液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀器管理與維護(hù)

王倩(南京中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心, 江蘇 南京 210046)

0 引言

液相色譜(LC)是根據(jù)目標(biāo)化合物在色譜柱中保留時(shí)間的差異，并將化合物從混合物中分離出來(lái)，進(jìn)行收集及檢測(cè)的儀器[1-2]。質(zhì)譜(MS)是把分子轉(zhuǎn)化成氣態(tài)離子，并根據(jù)質(zhì)荷比(M/Z : M質(zhì)量數(shù)，Z電荷數(shù))的差異把離子進(jìn)行分離檢測(cè)的儀器[3]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)在過(guò)去的10～15年里在臨床實(shí)驗(yàn)室取得了巨大的增長(zhǎng)。對(duì)低分子量分析物，它具有優(yōu)于免疫分析法或傳統(tǒng)的高效/壓力液相色譜(HPLC)的分析特異性，并且比氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)具有更高的通量[4]。為更好地延長(zhǎng)儀器壽命、降低耗材成本并維持儀器的良好狀態(tài)，獲得更可靠的分析數(shù)據(jù)，儀器的日常維護(hù)及保養(yǎng)至關(guān)重要。以下以島津公司CTO-30A高效液相色譜與AB SCIEX公司QTRAP 4500質(zhì)譜聯(lián)用為例，從儀器結(jié)構(gòu)特點(diǎn)出發(fā)，結(jié)合日常工作，總結(jié)使用過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題及經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行闡述。

1 培訓(xùn)與管理

1.1 儀器預(yù)約與管理

平臺(tái)目前采用線上預(yù)約的方式進(jìn)行儀器的培訓(xùn)以及預(yù)約使用申請(qǐng)。HPLC-QTRAP 4500 液質(zhì)聯(lián)用儀是實(shí)驗(yàn)室大型分析儀器，應(yīng)有專業(yè)技術(shù)人員專門(mén)管理。通常采用送樣測(cè)試的方式進(jìn)行日常的分析測(cè)試工作。通常情況下，在預(yù)約測(cè)試樣品前，送樣人員應(yīng)與儀器管理者進(jìn)行有效溝通，常見(jiàn)于探討儀器本身是否可以滿足實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹４_定可行性后就分析測(cè)定的化合物性質(zhì)、樣品的前處理方法、色譜柱的選擇、流動(dòng)相的配制以及耗材的準(zhǔn)備等方面再進(jìn)行進(jìn)一步的方法制定。在預(yù)約規(guī)定的時(shí)間，送檢人員將所需測(cè)定的樣品提供給儀器管理者進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，樣品測(cè)定完成后，儀器管理員進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，并將檢測(cè)結(jié)果用格式化的光盤(pán)進(jìn)行存儲(chǔ)并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)交給送樣人員。液質(zhì)聯(lián)用儀是大型分析精密儀器，在日常的使用中若因樣品處理不當(dāng)或者操作不當(dāng)，輕則造成儀器污染導(dǎo)致儀器壽命縮短，重則損壞儀器從而花費(fèi)高額的維修費(fèi)用。因此，需要儀器管理人員專門(mén)進(jìn)行操作。然而，因液質(zhì)聯(lián)用儀應(yīng)用廣泛，日常需測(cè)定的樣本量巨大，服務(wù)的人員眾多，儀器管理人員難以做到事無(wú)巨細(xì)。因此，平臺(tái)每年都會(huì)舉辦液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器理論及操作培訓(xùn)，主要以開(kāi)展講座以及儀器上機(jī)培訓(xùn)為主。包括但不限于介紹儀器的基本原理、儀器在使用過(guò)程中遇到的問(wèn)題及解決方案、數(shù)據(jù)的處理以及結(jié)果的分析等方面。對(duì)培訓(xùn)合格以及多次考核均滿足要求者，方可允許其獨(dú)立進(jìn)行儀器的操作。獨(dú)立使用儀器者必須嚴(yán)格遵守質(zhì)譜儀器實(shí)驗(yàn)室制定的相關(guān)規(guī)章制度，嚴(yán)格按照培訓(xùn)的操作規(guī)程使用儀器。樣本如需要過(guò)夜進(jìn)樣時(shí)需與儀器管理人員報(bào)備。操作者若違反質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室規(guī)定而造成儀器故障并影響性能者，將被取消儀器使用資格。在使用過(guò)程中儀器出現(xiàn)任何問(wèn)題或者故障，儀器使用者應(yīng)及時(shí)通知儀器管理員，采取相應(yīng)措施進(jìn)行補(bǔ)救以免對(duì)儀器造成更嚴(yán)重的損害。

1.2 樣品前處理

明確樣品類(lèi)型是送樣人員首先要提供給儀器管理者的信息，針對(duì)不同的樣品類(lèi)型，如生物樣本、藥用植物、食品及化妝品等前處理方法是有區(qū)別的。除此之外，樣品溶液要排除含有生物大分子、無(wú)機(jī)酸、難揮發(fā)的鹽、表面活性劑等。此外，樣品只限于甲醇、乙腈、水中的一種或者其組合進(jìn)行樣品溶解，離心后并采用0.22 μm的濾膜過(guò)濾(注意：水系膜與有機(jī)系膜選用區(qū)別)，特殊情況下如樣品量較少無(wú)法完成濾膜過(guò)濾，應(yīng)采用高速離心機(jī)4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min后取上清液進(jìn)行進(jìn)樣分析。確保樣品溶液透明且無(wú)沉淀等現(xiàn)象。鑒于質(zhì)譜的靈敏度高，防止因溶劑的雜質(zhì)較多影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。選用溶劑溶解樣品時(shí)要注意其純度，如甲醇/乙腈選用包裝明確標(biāo)注為質(zhì)譜級(jí)或色譜級(jí)溶劑，水要選用一級(jí)水。為了防止因樣品濃度過(guò)高造成色譜柱殘留或者離子源污染等情況的發(fā)生，樣品的濃度應(yīng)控制在小于1 μg/mL最佳。

2 日常使用與保養(yǎng)

2.1 環(huán)境要求

液質(zhì)聯(lián)用儀器的正常運(yùn)行對(duì)環(huán)境要求較為苛刻，儀器周?chē)碾姶鸥袘?yīng)裝置會(huì)影響液質(zhì)聯(lián)用儀器正常運(yùn)行。因此需要維持環(huán)境溫度在20～24 ℃，濕度保持在35%～50%。一般日常室溫與最后一次校正時(shí)相差4 ℃以內(nèi)。并且需要保證溫度的變化率小于2 ℃/h。若環(huán)境溫度變化率過(guò)大，會(huì)造成質(zhì)譜儀質(zhì)量軸偏移，分析測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。另外，質(zhì)譜儀房間一定要妥善保持通風(fēng)，實(shí)驗(yàn)室良好的通風(fēng)環(huán)境用以控制有機(jī)試劑等有毒有害物質(zhì)排放，保證儀器正常運(yùn)行。除此之外，實(shí)驗(yàn)室日常要進(jìn)行除塵工作，防止房間灰塵過(guò)多造成質(zhì)譜儀電路板短路等情況的發(fā)生。

2.2 液相色譜系統(tǒng)

2.2.1 流動(dòng)相

液相色譜系統(tǒng)作為質(zhì)譜的進(jìn)樣系統(tǒng)有著不可忽視的作用。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)，流動(dòng)相的選擇至關(guān)重要。盡量選用質(zhì)譜(MS)級(jí)別的甲醇/乙腈作為有機(jī)相，若流動(dòng)相為色譜(HPLC)級(jí)，應(yīng)采用0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾后使用。嚴(yán)禁采用分析級(jí)及更低純度的甲醇/乙腈作為流動(dòng)相，流動(dòng)相中嚴(yán)禁含有難揮發(fā)的鹽類(lèi)，如磷酸鹽、硼酸鹽等；流動(dòng)相中嚴(yán)禁使用含有抑制化合物電離的表面活性劑；嚴(yán)禁使用鹽酸、硫酸等無(wú)機(jī)酸。配備完成的流動(dòng)相應(yīng)先進(jìn)行脫氣，一般超聲5 min左右就可以完成脫氣的目的。一般水相做到現(xiàn)配現(xiàn)用，有機(jī)相可保存1個(gè)月左右。若流動(dòng)相含有鹽類(lèi)，在每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)先采用高比例的純水進(jìn)行沖洗，然后逐漸升高有機(jī)相比例，此操作的目的是將殘存的鹽類(lèi)排出，避免腐蝕管路系統(tǒng)。

2.2.2 色譜柱

液質(zhì)聯(lián)用儀與單獨(dú)的液相色譜儀相比，顯著的區(qū)別在于配備的色譜柱較短以及流速的相對(duì)較低。以便樣品在進(jìn)入離子源時(shí)能夠完成很好的電離。因此，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前應(yīng)根據(jù)所測(cè)化合物的性質(zhì)選擇合適的色譜柱，包括色譜柱長(zhǎng)度、粒徑大小、填料種類(lèi)、pH值范圍、所耐受的壓力以及其與后方質(zhì)譜的兼容性等問(wèn)題。

對(duì)新購(gòu)買(mǎi)的色譜柱，首次使用前應(yīng)進(jìn)行活化，以常用的普通反相C18色譜柱為例，一般采用0.5 mL/min的甲醇進(jìn)行沖洗大約120 min，然后更換流動(dòng)相進(jìn)行平衡操作。建議實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后都應(yīng)進(jìn)行色譜柱的沖洗，一般先用高比例純水，約90%的純水/甲醇體系進(jìn)行色譜柱的沖洗，然后逐漸提高有機(jī)相比例，最后色譜柱保存在純甲醇中。注意沖洗色譜柱時(shí)應(yīng)斷開(kāi)與質(zhì)譜的管路連接，防止將污染物沖進(jìn)離子源導(dǎo)致離子源污染。在色譜柱沖洗完成后，用二通替換色譜柱，然后用50%甲醇/水以1 mL/min流速?zèng)_洗質(zhì)譜儀約30 min左右。若長(zhǎng)時(shí)間不使用此色譜柱，為防止甲醇揮發(fā)，造成色譜柱的柱效下降，應(yīng)將其保存在高比例有機(jī)相，如90%甲醇/水體系中為宜。

2.3 三重四極桿質(zhì)譜

2.3.1 離子源

質(zhì)譜在工作過(guò)程中為了減少高速電子和離子與其他分子之間碰撞導(dǎo)致的能量消耗，離子必須處于高真空狀態(tài)。因此維持離子源及質(zhì)量分析器的高真空度是保證質(zhì)譜儀能夠正常運(yùn)行的必要條件。機(jī)械泵的狀態(tài)直接關(guān)系到離子源的真空度能否達(dá)到既定要求。因此，應(yīng)注意觀察機(jī)械泵的泵油顏色是否變深，泵油的體積是否控制在距離刻度線約三分之二處。每隔三年或者泵油顏色變深變暗時(shí)更換泵油為宜。應(yīng)每日進(jìn)行離子源流路清洗。每周進(jìn)行離子源內(nèi)腔清洗以及機(jī)械泵油量檢查。每月進(jìn)行一次機(jī)械泵濾網(wǎng)清潔，每年進(jìn)行一次儀器除塵工作。除此之外，當(dāng)噴霧針堵塞時(shí)應(yīng)及時(shí)更換，當(dāng)儀器靈敏度或者分辨率下降時(shí)應(yīng)進(jìn)行離子參數(shù)的優(yōu)化。

2.3.2 質(zhì)量分析器

四極桿質(zhì)量分析器是由四根平行的金屬桿組成，四極上加的直流電壓和射頻電壓比值通常是一個(gè)常數(shù)，代表儀器的分辨率[5]。四極桿質(zhì)量分析器的靈敏度和分辨率也存在反比例關(guān)系，即提高分辨率的同時(shí)會(huì)降低其靈敏度[6]。當(dāng)儀器在正常工作時(shí)只要改變直流電壓和射頻電壓值而不改變其比值，就能實(shí)現(xiàn)不同質(zhì)核比的離子檢測(cè)。當(dāng)儀器長(zhǎng)時(shí)間工作或者進(jìn)行多種分析化合物測(cè)定后，通常會(huì)導(dǎo)致質(zhì)量數(shù)或多或少的偏差，造成質(zhì)譜儀靈敏度下降，因此，應(yīng)定期進(jìn)行儀器的校正，防止質(zhì)譜質(zhì)量軸偏差，造成測(cè)試結(jié)果的不準(zhǔn)確。

3 常見(jiàn)故障排查

3.1 色譜圖異常

一般情況如泵引起的脈沖或者梯度洗脫可能造成色譜圖背景高，此時(shí)需要優(yōu)化梯度洗脫條件。除此之外流動(dòng)相污染時(shí)可觀察到背景隨著流動(dòng)相梯度變化而變化，有時(shí)還會(huì)“出峰”，此時(shí)需要更換流動(dòng)相，改用級(jí)別更高的溶劑。當(dāng)離子源污染時(shí)，可觀察到背景信號(hào)穩(wěn)定，基本上不隨流動(dòng)相梯度變化處理，此時(shí)需要清洗離子源，包括內(nèi)腔、噴霧針尖端。當(dāng)前幾個(gè)情況都處理過(guò)后，可嘗試更換管路或/和噴霧針等。當(dāng)交叉污染發(fā)生時(shí)，可觀察到色譜圖空白也出峰，一般為進(jìn)樣器污染。需要更換合適的樣品清洗液，此清洗液應(yīng)能溶解樣品并將其從進(jìn)樣針上洗掉。然后進(jìn)行進(jìn)樣針及進(jìn)樣針座的清洗。

3.2 系統(tǒng)壓力異常

當(dāng)系統(tǒng)壓力波動(dòng)，呈“鋸齒”狀?？赡苁侨軇┪疵摎?，系統(tǒng)引入了氣泡。需將流動(dòng)相進(jìn)行脫氣，并排清儀器體系中的氣泡。除此之外，泵密封圈的老化也會(huì)造成系統(tǒng)壓力的波動(dòng)。當(dāng)系統(tǒng)壓力偏低，此時(shí)需逐一排查如溶劑進(jìn)口過(guò)濾芯是否被堵、色譜柱兩端是否擰緊、色譜柱固定相是否流失、與質(zhì)譜連接處管路是否漏液。當(dāng)系統(tǒng)壓力偏高，此時(shí)需檢查系統(tǒng)中是否存在不溶性顆粒。將色譜柱拆下?lián)Q上二通后觀察壓力是否正常。若壓力值在正常范圍內(nèi)，則考慮為色譜柱堵塞。將色譜柱進(jìn)行沖洗，完成后重新安裝測(cè)試，若壓力值較之前差別過(guò)大，則需更換色譜柱。將色譜柱拆下?lián)Q上二通后觀察壓力若仍然偏高，則考慮進(jìn)樣針堵塞可能性較大?？蓪⑦M(jìn)樣針切換至旁路，此時(shí)壓力若明顯下降，需要拆下進(jìn)樣針，用50%異丙醇浸泡超聲清洗。

3.3 儀器污染處理

3.3.1 流動(dòng)相污染

一般流動(dòng)相的污染，特別是水相較容易污染，長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)出現(xiàn)發(fā)霉長(zhǎng)菌的情況，因此水相要選用一級(jí)水且現(xiàn)配現(xiàn)用。當(dāng)流動(dòng)相污染時(shí)，首先觀察到的是信號(hào)采集時(shí)的背景較高，也就是基線較高。需要更換干凈的流動(dòng)相，或者是更換更高級(jí)別的流動(dòng)相，一般有機(jī)相推薦質(zhì)譜級(jí)、色譜級(jí)的有機(jī)相需用0.22 μm的濾膜過(guò)濾后使用。

3.3.2 色譜柱污染

當(dāng)儀器檢測(cè)空白樣品時(shí)基線過(guò)高，并且有響應(yīng)較高的色譜峰出現(xiàn)時(shí)，排除了流動(dòng)相污染的情況下，色譜柱的污染可能性很高。當(dāng)在檢測(cè)過(guò)程中樣本量過(guò)大或者樣本濃度過(guò)高都會(huì)導(dǎo)致化合物在色譜柱中殘留。如果流動(dòng)相用到鹽類(lèi)，則需要先用10%的甲醇/水低流速進(jìn)行沖洗，然后再換高比例甲醇過(guò)夜進(jìn)行沖洗。否則可直接選擇用高比例甲醇低流速過(guò)夜沖洗。

3.3.3 離子源污染

當(dāng)檢測(cè)的化合物濃度過(guò)高或者樣本量過(guò)大都會(huì)導(dǎo)致離子源污染。質(zhì)譜的工作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非帶電殘留物污染離子源，這些污染物很難通過(guò)離子源的高速電磁場(chǎng)，也不能進(jìn)入真空系統(tǒng)。離子源被污染形成的靜電涂層會(huì)引起電壓響應(yīng)行為的改變，因此儀器的靈敏度會(huì)降低。為預(yù)防質(zhì)譜噪聲高、信號(hào)不穩(wěn)定，應(yīng)每周進(jìn)行一次離子源內(nèi)腔，噴霧頭與噴霧針尖端的清洗。一般先在軟件中將質(zhì)譜儀設(shè)置成待機(jī)模式，然后取下離子源，水平取出氣簾板(curtain plate)，用無(wú)塵紙蘸取50%甲醇/水擦拭內(nèi)外表面，氮?dú)獯蹈?。然后用甲醇濕?rùn)的無(wú)塵紙沿一個(gè)方向擦拭錐孔板(orifice plate)外表面(需關(guān)機(jī))。一張紙擦拭一次，擦拭三次，擦拭完后注意檢查錐孔中是否有纖維殘留。根據(jù)質(zhì)譜的運(yùn)行時(shí)間和樣品量種類(lèi)，1～2周用50%甲醇/水擦拭離子源部腔體可降低數(shù)據(jù)圖譜背景信號(hào)。在沒(méi)有氣簾氣(curtian gas)輸入時(shí)，為了防止儀器吸入室內(nèi)空氣污染內(nèi)部離子傳輸元件，質(zhì)譜主機(jī)最好關(guān)機(jī)，質(zhì)譜關(guān)機(jī)時(shí)，保持氮?dú)夤?yīng)，可以防止離子軌道受潮。

4 結(jié)語(yǔ)

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是用于檢測(cè)分析的重要手段。液質(zhì)聯(lián)用儀器是屬于貴重精密儀器設(shè)備。目前已面向南京中醫(yī)藥大學(xué)全體師生開(kāi)放，在日常的管理過(guò)程中，為避免出現(xiàn)儀器的損毀，保證儀器高效公平的為全校師生的教學(xué)科研提供服務(wù)，需要嚴(yán)格管控儀器的預(yù)約、樣品前處理、色譜柱維護(hù)、離子源及質(zhì)量分析器的保養(yǎng)等工作。建立良好的管理方法，及時(shí)進(jìn)行儀器的保養(yǎng)與維護(hù)能夠提高液質(zhì)聯(lián)用儀器使用效率，節(jié)約分析時(shí)間，降低耗材成本，能夠得到可靠的分析數(shù)據(jù)。