基于“氣血兩清”理論探討浮萍-紫草對銀屑病模型小鼠皮膚屏障功能的影響

袁佳晴， 朱新景， 王星星， 鄭琳琳， 景慧玲

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽 712046；2.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西西安 710021）

銀屑病（psoriasis）是一種由免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，主要表現(xiàn)為紅斑、浸潤、鱗屑，累及人群較廣[1-2]。有研究證實，銀屑病與關(guān)節(jié)炎、心血管炎有相關(guān)性，危害較大[3]，臨床上西醫(yī)常規(guī)治療效果不甚理想，復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響了患者的身心健康[4]。而中醫(yī)藥治療該病具有一定的優(yōu)勢。浮萍-紫草是疏風(fēng)清熱涼血中藥藥對，臨床常用于該病的治療。本課題組前期已發(fā)現(xiàn)紫草的藥效成分紫草素可通過Hippo-Yap信號通路在銀屑病的早期發(fā)揮作用[5]。因此，本研究通過動物實驗，基于“氣血兩清”理論進(jìn)一步探討“浮萍-紫草”對銀屑病模型小鼠皮膚屏障功能的影響，以期為其臨床推廣應(yīng)用提供基礎(chǔ)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級6～8周齡Balb/c小鼠120只，體質(zhì)量（18±2）g，雌雄各半，購于第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（陜）2018-001。飼養(yǎng)于西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院實驗室，室溫22～25℃，相對濕度40%～60%，自由飲水進(jìn)食。適應(yīng)1周后進(jìn)行實驗。

1.2 藥物、試劑與儀器木犀草素（標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司提供，批號：B20888）；紫草素（標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司提供，批號：B21682）；阿維A膠囊（重慶華邦制藥有限公司產(chǎn)品，批號：H20010126）；咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限公司，批號：H20030128）。10%甲醛溶液（太原市衛(wèi)星制藥有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。GPSkin Barrier檢測儀（北京安德普泰醫(yī)療科技有限公司）；CX31型顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）。

1.3 分組、造模與給藥將120只小鼠隨機分為12組，即空白組，模型組，陽性對照組，浮萍低、中、高濃度組，紫草低、中、高濃度組，浮萍-紫草低、中、高濃度組，每組10只。

造模方法[6-7]：造模前1 d，除空白組外，其他各組小鼠脊背兩側(cè)均進(jìn)行脫毛處理，面積約為3 cm×3 cm。次日10∶00，在脫毛區(qū)域外涂5%咪喹莫特乳膏42 mg，1次/d，連續(xù)7 d?？瞻捉M僅做脫毛處理。

給藥與造模同時進(jìn)行。各組小鼠于每日16∶00給藥：空白組、模型組灌胃生理鹽水；陽性對照組灌胃阿維A的蒸餾水混懸液；浮萍低、中、高濃度組分別灌胃20、40、80 mg/kg木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品的蒸餾水混懸液；紫草低、中、高濃度組分別灌胃20、40、80 mg/kg紫草素標(biāo)準(zhǔn)品的蒸餾水混懸液；浮萍-紫草低、中、高濃度組分別灌胃20、40、80 mg/kg木犀草素與紫草素標(biāo)準(zhǔn)品混懸液[8]。1次/d，連續(xù)7 d。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 銀屑病面積及嚴(yán)重指數(shù)（PASI）評分 采用PASI評分標(biāo)準(zhǔn)[9]，對皮膚癥狀從紅斑、浸潤、鱗屑3項指標(biāo)進(jìn)行評價，以0～4分進(jìn)行記分：無癥狀，計0分；輕度，計1分；中度，計2分；重度，計3分；極重度，計4分。將各指標(biāo)積分相加得到總積分。

1.4.2 皮膚組織病理學(xué)觀察 造模與給藥結(jié)束后，頸椎脫臼處死各組小鼠，剪取背部皮損處組織，用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察皮損組織的病理表現(xiàn)。

1.4.3 皮膚屏障功能檢測 分別于干預(yù)的第1、3、7天，采用GPSkin Barrier檢測儀測量小鼠經(jīng)表皮水分丟失（TEWL）、角質(zhì)層含水量（SCH）、皮膚濕度。

1.5 統(tǒng)計方法采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮膚銀屑病面積及嚴(yán)重指數(shù)（PASI）比較圖1結(jié)果顯示：干預(yù)第7天，與模型組比較，各治療組PASI評分均有所降低，且與陽性對照組比較，浮萍高濃度組、紫草各濃度組、浮萍-紫草各濃度組改善更明顯（P＜0.05）。浮萍高濃度組、紫草高濃度組、浮萍-紫草高濃度組PASI評分于干預(yù)第7天低于相應(yīng)中、低濃度組（P＜0.05）。可見浮萍、紫草、浮萍-紫草高濃度效果明顯，且浮萍-紫草組效果優(yōu)于浮萍組、紫草組。

圖1 各組小鼠皮膚銀屑病面積及嚴(yán)重指數(shù)（PASI）評分變化Figure 1 Comparison of changes of PASIscore of mice in various groups

圖2 結(jié)果顯示：干預(yù)第7天，空白組無變化，其他各組都出現(xiàn)不同程度的紅斑、浸潤、鱗屑。與模型組比較，各治療組的紅斑、浸潤、鱗屑都相對減輕。與陽性對照組比較，中、高濃度的浮萍組、紫草組、浮萍-紫草組的紅斑、浸潤、鱗屑均有不同程度的減輕。在浮萍組中，高濃度組的皮損較低、中濃度組減輕；在紫草組中，高濃度組的皮損較低、中濃度組減輕；在浮萍-紫草組中，高濃度組的皮損較低、中濃度組減輕。各中藥組的比較中，浮萍-紫草組皮損改善情況最優(yōu)、效果更明顯。

圖2 各組小鼠干預(yù)第7天皮膚外觀差異比較Figure 2 Comparison of mouse skin appearance of various groups on day 7 of intervention

2.2 各組小鼠皮膚組織病理表現(xiàn)比較圖3結(jié)果顯示：空白組小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)清楚，層次分明，表皮厚度正常；模型組小鼠可見皮損類銀屑病樣，表現(xiàn)為表皮明顯增厚，伴角化不全，棘層增厚，顆粒層明顯減少，表皮突延長，真皮層可見乳頭水腫、血管擴張，伴見炎性細(xì)胞浸潤；與模型組比較，各給藥組小鼠皮損處表皮可見不同程度變薄，角化不全明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤也減少，其中，浮萍-紫草高濃度組改善程度最為明顯，其次為紫草高濃度組和浮萍高濃度組。

圖3 各組小鼠皮膚組織病理表現(xiàn)比較（HE染色法，×400）Figure 3 Comparison of changes of mouse skin lesions in various groups（by HE staining，×400）

2.3 各組小鼠不同時間經(jīng)表皮水分流失（TEWL）比較表1結(jié)果顯示：干預(yù)第1天，各組TEWL比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠不同時間經(jīng)表皮水分流失（TEWL）比較Table 1 Comparison of transepidermal water loss（TEWL）of mice in various groups at different intervention time [±s，g/（h·m2）]

表1 各組小鼠不同時間經(jīng)表皮水分流失（TEWL）比較Table 1 Comparison of transepidermal water loss（TEWL）of mice in various groups at different intervention time [±s，g/（h·m2）]

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較；⑤P＜0.05，與陽性對照組比較

?

干預(yù)第4天，與空白組比較，模型組TEWL升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而陽性對照組、浮萍中濃度組、紫草中濃度組TEWL降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組TEWL均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

干預(yù)第7天，與空白組比較，模型組TEWL升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而各給藥組TEWL均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TEWL均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其中，浮萍-紫草高濃度組TEWL明顯低于陽性對照組（P＜0.05）。

2.4 各組小鼠不同時間角質(zhì)層含水量（SCH）比較表2結(jié)果顯示：干預(yù)第1天，與空白組比較，浮萍高濃度組SCH升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠不同時間角質(zhì)層含水量（SCH）比較Table 2 Comparison of stratum corneum hydration（SCH）of mice in various groups at different intervention time （±s，%）

表2 各組小鼠不同時間角質(zhì)層含水量（SCH）比較Table 2 Comparison of stratum corneum hydration（SCH）of mice in various groups at different intervention time （±s，%）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較；⑤P＜0.05，⑥P＜0.01，與陽性對照組比較

?

干預(yù)第4天，各組小鼠SCH較干預(yù)第1天均有所下降。與空白組比較，模型組，浮萍高濃度組，紫草中、高濃度組，浮萍-紫草中、高濃度組小鼠SCH降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組，浮萍高濃度組，紫草低、中、高濃度組，浮萍-紫草中、高濃度組SCH升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），且浮萍低濃度組，浮萍-紫草低、中、高濃度組SCH高于陽性對照組（P＜0.05或P＜0.01）。

干預(yù)第7天，除模型組外，其余各組SCH含量較第4天均有所升高。與空白組比較，模型組，紫草低、高濃度組SCH升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組，浮萍高濃度組，紫草高濃度組，浮萍-紫草中、高濃度組SCH升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與陽性對照組比較，紫草低、中濃度組，浮萍-紫草低濃度組SCH升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5 各組小鼠不同時間皮膚濕度比較表3結(jié)果顯示：干預(yù)第1天，各組皮膚濕度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組小鼠不同時間皮膚濕度比較Table 3 Comparison of mouse skin moisture of various groups at different intervention time （±s，%）

表3 各組小鼠不同時間皮膚濕度比較Table 3 Comparison of mouse skin moisture of various groups at different intervention time （±s，%）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較

?

干預(yù)第4天，各組皮膚濕度較干預(yù)第1天均有所降低。與空白組比較，模型組，浮萍中濃度組，紫草低、中濃度組，浮萍-紫草低、中濃度組皮膚濕度皮膚濕度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組，浮萍低、中、高濃度組，紫草低、高濃度組，浮萍-紫草高濃度組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；各治療組間皮膚濕度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

干預(yù)第7天，除模型組外，其余各組皮膚濕度較干預(yù)第4天均有所升高。與模型組比較，浮萍-紫草低、高濃度組皮膚濕度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

銀屑病在中醫(yī)學(xué)中稱為“白疕”，多由于素體血中蘊熱，復(fù)感風(fēng)熱毒邪，或恣食腥發(fā)動風(fēng)之物，或情志內(nèi)傷，五志化火，兩陽相合，內(nèi)不能疏泄，燔灼血液，充斥肌膚，發(fā)為白疕[10]。因此，中醫(yī)辨證治療銀屑病的主要治法是清熱涼血解毒、祛風(fēng)散邪止癢。在臨床治療中，氣血兩清是較為常用的方法，浮萍紫草藥對出自名老中醫(yī)施今墨[11]，二者可氣血雙清，透疹解毒，祛風(fēng)止癢。藥對浮萍-紫草中：浮萍味辛，性寒，入肺經(jīng)達(dá)皮膚，體輕氣浮，偏走氣分，升散力強；紫草味甘，性寒，色紫質(zhì)滑，入心、肝經(jīng)，專入血分，長于清血分熱毒。浮萍-紫草二藥伍用，一氣一血，氣血兩清，透疹解毒，祛風(fēng)止癢[11]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，紫草抗銀屑病作用主要因其主要成分紫草素可抑制表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、抑制炎癥反應(yīng)、抑制血管增生[12-13]。本課題組前期在“從血論治”的理論指導(dǎo)下，對紫草的抗銀屑病作用機制進(jìn)行了研究[14]。浮萍的主要成分是木犀草素、芹菜素[15]，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)浮萍能夠抗氧化、抗衰老、止癢[16-17]，其主要成分木犀草素可抗氧化、抗炎[18]、降低VEGF的表達(dá)，抗黑素瘤[19]。為有效地驗證浮萍與紫草的現(xiàn)代藥理研究及其藥對對銀屑病的治療作用機制，故選擇浮萍、紫草的主要活性成分作為研究對象，觀察其對銀屑病皮損區(qū)的皮膚屏障修復(fù)作用機制，也為后期的細(xì)胞實驗奠定了一定的基礎(chǔ)。本研究的直接指標(biāo)皮損結(jié)果顯示：模型組存在表皮增厚、棘層增厚、顆粒層減少、炎性細(xì)胞減少等銀屑病樣的皮損，而浮萍-紫草藥對能使銀屑病皮膚表皮不同程度變薄，角化不全明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤也減少，表明浮萍-紫草藥對可改善銀屑病小鼠的皮損。

本研究于干預(yù)第1、4、7天時，計算PASI評分并檢測TEWL、SCH、皮膚濕度，探討浮萍-紫草藥對對銀屑病小鼠皮膚屏障功能的影響。PASI結(jié)果顯示：干預(yù)第7天，除模型組外，與陽性對照組比較，浮萍組、紫草組、浮萍-紫草組的PASI評分均降低，表明浮萍組、紫草組、浮萍紫草組對皮損改善作用優(yōu)于陽性對照組。且在浮萍組、紫草組、浮萍-紫草組中，浮萍、紫草聯(lián)用治療效果優(yōu)于單藥使用。

有研究證實，銀屑病皮膚屏障功能缺損[20]。本研究結(jié)果顯示：模型組TEWL顯著升高，SCH明顯降低，表明銀屑病存在皮膚屏障功能的缺損。而使用浮萍-紫草藥對可以不同程度地改善銀屑病受損皮膚屏障功能，提示浮萍-紫草藥對可減少皮膚SCH，增加角質(zhì)層的含水量，提高表皮濕度，從而修復(fù)屏障。

綜上所述，改善皮膚屏障功能是預(yù)防治療銀屑病的關(guān)鍵步驟。本研究通過動物實驗也證實了中藥浮萍、紫草分別或聯(lián)合均能改善小鼠銀屑病模型的皮損，對銀屑病的皮膚屏障功能有修復(fù)作用，且藥對聯(lián)合改善作用更加顯著，體現(xiàn)了“氣血兩清”。這對于今后銀屑病的診治有一定的指導(dǎo)意義。后期將以皮膚屏障等相關(guān)因子、免疫相關(guān)因子為切入點進(jìn)一步探討浮萍-紫草治療銀屑病的相關(guān)機制，以為其今后的臨床工作提供基礎(chǔ)理論支持。