壯腎固精方治療IgA腎病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制

王艾琳， 劉立昌， 劉旭生， 劉新

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院，廣東珠海 519015）

IgA腎?。↖gA nephropathy）是以血尿、蛋白尿、水腫、高血壓為主要臨床表現(xiàn)的原發(fā)性腎小球疾病，在我國(guó)的發(fā)病率較高，占原發(fā)性腎小球疾病的45%～50%。本病并非良性病變，超過(guò)1/3的IgA腎病患者發(fā)病20年后發(fā)展至終末期腎臟病（end stage renal disease，ESRD），是引起我國(guó)青年患者腎衰竭的常見(jiàn)病因[1]。目前，西醫(yī)臨床主要是應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素受體阻滯劑（ARB）類藥物控制血壓，減少尿蛋白，穩(wěn)定腎功能進(jìn)展，對(duì)療效欠佳者可應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或聯(lián)合免疫抑制劑治療，但激素及免疫抑制劑治療IgA腎病的同時(shí)往往帶來(lái)一些副作用。而中醫(yī)藥在IgA腎病的防治中發(fā)揮了重要作用，具有增強(qiáng)療效、改善腎功能、緩解癥狀、降低激素毒副作用等優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)學(xué)根據(jù)不同癥狀將IgA腎病歸為“尿血”“尿濁”“水腫”等范疇。本病為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證，本虛主要指脾腎氣虛、肝腎陰虛、氣陰兩虛等，標(biāo)實(shí)主要指熱毒、濕熱、瘀血。廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院劉新主任醫(yī)師在多年的臨床實(shí)踐中，對(duì)各家研究成果及個(gè)人經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)和歸納，創(chuàng)制以補(bǔ)腎健脾、活血固精、清熱利濕為組方原則的壯腎固精方，該方由黃芪、黃精、金櫻子、菟絲子、覆盆子、水蛭、野蕎麥根等中藥組成。本課題組前期臨床觀察初步證實(shí)壯腎固精方可有效降低蛋白尿和血尿水平[2-4]。為進(jìn)一步明確壯腎固精方治療IgA腎病的作用機(jī)制以推廣臨床應(yīng)用，故借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合了網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)和多項(xiàng)藥理學(xué)，依托組學(xué)和大數(shù)據(jù)高速發(fā)展，能高效準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)中藥復(fù)方中的活性成分、作用靶標(biāo)并發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制，從分子水平上闡述“病證”與“方藥”的關(guān)系[5]，為臨床使用中醫(yī)藥治療疾病奠定理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 搜集壯腎固精方活性成分與作用靶點(diǎn)首先在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https://tcmspw.com/tcmsp.php）中分別檢索壯腎固精方中的“黃芪”“黃精”“金櫻子”“菟絲子”“覆盆子”“野蕎麥根”，獲取這些藥物的活性成分。應(yīng)用TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.megabionet.org/tcmid/）和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）預(yù) 測(cè) 出“水蛭”的相應(yīng)指標(biāo)。按照口服生物利用度（OB）＞30%、類藥性（DL）＞0.18的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所獲取的藥物活性成分進(jìn)行篩選，得到這些藥物的有效化學(xué)成分以及有效成分相對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。然后應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）對(duì)上述方法得到的藥物作用靶點(diǎn)名稱進(jìn)行轉(zhuǎn)換，得到相對(duì)應(yīng)的基因名。最后，通過(guò)Cytoscape 3.8.0生物信息分析軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.2 搜集壯腎固精方治療IgA腎病的相關(guān)靶點(diǎn)在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）及PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.pharmgkb.org/）中搜索關(guān)鍵詞“IgA nephropathy”（IgA腎?。@得與IgA腎病相關(guān)的靶點(diǎn)。以上3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)為使用率較高的人類疾病基因綜合檢索數(shù)據(jù)庫(kù)。然后使用半編程性質(zhì)的腳本性軟件Rproject對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)搜集到的本疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行剔重和匯總，并對(duì)壯腎固精方藥物靶點(diǎn)與IgA腎病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，構(gòu)建Venn圖。

1.3 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)與分析

將上述方法得到的相關(guān)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)（http://stringdb.org），設(shè)定物種（Organism）為人類（Homosapiens），獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置最高置信程度（highest confidence：0.9）作為篩選條件，導(dǎo)出.tsv格式文件，然后將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，根據(jù)度（degree）值的排序得到排名前5位的基因，用CytoNCA組件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中10個(gè)核心基因。

1.4 分析重要靶點(diǎn)的基因功能和信號(hào)通路使用R project軟件中的clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot和ggplot2包對(duì)壯腎固精方治療IgA腎病的重要靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析，將富集分析得到的結(jié)果以條形圖和氣泡圖形式予可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 壯腎固精方活性成分的篩選在TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)及SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)OB＞30%、DL＞0.18的標(biāo)準(zhǔn)共篩選出57個(gè)活性成分，其詳細(xì)信息見(jiàn)表1所示。

表1 壯腎固精方活性成分的篩選結(jié)果Table 1 Screening results of active ingredients in Zhuangshen Gujing Prescription

2.2 壯腎固精方活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖1），并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?。結(jié)果顯示：成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖共包含138個(gè)節(jié)點(diǎn)，335條邊；度值前5位的活性成分為槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、黃芩素（baicalein）、刺芒柄花素（formononetin）；度值前5位的靶點(diǎn)為PTGS2、PTGS1、PRSS1、DPP4、ESR1。

圖1 壯腎固精方活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Figure 1 Ingredient-target network of Zhuangshen Gujing Prescription

2.3 壯腎固精方治療IgA腎病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)及PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到與IgA腎病相關(guān)的靶點(diǎn)1 213個(gè)。使用R project軟件對(duì)壯腎固精方藥物靶點(diǎn)與IgA腎病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，取交集后構(gòu)建韋恩（Venn）圖（見(jiàn)圖2），共 獲 得CDK2、ESR1、RELA、VEGFA、CDKN1A、MMP2、MMP9、NFKBIA、CXCL8、GSTP1、GSTM1、PTGS2、DPP4、PTGS1、ADRB2、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、NOS2、PPARG、PRSS1、IKBKB、AKT1、MAPK8、MMP1、STAT1、CDK1、HMOX1、CYP3A4、CYP1A1、ICAM1、SELE、VCAM1、ALOX5、SLPI、AKR1B1、MMP3、EGFR、CCND1、BCL2L1、FOS、PLAU、MAPK1、IL10RA、EGF、RB1、TP53、SOD1、HIF1A、HSPA5、ERBB2、CAV1、MYC、F3、IL1B、CCL2、NOS3、HSPB1、IL2RB、PLAT、THBD、SERPINE1、COL1A1、IFNG、IL1A、MPO、NQO1、PARP1、PPARA、CXCL10、CHUK、SPP1、RUNX2、E2F1、CD40LG、DPEP1、CYCS、G6PD、MAPK14、ADH1B、HPSE、CD44等87個(gè)交集基因。

圖2 壯腎固精方治療IgA腎病靶點(diǎn)的韋恩（Venn）圖Figure 2 The Venn graph of Zhuangshen Gujing Prescription in the treatment of IgA nephropathy

2.4 壯腎固精方治療IgA腎病的PPI網(wǎng)絡(luò)為了更全面地認(rèn)識(shí)壯腎固精方治療IgA腎病的作用機(jī)制，將“2.3”項(xiàng)所得的疾病與藥物的交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖3）。網(wǎng)絡(luò)中共包含79個(gè)節(jié)點(diǎn)，301條邊。導(dǎo)出.tsv格式文件，然后將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，根據(jù)度值的排序得到排名前5位的基因?yàn)镻TGS2、PTGS1、PRSS1、DPP4、ESR1。利用CytoNCA組件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，分別為T(mén)P53、AKT1、JUN、MAPK1、RELA、MAPK14、ESR1、MYC、MAPK8、FOS。見(jiàn)圖4。

圖3 壯腎固精方治療IgA腎病的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 3 The PPInetwork of Zhuangshen Gujing Prescription in the treatment of IgA nephropathy

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因Figure 4 Core genes of PPInetwork

2.5GO功能富集分析與KEGG通路富集分析GO富集分析的結(jié)果顯示：生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）主要與細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to chemical stress）、對(duì)脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）有關(guān)；細(xì)胞組件（cellular component，CC）主 要 與 薄 膜 筏 子（membrane raft）、微域膜（membrane microdomain）有關(guān)；分子功能（molecular function，MF）主要與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）有關(guān)。KEGG富集分析結(jié)果顯示壯腎固精方治療IgA腎病可能與絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、核因子kappa B信號(hào)通路（NF-kappa B signaling pathway）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號(hào)通路（PI3KAkt signaling pathway）、Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子信號(hào)通路（JAK-STAT signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、白細(xì)胞介素17信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）等有關(guān)。具體結(jié)果見(jiàn)圖5～圖6。

圖5 壯腎固精方治療IgA腎病靶點(diǎn)的GO功能富集分析Figure 5 GO enrichment analysis of targets of Zhuangshen Gujing Prescription in the treatment of IgA nephropathy

圖6 壯腎固精方治療IgA腎病靶點(diǎn)的KEGG富集分析Figure 6 KEGG enrichment analysis of targets of Zhuangshen Gujing Prescription in the treatment of IgA nephropathy

3 討論

IgA腎病屬于自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為IgA亞型的異常表達(dá)。缺乏半乳糖型IgA（Gd-IgA1）是一種可以與IgG或IgA1形成免疫復(fù)合物的抗聚糖自體抗體。形成的復(fù)合物沉積在腎小球系膜上，刺激系膜細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞因子的聚集，繼而導(dǎo)致足突細(xì)胞基因表達(dá)和腎小球滲透性阻力指標(biāo)的變化，逐漸發(fā)展為腎小球硬化和間質(zhì)纖維化，并伴有腎功能受損，最終出現(xiàn)終末期腎臟病[6]。根據(jù)全球腎臟病預(yù)后組織（KDIGO）指南，目前IgA腎病的治療方案主要為抗蛋白尿和抗高血壓治療及應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和魚(yú)油[7]。對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)的患者，通常需要聯(lián)合使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑。然而，這種治療方案會(huì)對(duì)患者機(jī)體造成較大損傷[8]。經(jīng)過(guò)前期的臨床觀察，我們發(fā)現(xiàn)壯腎固精方可以有效減輕IgA腎病患者的蛋白尿和血尿水平，壯腎固精方聯(lián)合常規(guī)治療可以有效降低患者的毒副作用，但其治療機(jī)制尚不明確。

本研究通過(guò)步驟“2.2”項(xiàng)得到了有效成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到度值?位的有效成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素、刺芒柄花素。其中，槲皮素是菟絲子、金櫻子、金蕎麥、覆盆子、黃芪的共同有效成分，木犀草素是金蕎麥的有效成分，山柰酚是菟絲子、金櫻子、覆盆子、黃芪的共同有效成分，黃芩素是黃精的有效成分，刺芒柄花素是黃芪的有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有很好的抗炎作用，可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，保護(hù)腎小球足細(xì)胞，從而改善腎臟損傷，還可以抑制NF-κBp65和Toll樣受體2（TLR2）蛋白的表達(dá)，以減輕腎臟氧化應(yīng)激，延緩腎功能衰竭[9-11]。木犀草素能通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度抑制腎動(dòng)脈收縮，擴(kuò)張已收縮的腎動(dòng)脈，降低血壓，可聯(lián)合其他藥物治療IgA腎病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)生的高血壓，還可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，具有抗炎、抗氧化的作用[12-13]。方中多種藥物共有的有效成分山柰酚可通過(guò)抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，對(duì)腎臟損害起到保護(hù)作用，還可以緩解腎組織病理?yè)p傷，抑制腎組織細(xì)胞凋亡，改善腎功能[14-15]。杜忠祥等[16]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可以降低血清尿素氮（BUN）水平、提高腎臟組織超氧化物歧化酶（SOD）活性并降低丙二醛（MDA）含量，減輕腎臟組織細(xì)胞凋亡，對(duì)腎損傷有修復(fù)作用。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)的分析，本研究結(jié)果顯示，雌激素受體1（ESR1）、蛋白激酶B1（AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）等基因的度值較高，且屬于核心基因，因此，推測(cè)這些基因可能在壯腎固精方的起效過(guò)程中發(fā)揮明顯的靶向作用。有研究表明，ESR1可抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路，從而改善腎小管間質(zhì)纖維化，保護(hù)腎功能[17]。Gong等[18]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)ESR1編碼的雌激素相關(guān)受體α（ERRα）可以促進(jìn)大鼠腎小球系膜細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)。有研究證明，Akt的活化可使多聚體IgA（pIgA）與單核細(xì)胞上的FcαRI受體結(jié)合，形成循環(huán)pIgA-FcαRI復(fù)合物[19-20]，并沉積在腎小球系膜區(qū)，引發(fā)系膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，這一過(guò)程在IgA腎病發(fā)展中可能起關(guān)鍵作用[21]。MAPK參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等多個(gè)環(huán)節(jié)，起重要的調(diào)節(jié)、控制作用，已有研究證實(shí)其與IgA患者腎小管間質(zhì)纖維化有關(guān)[22]，可以影響IgA患者的預(yù)后。

最后，本研究對(duì)壯腎固精方治療IgA腎病的重要靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。根據(jù)GO、KEGG分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)壯腎固精方起效的生物學(xué)過(guò)程主要與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的反應(yīng)有關(guān)：核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是一種可以保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，與機(jī)體炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)有重要關(guān)系，而越來(lái)越多證據(jù)顯示，其在各類慢性腎臟病中發(fā)揮主要作用[23-25]。這表明氧化應(yīng)激在IgA腎病的發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。本研究所篩選出的有效成分及重要靶點(diǎn)的主要作用也顯示，壯腎固精方治療IgA腎病的作用機(jī)制主要與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，這與GO、KEGG分析結(jié)果相符。可據(jù)此推測(cè)，壯腎固精方主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激過(guò)程發(fā)揮治療IgA腎病的作用。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析壯腎固精方治療IgA腎病的有效成分、作用靶點(diǎn)和起效機(jī)制，進(jìn)一步闡釋了壯腎固精方的治療作用機(jī)制，為臨床選擇治療方案和后續(xù)基礎(chǔ)研究指明了方向和奠定了理論基礎(chǔ)。但由于壯腎固精方組成藥物較多，并且受限于當(dāng)前數(shù)據(jù)庫(kù)，其發(fā)揮治療作用的具體機(jī)制尚需要更進(jìn)一步的研究。