2。

2. 表達結果：卵巢異位癥囊壁組TGF-β1表達水平最高，但與子宮在位內膜組之間無統(tǒng)計學差異，與子宮內膜對照組之間表達有統(tǒng)計學差異性；子宮在位內膜組TGF-β1平均表達水平高于子宮內膜對照組，但無統(tǒng)計學差異。卵巢異位癥囊壁組p-Smad2/3表達最高，但與子宮在位內膜組之間無統(tǒng)計學差異；子宮內膜對照組p-Smad2/3表達最低，與卵巢異位癥囊壁和子宮在位內膜組之間均有統(tǒng)計學差異。卵巢異位癥囊壁組Smad7的表達含量最低，與子宮在位內膜組和子宮內膜對照組差異均有統(tǒng)計學意義；子宮在位內膜組Smad7的表達含量較對照內膜組低，差異有統(tǒng)計學意義。見表2、圖2。

表2 各組免疫組化結果

討 論

巧克力囊腫異位病灶周期性的反復出血，囊內壓力增大，異位囊腫逐漸浸潤并壓迫附近的卵巢基質，并刺激鄰近組織發(fā)生炎癥反應，逐漸造成周圍組織纖維化。因纖維化形成而致粘連，增加了手術剝離困難，從而增加了對卵巢功能的損傷。研究[3，9]顯示畸胎瘤囊壁中存在致密纖維化帶和疏松帶，而巧克力囊腫囊壁只存在致密的纖維化帶，且異位囊壁纖維化致密帶和卵巢皮質的厚度均厚于畸胎瘤，致密纖維化帶應該是增加手術剝離異位囊腫困難的原因，卵巢組織存在被攜帶剝離的可能。另一方面，異位病灶的浸潤性生長導致了卵巢皮質的損傷，從而對卵巢功能產生影響[10]。已有研究顯示巧克力囊腫卵巢組織中發(fā)生了纖維化和炎癥，繼而伴隨著血管化減少和氧化應激增加[11]，這也可能是導致卵泡激活和隨后卵泡丟失的原因。

TGF-β1主要由巨噬細胞分泌，參與組織的纖維化作用，可促進間質細胞的生長，增加ECM的形成，能夠明顯地促進纖維母細胞增生、膠原的沉積，在肺纖維化、肝纖維化和心臟纖維等疾病中均起著一定的致纖維化作用[6-8]。相較于野生型小鼠，TGF-β1缺失小鼠的子宮內膜異位病變重量、腺上皮比例、巨噬細胞和α平滑肌肌動蛋白陽性肌成纖維細胞的豐度均降低[12]。高水平的TGF-β1是子宮內膜異位癥異位病變發(fā)展的重要調節(jié)因子，可增強子宮內膜異位細胞或組織的遷移、粘附、侵襲性和定殖潛力[13]。Smad介導的TGF-β1是引起纖維化的最重要信號傳導途徑之一。Smad2和Smad3是受體調節(jié)型Smad，可被Ⅰ型受體直接磷酸化激活，p-Smad2/3和通用型Smad結合成多聚體轉移至細胞核，然后調節(jié)靶基因轉錄；Smad7作為抑制型Smad可阻止Smad信號傳導。研究[14]顯示Smad3在TGF-β1致肝纖維化疾病中發(fā)揮著重要作用，可促進ECM的產生增加。Smad7還可以和TGF-β受體I競爭性結合，從而對Smad2或Smad3的磷酸化產生抑制，阻斷TGF-β信號的后續(xù)傳導[15]。

本研究結果顯示，與子宮內膜對照組相比，卵巢異位癥囊壁組和子宮在位內膜組TGF-β1的表達水平高，TGF-β1可促進纖維母細胞增生、膠原沉積，導致內異癥纖維化的形成。與對照內膜組相比，卵巢異位癥囊壁組和子宮在位內膜組中存在p-Smad2/3的高表達，而Smad7的表達相對低。研究結果推測p-Smad2/3參與子宮內膜異位癥疾病，在促進異位細胞增殖分化、血管生成和纖維化形成中起到一定的作用。作為抑制型的Smad7在異位囊壁和在位內模組中的低表達，可能表明Smad7對Samd介導的TGF-β1信號通路抑制減弱，從而Smad介導TGF-β1信號通路的致纖維化作用增強，促進了子宮內膜異位癥纖維化的形成。TGF-β1/Smads通路在多種疾病的纖維化形成中起著關鍵作用，相關研究也逐漸證實，其在子宮內膜異位癥中的作用還有待深入的研究。纖維化形成是子宮內膜異位癥的主要病理特點之一，以纖維化為切入點，可有望為子宮內膜異位癥發(fā)病機制和治療的研究提供一個新的視角。