菟絲子總黃酮對(duì)大鼠卵巢儲(chǔ)備功能減退的改善作用

頓彩虹， 白愛紅， 謝文燕， 戚靜宜

（1.漯河市婦幼保健院生殖遺傳科，河南漯河 462000；2.洛陽市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河南洛陽 471699）

卵巢儲(chǔ)備功能是指卵巢皮質(zhì)區(qū)域卵泡生長(zhǎng)、發(fā)育、形成可受精卵泡的功能，反映女性生育潛能及生殖內(nèi)分泌功能[1]。若卵巢儲(chǔ)備功能下降，將減少卵巢內(nèi)儲(chǔ)存的可募集卵泡數(shù)目，導(dǎo)致卵巢形成卵子的能力減弱、卵泡質(zhì)量下降，影響女性的生育能力，表現(xiàn)為閉經(jīng)、月經(jīng)稀發(fā)、不孕甚至卵巢早衰等[2-3]。中醫(yī)在調(diào)節(jié)女性生殖功能失調(diào)性疾病方面具有獨(dú)到之處，對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能減退主要從肝腎辨證論治入手，同時(shí)兼顧痰濕、氣血等，可促進(jìn)性腺軸恢復(fù)正常，增強(qiáng)卵巢功能，防止出現(xiàn)病理性改變，平衡性激素分泌[4]。菟絲子為旋花科植物菟絲Cuscuta chinensisLam.的種子，味辛、甘，性微溫，入肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)肝明目、安胎的功效。菟絲子為溫陽補(bǔ)腎之要藥，可改善機(jī)體內(nèi)分泌，增強(qiáng)性功能，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[5]。菟絲子總黃酮為菟絲子的主要成分，現(xiàn)代藥理研究表明，其可改善大鼠生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)損傷[6]，對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸有多方面作用，可恢復(fù)下丘腦-垂體促性腺功能，增加垂體、卵巢對(duì)激素的反應(yīng)性，促進(jìn)卵泡發(fā)育，提高卵巢激素受體數(shù)量與功能，有類雌激素樣活性[7-8]。本研究構(gòu)建卵巢儲(chǔ)備功能減退大鼠模型，旨在探討菟絲子總黃酮改善卵巢儲(chǔ)備功能的作用及其可能機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用菟絲子總黃酮改善卵巢儲(chǔ)備功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雌性SD大鼠68只，21日齡，體質(zhì)量（50±2）g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。實(shí)驗(yàn)單位為河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)開展前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食水，自然光照。

1.2 藥物、試劑與儀器菟絲子總黃酮（純度＞98%，購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司，批號(hào)：20191204）。去氧乙烯基環(huán)己烯（4-cinylcyclohexene diepoxide，VCD）、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）信號(hào)通路抑制劑H-89（純度＞99%，碧云天生物技術(shù)有限公司）；促卵泡激素（FSH）、促黃體激素（LH）、雌二醇（E2）、cAMP酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海士鋒生物科技有限公司）；兔抗大鼠卵泡刺激素受體（FSHR）、PKA、磷酸化PKA（p-PKA）、β-actin單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）抗體（艾美捷科技有限公司）。電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；-80℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；恒溫冰凍切片機(jī)、EG1150組織包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（美國(guó)Media Cybernetics公司）。

1.3 分組與造模68只21日齡的雌性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后達(dá)28日齡，陰門開啟，經(jīng)陰道脫落細(xì)胞涂片篩查，性周期正常。抽取10只大鼠設(shè)為正常組，其余構(gòu)建卵巢儲(chǔ)備功能減退模型[9]，方法：取VCD溶入芝麻油，配制濃度為80 mg/kg，每天1次，連續(xù)腹腔注射15 d，0.2 mL/只。正常組腹腔注射等體積芝麻油，每天1次。造模期間每日上午7∶00—8∶00進(jìn)行陰道涂片，陰道上皮無動(dòng)情周期變化，或動(dòng)情周期明顯延長(zhǎng)，則提示卵巢儲(chǔ)備功能減退大鼠造模成功[10]。造模成功大鼠48只，成功率為82.76%，隨機(jī)分為抑制劑組、模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組，每組12只。

1.4 干預(yù)方法造模成功后次日給藥：抑制劑組灌胃H-89 0.1 mg/kg[11]，菟絲子總黃酮組灌胃菟絲子總黃酮530.1 mg/kg[12]，抑制劑+菟絲子總黃酮組先灌胃菟絲子總黃酮530.1mg/kg再灌胃H-890.1mg/kg，模型組、正常組灌胃等體積生理鹽水，均連續(xù)4周，每周休息1 d。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 取材 給藥結(jié)束后，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 mL。處死大鼠，分離兩側(cè)卵巢組織，稱質(zhì)量。繼而將卵巢組織處理如下：一份液氮冷凍；一份以40 g/L多聚甲醛固定24 h，沖洗后濾紙吸干多余水分，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，制作蠟塊保存。

1.5.2 觀察大鼠一般狀況及測(cè)定卵巢濕質(zhì)量、卵巢指數(shù) 觀察大鼠一般狀況，包括形態(tài)、活動(dòng)、毛色、體質(zhì)量等，稱兩側(cè)卵巢濕質(zhì)量，計(jì)算卵巢指數(shù)，公式：左側(cè)（右側(cè)）卵巢指數(shù)=左側(cè)（右側(cè)）卵巢濕質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）。

1.5.3 ELISA法檢測(cè)血清性激素水平 取大鼠腹主動(dòng)脈血液標(biāo)本，取血后快速置入促凝管內(nèi)，室溫靜置1 h，3 000 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min，取血清待用。按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清FSH、LH、E2水平，并計(jì)算FSH/LH。應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，計(jì)算各指標(biāo)濃度。

1.5.4 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)變化 取卵巢組織蠟塊，制作5μm切片，展片；干凈玻片撈片，烘干；二甲苯脫蠟，梯度酒精水洗，常規(guī)蘇木素染色10 min；水洗，1%鹽酸酒精分色20 s，1%氨水溶液返藍(lán)；自來水沖洗15 min，1%伊紅水溶液復(fù)染5 min；水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)學(xué)變化。

1.5.5 ELISA法檢測(cè)卵巢組織中cAMP含量 取液氮冷凍的卵巢組織，勻漿，以3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，取上清。用96孔板，每孔加入50μL抗體，加入10μL標(biāo)準(zhǔn)品，室溫孵育2 h，洗板，顯色，終止，讀板，450 nm波長(zhǎng)上機(jī)檢測(cè)，570 nm波長(zhǎng)校正。二喹啉甲酸（BCA）法檢測(cè)組織總蛋白濃度，計(jì)算各組大鼠卵巢組織中cAMP含量，公式：cAMP含量=ELISA檢測(cè)濃度值/各樣本BCA結(jié)果。

1.5.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)卵巢組織FSH-cAMP信號(hào)軸相關(guān)蛋白FSHR、PKA、

p-PKA表達(dá) 取液氮冷凍的卵巢組織在冰盒中研磨，勻漿后置入低溫離心機(jī)，以4℃、20 000 r/min（離心半徑10 cm）離心20 min，取上清。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度，按上樣量40μg計(jì)算樣本稀釋濃度，沸水浴10 min變性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后濕法轉(zhuǎn)膜。將硝酸纖維素膜置入50 g/L脫脂奶粉中封閉2 h；再取出置入一抗稀釋液[兔抗大鼠FSHR、PKA、p-PKA、β-actin（內(nèi)參）單克隆抗體，稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000、1∶2 500]中孵育過夜；TBST洗膜后，再置入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000稀釋）中，室溫下孵育1 h；TBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色。經(jīng)成像系統(tǒng)采集硝酸纖維素膜上的蛋白信號(hào)，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算目的條帶灰度值。結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)與Levene檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布且方差齊者，用單因素方差分析、LSD-t比較，方差不齊者用Welch檢驗(yàn)、Dunnett’s T3比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀況比較實(shí)驗(yàn)過程中正常組大鼠飲食、活動(dòng)、二便等情況均正常，皮毛整潔、有光澤，體質(zhì)量漸增，動(dòng)情周期規(guī)律；模型組大鼠進(jìn)食、二便次數(shù)減少，大便稀，毛色枯燥，有脫毛，體質(zhì)量漸降，動(dòng)情周期延長(zhǎng)、紊亂，鏡下見上皮細(xì)胞增多，多于動(dòng)情間期；抑制劑組大鼠異常表現(xiàn)較模型組嚴(yán)重，抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組則相對(duì)輕微。

2.2 各組大鼠卵巢濕質(zhì)量與卵巢指數(shù)比較表1

表1 各組大鼠卵巢濕質(zhì)量與卵巢指數(shù)比較Table 1 Comparison of ovarian wet mass and ovarian index of rats in various groups （±s）

表1 各組大鼠卵巢濕質(zhì)量與卵巢指數(shù)比較Table 1 Comparison of ovarian wet mass and ovarian index of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與抑制劑組比較；③P＜0.05，與模型組比較；④P＜0.05，與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較

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結(jié)果顯示：各組大鼠卵巢濕質(zhì)量、卵巢指數(shù)組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，抑制劑組、模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的左側(cè)和右側(cè)卵巢濕質(zhì)量及卵巢指數(shù)均降低（P＜0.05）。與抑制劑組比較，模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的左側(cè)和右側(cè)卵巢濕質(zhì)量及卵巢指數(shù)均升高（P＜0.05）；與模型組比較，抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的左側(cè)和右側(cè)卵巢濕質(zhì)量及卵巢指數(shù)均升高（P＜0.05）；與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較，菟絲子總黃酮組的左側(cè)和右側(cè)卵巢濕質(zhì)量及卵巢指數(shù)均升高（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠性激素水平比較表2結(jié)果顯示：各組大鼠FSH、FSH/LH、E2水平組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LH水平組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，抑制劑組、模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的FSH、FSH/LH、E2水平升高（P＜0.05）。與抑制劑組比較，模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的FSH、FSH/LH、E2水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的FSH、FSH/LH、E2水平降低（P＜0.05）；與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較，菟絲子總黃酮組的FSH、FSH/LH、E2水平降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠性激素水平比較Table 2 Comparison of sex hormone levels of rats in various groups （±s）

表2 各組大鼠性激素水平比較Table 2 Comparison of sex hormone levels of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與抑制劑組比較；③P＜0.05，與模型組比較；④P＜0.05，與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較

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2.4 各組大鼠卵巢組織形態(tài)變化比較圖1結(jié)果顯示：正常組卵巢體積較大，卵泡生長(zhǎng)活躍，黃體發(fā)育良好；模型組卵巢萎縮明顯，卵泡數(shù)量減少，黃體減少；與模型組比較，抑制劑組卵巢萎縮更明顯，卵泡與黃體數(shù)量更少，而抑制劑組+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組卵巢、卵泡與黃體數(shù)量明顯改善。

圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)變化比較（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of histomorphological changes of ovarian tissue of rats in various groups（by HE staining，×100）

2.5 各組大鼠卵巢組織中cAMP含量比較表3結(jié)果顯示：各組大鼠卵巢組織中cAMP含量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，抑制劑組、模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組卵巢組織中cAMP含量降低（P＜0.05）。與抑制劑組比較，模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的cAMP含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組cAMP含量升高（P＜0.05）；與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較，菟絲子總黃酮組cAMP含量升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠卵巢組織中cAMP含量比較Table 3 Comparison of content of c AMP in ovarian tissue of rats in various groups（±s，pmol·mg-1）

表3 各組大鼠卵巢組織中cAMP含量比較Table 3 Comparison of content of c AMP in ovarian tissue of rats in various groups（±s，pmol·mg-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與抑制劑組比較；③P＜0.05，與模型組比較；④P＜0.05，與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較

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2.6 各組大鼠卵巢組織中FSH-cAMP信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較表4、圖2結(jié)果顯示：各組大鼠FSHR、p-PKA蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），PKA蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，抑制劑組、模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的FSHR、p-PKA蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）。與抑制劑組比較，模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的FSHR、p-PKA蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組的FSHR、p-PKA蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較，菟絲子總黃酮組的FSHR、p-PKA蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。

圖2 大鼠卵巢組織中FSHR、PKA、p-PKA蛋白Western Blot電泳條帶圖Figure 2 Western Blot bands of FSHR，PKA and p-PKA proteins in ovarian tissue of rats

表4 各組大鼠卵巢組織中FSHR、PKA、p-PKA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 4 Comparison of protein relative expression of FSHR，PKA and p-PKA in ovarian tissue of rats in various groups （±s）

表4 各組大鼠卵巢組織中FSHR、PKA、p-PKA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 4 Comparison of protein relative expression of FSHR，PKA and p-PKA in ovarian tissue of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與抑制劑組比較；③P＜0.05，與模型組比較；④P＜0.05，與抑制劑+菟絲子總黃酮組比較

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3 討論

卵巢作為女性生殖器官，負(fù)責(zé)卵子的產(chǎn)生與排出，分泌的激素對(duì)女性的經(jīng)、帶、胎、產(chǎn)過程具有調(diào)節(jié)作用。隨著女性年齡的增長(zhǎng)，卵巢功能日漸衰退，致卵巢儲(chǔ)備功能減退，影響受孕能力，甚或伴發(fā)閉經(jīng)并至全身其他系統(tǒng)疾病。卵巢儲(chǔ)備功能減退涉及遺傳、醫(yī)源性、環(huán)境等影響因素，發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚[13]。本研究通過腹腔注射VCD構(gòu)建卵巢儲(chǔ)備功能減退實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，高度模擬了女性卵巢儲(chǔ)備功能減退狀態(tài)?？梢娫炷：蟮拇笫笮螒B(tài)、活動(dòng)、毛色、動(dòng)情周期等出現(xiàn)異常變化，卵巢濕質(zhì)量減輕，卵巢指數(shù)下降，而經(jīng)菟絲子總黃酮治療后則明顯改善，提示菟絲子總黃酮可恢復(fù)卵巢儲(chǔ)備功能減退大鼠動(dòng)情周期，增加卵巢質(zhì)量，糾正降低的卵巢指數(shù)，改善卵巢儲(chǔ)備功能。本研究經(jīng)HE染色觀察大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)與卵泡情況后發(fā)現(xiàn)，模型組卵巢明顯萎縮，卵泡數(shù)量減少，閉鎖卵泡增多，而菟絲子總黃酮組卵巢體積增大，皮質(zhì)內(nèi)可見大量生長(zhǎng)卵泡，較多接近成熟卵泡，提示菟絲子總黃酮可促進(jìn)卵巢儲(chǔ)備功能減退大鼠卵巢各級(jí)卵泡發(fā)育。

血清性激素是反映卵巢儲(chǔ)備功能的指標(biāo)。FSH是腺垂體促性腺激素細(xì)胞合成、分泌的糖蛋白類促性腺激素，其分泌可影響卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)育、排卵[14]。LH通過與卵巢膜細(xì)胞LH受體結(jié)合，刺激卵泡膜細(xì)胞分泌雄激素，從而為雌激素的產(chǎn)生提供原料。卵巢儲(chǔ)備功能減退初期，F(xiàn)SH、LH均上升，前者早于后者，且更顯著，F(xiàn)SH/LH比值升高則可預(yù)判卵巢儲(chǔ)備功能減退。E2由卵巢膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞分泌，在FSH和LH作用下合成，是評(píng)價(jià)卵巢儲(chǔ)備功能的常用指標(biāo)[15]。膜細(xì)胞合成的雄激素進(jìn)入顆粒細(xì)胞，在芳香化酶P450作用下轉(zhuǎn)化為雌激素。長(zhǎng)期高E2、FSH/LH水平不利于優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育，因而恢復(fù)FSH、E2、LH水平對(duì)卵巢早衰的治療十分重要。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，菟絲子總黃酮組的FSH、E2、FSH/LH比值下降，提示菟絲子總黃酮具備調(diào)節(jié)血清性激素功能的作用，體現(xiàn)了其類雌激素樣作用。

卵泡是卵巢局部與循環(huán)雌激素的主要來源，雌激素水平受FSH調(diào)控，F(xiàn)SH調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞膜中芳香化酶基因表達(dá)，并觸發(fā)cAMP依賴的信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)芳香化酶基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)雌激素生物合成。FSH-cAMP/PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是經(jīng)典的調(diào)節(jié)卵巢功能的通路之一，F(xiàn)SH與顆粒細(xì)胞上分布的FSHR特異性結(jié)合，通過細(xì)胞膜上G蛋白受體激活cAMP，增加細(xì)胞中cAMP濃度，打破cAMP平衡[16]。據(jù)報(bào)道[17]，cAMP在卵巢發(fā)育過程中可調(diào)控卵母細(xì)胞成熟與卵泡發(fā)育。高濃度的cAMP激活細(xì)胞內(nèi)PKA，活化（磷酸化）的PKA轉(zhuǎn)錄激活目的基因，促使特異性蛋白合成并分泌至卵巢內(nèi)，促進(jìn)卵泡的發(fā)育。本研究結(jié)果顯示：從抑制劑組到模型組、抑制劑+菟絲子總黃酮組、菟絲子總黃酮組，卵巢組織中FSHR、p-PKA蛋白表達(dá)水平及cAMP含量逐漸升高，提示菟絲子總黃酮可能通過調(diào)節(jié)FSH，激活cAMP/PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增加卵巢局部cAMP含量，促進(jìn)卵泡發(fā)育，從而改善卵巢的儲(chǔ)備功能。

綜上所述，菟絲子總黃酮可能通過激活FSHcAMP/PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能減退大鼠卵巢儲(chǔ)備功能的保護(hù)作用。