模式動物果蠅的基因調(diào)控前沿技術(shù)

韓玉婷，許博文，李羽童，盧心怡，董習(xí)之，邱雨浩，車沁耘，朱芮葆，鄭麗，李孝宸，司緒，倪建泉

模式動物果蠅的基因調(diào)控前沿技術(shù)

韓玉婷，許博文，李羽童，盧心怡，董習(xí)之，邱雨浩，車沁耘，朱芮葆，鄭麗，李孝宸，司緒，倪建泉

清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，基因表達(dá)與調(diào)控實(shí)驗(yàn)室，北京 100084

轉(zhuǎn)基因調(diào)控技術(shù)在生命醫(yī)學(xué)研究中扮演了重要的角色，是探究個(gè)體發(fā)育和致病機(jī)制的必備工具。常用的轉(zhuǎn)基因調(diào)控技術(shù)包括基因突變、基因干擾和基因轉(zhuǎn)錄激活等。果蠅由于具有基因的保守性、遺傳工具的多樣性以及不受倫理限制等優(yōu)勢，成為生命科學(xué)研究中經(jīng)典模式動物之一，并由此開發(fā)出了多種時(shí)間和組織特異性的基因調(diào)控工具。本文主要介紹了目前在果蠅中常用的基因調(diào)控技術(shù)，包括CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因突變系統(tǒng)、基于miRNA的新一代轉(zhuǎn)基因干擾系統(tǒng)以及基于CRISPR/dCas9的轉(zhuǎn)錄激活(flySAM)系統(tǒng)，希望通過對這幾種系統(tǒng)設(shè)計(jì)原理、操作過程、相關(guān)的技術(shù)工具及相關(guān)資源品系的介紹，提升人們對這些前沿的果蠅遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)及構(gòu)建的相關(guān)果蠅資源品系重要性認(rèn)識，進(jìn)而推動生命醫(yī)學(xué)研究發(fā)展。

果蠅；基因調(diào)控；CRISPR/Cas9；基因編輯；轉(zhuǎn)基因RNAi；CRISPRa

轉(zhuǎn)基因調(diào)控技術(shù)是基于分子生物學(xué)原理設(shè)計(jì)相關(guān)基因調(diào)控元件，并結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)降低、去除或增強(qiáng)靶基因活性或表達(dá)水平的一項(xiàng)前沿生物技術(shù)。轉(zhuǎn)基因調(diào)控技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心，對生命醫(yī)學(xué)的發(fā)展和提升人民健康水平具有重大意義。例如，通過轉(zhuǎn)基因調(diào)控技術(shù)建立的動物疾病模型有助于推動神經(jīng)退行性疾病病理生理學(xué)的研究和大規(guī)模小分子化合物以及中草藥物的篩選[1,2]；轉(zhuǎn)基因技術(shù)可修復(fù)患者原有突變基因或?qū)⒄；蛞耄瑢?shí)現(xiàn)對疾病進(jìn)行治療，為包括地中海貧血癥、脊索性肌萎縮在內(nèi)的多種遺傳疾病提供了新的治療手段[3]。因此，掌握并研發(fā)轉(zhuǎn)基因調(diào)控技術(shù)，正成為應(yīng)對西方國家技術(shù)壁壘、避免“卡脖子”的戰(zhàn)略措施。

與其他模式動物相比，果蠅有著易于飼養(yǎng)、繁殖力強(qiáng)、生長周期短、遺傳背景明確等優(yōu)勢。正是因?yàn)檫@些得天獨(dú)厚的優(yōu)勢，果蠅吸引了越來越多的研究者，許多生命現(xiàn)象和規(guī)律在果蠅中也被揭示，如胚胎發(fā)育、先天性免疫和晝夜節(jié)律等成果均先后獲得了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎，有效推動了生命醫(yī)學(xué)發(fā)展[4～6]。按照世界果蠅大會和美國Bloomington的注冊信息，目前全世界有近3000個(gè)果蠅實(shí)驗(yàn)室，其中絕大多數(shù)在美國。根據(jù)復(fù)旦大學(xué)舉辦的2017年第四屆中國果蠅大會統(tǒng)計(jì)，目前國內(nèi)也已有200多個(gè)獨(dú)立果蠅實(shí)驗(yàn)室。

為促進(jìn)生命科學(xué)的快速發(fā)展，西方發(fā)達(dá)國家最先建立了相關(guān)的果蠅資源庫：美國建有Bloomington 果蠅存儲中心，主要儲存果蠅轉(zhuǎn)基因干擾品系(哈佛大學(xué)和清華大學(xué)構(gòu)建)、果蠅突變體、定點(diǎn)激活品系(哈佛大學(xué)和清華大學(xué)構(gòu)建)和Gal4品系；歐洲維也納VDRC果蠅存儲中心，主要構(gòu)建和儲存轉(zhuǎn)基因干擾品系；日本NIG存儲中心，構(gòu)建并儲存轉(zhuǎn)基因干擾和突變體品系。目前，國內(nèi)主要有三家單位構(gòu)建和存儲果蠅品系：上海果蠅平臺，主要儲存轉(zhuǎn)基因干擾、突變體和Gal4品系；廣州醫(yī)科大學(xué)，主要構(gòu)建和存儲突變體品系；清華大學(xué)果蠅中心(Tsinghua Fly Center)，主要研發(fā)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建及儲存轉(zhuǎn)基因干擾、轉(zhuǎn)基因激活以及突變體品系。目前，國內(nèi)外果蠅資源庫的建立主要依靠3個(gè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)：(1)基于CRISPR/Cas9的基因突變系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)基因特異性敲除(knock-out)或敲入(knock-in)；(2)基于RNA干擾(RNA interference，RNAi)原理研發(fā)的條件性轉(zhuǎn)基因干擾技術(shù)，在特定組織、器官或細(xì)胞中高效敲低(knock-down)目的基因的表達(dá)；(3)基于CRISPR/ dCas9的flySAM轉(zhuǎn)錄激活(CRISPR transcriptional activation，CRISPRa)系統(tǒng)，提高目的基因的轉(zhuǎn)錄水平[7～13]。

本文主要介紹位于領(lǐng)域前沿的CRISPR/Cas9基因突變系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因RNAi和轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)的原理、流程以及未來發(fā)展方向，希望讓更多的果蠅同行了解并掌握這些前沿的果蠅遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)，了解構(gòu)建相關(guān)果蠅資源品系的重要性，進(jìn)而推動生命醫(yī)學(xué)研究發(fā)展。

1 CRISPR/Cas9基因突變系統(tǒng)

基因是傳遞遺傳信息的基本單位，在個(gè)體發(fā)育、疾病和衰老中起決定性作用。對基因進(jìn)行突變是研究其功能的基本方法之一?；蛲蛔兎譃樽匀煌蛔兒驼T導(dǎo)突變。自然突變指自然條件下發(fā)生的突變，雖在生物界廣泛存在，但突變的頻率較低，為提高基因突變率，加快基因功能的研究，發(fā)展出化學(xué)誘變(甲基磺酸乙酯或N-乙基-N-亞硝基脲等致癌劑)、物理誘變(γ/x-射線等高能射線)或轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座等方式，廣泛用于正向遺傳篩選。然而以上這些誘變具有隨機(jī)性，無法定點(diǎn)突變，增加了后續(xù)確定突變位點(diǎn)的難度[14,15]。早期鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)系統(tǒng)等靶向性突變的工具可在特定位置引入雙鏈DNA的斷裂，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)部的DNA修復(fù)機(jī)制。但這兩種系統(tǒng)的靶向性依賴于特異性結(jié)合DNA序列的蛋白模塊，因此其構(gòu)建成本高，操作步驟繁瑣[15,16]。與上面兩種系統(tǒng)相比，2013年出現(xiàn)的CRISPR/Cas9技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢[17]。CRISPR/Cas9

來自于細(xì)菌與古細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)，用于抵御病毒的侵染。當(dāng)噬菌體入侵時(shí)，crRNA、tracrRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合體，識別噬菌體DNA序列的前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM，序列為NGG三堿基區(qū)段)，其中crRNA以堿基互補(bǔ)的方式與PAM相鄰的DNA序列結(jié)合，使雙鏈結(jié)構(gòu)打開，tracrRNA激活Cas9切割活性，在PAM位點(diǎn)上游第三個(gè)核苷酸附近進(jìn)行切割使DNA 雙鏈斷裂，從而抵抗病毒入侵?；诖讼到y(tǒng)研發(fā)出的CRISPR/Cas9基因突變系統(tǒng)只包含兩個(gè)重要成分，一個(gè)是具有DNA雙鏈切割活性的Cas9蛋白，另一個(gè)是具有導(dǎo)向功能的sgRNA (small guide RNA)。Cas9蛋白可以與sgRNA結(jié)合，在sgRNA的引領(lǐng)下通過堿基互補(bǔ)配對靶向目的DNA，借助Cas9內(nèi)切酶活性使靶位點(diǎn)發(fā)生DNA雙鏈斷裂，隨后借助細(xì)胞的DNA修復(fù)引起基因突變(圖1)，如細(xì)胞利用非同源性末端鏈接(non-homologous end joining，NHEJ)途徑可使基因發(fā)生移碼突變或片段缺失和插入，而利用同源重組(homologous recombination, HR)修復(fù)途徑通過提供供體DNA可實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)編輯或特定基因的插入[18,19]。

圖1 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因突變原理

目前，在模式動物果蠅中主要有4種基于CRISPR/Cas9構(gòu)建突變體的途徑[9]：(1)卵中共注射Cas9 mRNA和sgRNA；(2)卵中共注射兩個(gè)可以分別表達(dá)Cas9和sgRNA的質(zhì)粒；(3)在Cas9轉(zhuǎn)基因果蠅卵中注射sgRNA質(zhì)粒；(4)構(gòu)建sgRNA轉(zhuǎn)基因品系，然后和現(xiàn)存的Cas9轉(zhuǎn)基因果蠅雜交。在這些方法中，方法(1)的成本高，方法(2)的突變效率低，方法(4)獲得突變體的時(shí)間長。相比之下，方法(3)通過收集Cas9轉(zhuǎn)基因果蠅卵，向其注射sgRNA質(zhì)粒是最簡單的突變體構(gòu)建方式[20]。Cas9 轉(zhuǎn)基因果蠅又分為兩大類：一類是體細(xì)胞與生殖細(xì)胞均表達(dá)Cas9，比如-Cas9品系；另一類是僅生殖細(xì)胞特異表達(dá)Cas9，如-Cas9和-Cas9品系。其中，利用第二類轉(zhuǎn)基因果蠅可以避免體細(xì)胞突變引起的致死，所以構(gòu)建可遺傳突變體的效率更高，同時(shí)sgRNA質(zhì)?？梢愿咄繕?gòu)建，便于突變體資源庫的建立[20]。對于sgRNA元件，其轉(zhuǎn)錄可由不同的啟動子調(diào)控，比如等，經(jīng)過測試，用調(diào)控sgRNA轉(zhuǎn)錄、調(diào)控Cas9表達(dá)是構(gòu)建果蠅突變體的最佳選擇[10]。基于此，清華大學(xué)果蠅中心已建立成熟的突變體構(gòu)建體系[20,21]：根據(jù)CRISPR/ Cas9系統(tǒng)原理，選擇PAM位點(diǎn)上游20 nt 序列作為sgRNA序列，也可利用網(wǎng)站(http://www.flyrnai. org/crispr/)設(shè)計(jì)，并合成相應(yīng)的寡核苷酸鏈，通過退火形成雙鏈DNA片段并與酶切后的載體連接，構(gòu)建-sgRNA質(zhì)粒并測序確認(rèn)，純化后用注射緩沖液溶解(附表1)；收集生殖細(xì)胞特異表達(dá)Cas9的-Cas9轉(zhuǎn)基因果蠅(;-Cas9;或;;-Cas9)卵并注射-sgRNA質(zhì)粒，注射了質(zhì)粒的果蠅為G0，G0與攜帶平衡子的果蠅雜交，其后代G1挑選攜帶平衡子的個(gè)體并進(jìn)行PCR檢測，篩選得到突變體，之后再經(jīng)過遺傳雜交去除Cas9，即可得到相應(yīng)的突變體品系，突變體品系經(jīng)過測序確認(rèn)后，編號(TH代表清華，M代表突變)并存儲資源庫(圖2)。經(jīng)過系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，sgRNA質(zhì)粒注射濃度會影響突變效率：濃度低，突變效率低，但濃度高，毒副作用大，所以一般選擇其注射濃度約為75 ng/μL。另外，sgRNA的GC含量也會影響突變效率，特別是臨近PAM區(qū)域6個(gè)堿基的GC含量，與突變效率有極高的相關(guān)性，高突變率sgRNA，其GC含量往往大于60%。實(shí)際應(yīng)用中，單個(gè)sgRNA往往效率低或突變后的基因仍有功能，因此為了獲得基因功能喪失突變體(null mutant)并提高突變效率，可利用兩個(gè)sgRNA，引導(dǎo)Cas9在同一基因的不同位置發(fā)生切割，達(dá)到去除部分基因序列的目的。上述優(yōu)化條件，為進(jìn)一步提高突變體構(gòu)建效率提供了依據(jù)[22]。

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，不僅可以進(jìn)行基因突變，也可以借助帶有左右同源臂的供體，將外源片段引入基因組或敲除特定片段，實(shí)現(xiàn)基因的精準(zhǔn)編輯。但突變體的篩選除了利用敲入的標(biāo)記基因外，絕大多數(shù)依靠提取基因組、PCR甚至測序，且不同基因可能由于所處染色質(zhì)位置不同，或者對發(fā)育的作用不同，突變效率差異很大，對于這些基因，篩選其突變體成本高，且耗時(shí)費(fèi)力。因此如何便捷快速篩選所需突變體仍然是該系統(tǒng)亟需解決的問題，這也是這套系統(tǒng)應(yīng)用以來還沒有建立其大規(guī)模突變資源庫的原因。在研究基因在組織器官的功能時(shí)，也有一些實(shí)驗(yàn)室利用Gal4/UAS系統(tǒng)，條件性控制Cas9的表達(dá)，在sgRNA的作用下產(chǎn)生突變，但是這套系統(tǒng)仍有較大的局限性，比如在組織器官中產(chǎn)生突變的細(xì)胞數(shù)量少，檢測確認(rèn)困難，且由于突變細(xì)胞的隨機(jī)性產(chǎn)生了表型的多樣性，分析困難，所以條件性突變系統(tǒng)應(yīng)用范圍較小[23,24]。

2 條件性轉(zhuǎn)基因RNA干擾系統(tǒng)

RNA干擾是指細(xì)胞中的單鏈或雙鏈RNA，將與其互補(bǔ)的內(nèi)源性mRNA降解，從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。模式動物果蠅中主要有兩個(gè)RNAi通路，小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)通路和微小RNA(microRNA，miRNA)通路[25,26]。具體來說：(1) siRNA通路，某些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、病毒入侵產(chǎn)生的RNA以及人工DNA載體轉(zhuǎn)錄的RNA，可以形成長雙鏈RNA(long dsRNA)，經(jīng)過Dicer2切割，產(chǎn)生21～23 bp的siRNA，其中一條RNA鏈整合到含有Ago2的RNA沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)中，通過堿基配對找尋目的mRNA，結(jié)合并將其降解；(2) miRNA通路，內(nèi)源或人工DNA載體轉(zhuǎn)錄出帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pri-miRNA，經(jīng)過核酶Drosha切割去除首末端，產(chǎn)生的pre-miRNA隨后出核被Dicer1加工，形成22～24 nt的miRNA，其中一條RNA鏈可以整合到含有Ago1的沉默復(fù)合體里，如果其序列與mRNA 3′端UTR結(jié)合可以抑制該基因的翻譯；如果其序列與mRNA的可編碼序列高度匹配，則同siRNA通路類似，可以將mRNA降解。

圖2 突變體果蠅構(gòu)建體系

果蠅中轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)的利用主要依賴于Gal4/UAS二元系統(tǒng)，Gal4作為轉(zhuǎn)錄激活因子能夠激活UAS下游DNA序列的轉(zhuǎn)錄。因此構(gòu)建轉(zhuǎn)基因干擾品系后，與在細(xì)胞、組織或器官中特異表達(dá)Gal4果蠅品系雜交，即可實(shí)現(xiàn)條件性敲低目的基因[27]。此二元系統(tǒng)，只有當(dāng)Gal4和UAS同時(shí)存在于同一果蠅中時(shí)，干擾才會發(fā)生，所以單獨(dú)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因干擾品系便于品系的保存和相應(yīng)資源庫的建立。借助其他調(diào)控因子，可以實(shí)現(xiàn)對目的基因的時(shí)間特異性調(diào)控。例如，Gal80是Gal4的負(fù)調(diào)控因子，能夠抑制Gal4的轉(zhuǎn)錄激活作用[27]。溫度敏感型Gal80ts，是將intein序列整合進(jìn)Gal80，形成的融合蛋白在18℃時(shí)會釋放出intein，從而保持Gal80活性，抑制Gal4；而在29℃時(shí)，intein穩(wěn)定存在于Gal80中，導(dǎo)致Gal80失活，從而解除Gal80對Gal4的抑制，激活下游DNA的轉(zhuǎn)錄。因此借助于溫度的改變，Gal80ts的應(yīng)用可以控制RNA干擾發(fā)生的時(shí)間[28]。

轉(zhuǎn)基因干擾技術(shù)是近些年研究基因功能重要的工具，由第一代逐步發(fā)展出二代、三代、新一代轉(zhuǎn)基因干擾技術(shù)。第一代轉(zhuǎn)基因干擾技術(shù)最初由VDRC和NIG研發(fā)，依據(jù)siRNA途徑原理構(gòu)建能夠轉(zhuǎn)錄長雙鏈RNA (300～600 bp)的載體，通過轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)載體隨機(jī)整合到果蠅基因組中[29,30]。日本、奧地利分別利用此技術(shù)構(gòu)建了大量相關(guān)品系，建立了各自資源庫。由于長雙鏈RNA能夠在Dicer2的切割下產(chǎn)生數(shù)百個(gè)siRNA，該技術(shù)容易有較高的假陰性和假陽性。假陰性的產(chǎn)生是由于：(1)長雙鏈RNA干擾效率低；(2)整合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平低；(3)載體設(shè)計(jì)缺陷。假陽性的產(chǎn)生是由于：(1)長雙鏈RNA脫靶效應(yīng)；(2)整合時(shí)破壞了發(fā)育相關(guān)重要基因；(3) 載體本底轉(zhuǎn)錄水平高。二代技術(shù)由霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所和哈佛大學(xué)合作研發(fā)，采用phiC31整合酶介導(dǎo)的attP/attB定點(diǎn)整合系統(tǒng)。phiC31整合酶是序列特異性重組酶，能夠識別attB和attP位點(diǎn)特定序列并切割，經(jīng)過連接后載體整合到基因組上，排除了轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的隨機(jī)整合引起的位置效應(yīng)[31]。三代技術(shù)主要由哈佛大學(xué)主導(dǎo)研發(fā)，采用miRNA途徑，即以miR1的構(gòu)型設(shè)計(jì)shRNA，調(diào)控目的基因。依賴miRNA通路，借助高效核酸內(nèi)切酶，可以提高成熟miRNA的數(shù)量，從而顯著提升干擾效率。另外，shRNA設(shè)計(jì)簡單，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均一，便于與基因組比對，大大降低脫靶率。尤其重要的是，該技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)對果蠅雌性生殖細(xì)胞基因的干擾調(diào)控[12,31]。哈佛大學(xué)、清華大學(xué)和日本NIG利用此三代技術(shù)，構(gòu)建了上萬株品系，并在其國家的資源庫保存。近些年，此技術(shù)和相關(guān)品系的應(yīng)用大大促進(jìn)了發(fā)育、神經(jīng)、干細(xì)胞等相關(guān)學(xué)科發(fā)展。

然而，在使用三代轉(zhuǎn)基因干擾技術(shù)調(diào)控目的基因時(shí)，本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在以下缺點(diǎn)：(1)不能調(diào)控高表達(dá)基因；(2)不能同時(shí)調(diào)控多個(gè)基因；(3)該系統(tǒng)存在本底轉(zhuǎn)錄水平高的現(xiàn)象，在沒有Gal4驅(qū)動時(shí)，某些組織仍有相當(dāng)高的轉(zhuǎn)錄水平，從而影響果蠅發(fā)育，造成某些重要基因的轉(zhuǎn)基因干擾果蠅無法純合。為了解決這些問題，清華大學(xué)果蠅實(shí)驗(yàn)室研發(fā)了新一代轉(zhuǎn)基因干擾技術(shù)[11,32]。新一代干擾技術(shù)擁有以下特點(diǎn)：(1)使用代替基因作為篩選標(biāo)記，避免對果蠅神經(jīng)系統(tǒng)及行為造成影響；(2)利用attP/attB系統(tǒng)，將轉(zhuǎn)基因干擾載體定點(diǎn)整合到染色體上，避免了載體隨機(jī)插入造成的位置效應(yīng)和假陽性結(jié)果；(3)使用兩個(gè)gypsy序列，可以加倍增強(qiáng)shRNA轉(zhuǎn)錄水平；(4)該系統(tǒng)使用人工設(shè)計(jì)合成的啟動子DSCP(synthesized core promoter)替代三代技術(shù)的啟動子，降低了系統(tǒng)的本底轉(zhuǎn)錄水平，顯著降低了該系統(tǒng)的假陽性[33]，提升了純合體的比例，將純合子比例從85%提升到99%，便于保存和早期發(fā)育遺傳學(xué)分析；(5)采用miR1構(gòu)型調(diào)控目的基因，干擾效率高，脫靶率低，降低了假陽性和假陰性；(6)該系統(tǒng)可應(yīng)用于雌性生殖細(xì)胞基因的調(diào)控；(7)突破性地實(shí)現(xiàn)了在同一個(gè)載體上克隆多個(gè)shRNA，可同時(shí)有效調(diào)控多個(gè)不同基因，如多個(gè)乙酰化基因或PRC1復(fù)合體等，也可針對同一基因，設(shè)計(jì)多個(gè)shRNA，提高干擾效率，實(shí)現(xiàn)對高轉(zhuǎn)錄基因的干擾，如組蛋白或微管蛋白等。

利用此系統(tǒng)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因干擾果蠅品系，首先需要在網(wǎng)站(biodev.cea.fr/DSOR/DSIR.html)預(yù)測shRNA序列，并構(gòu)建shRNA質(zhì)粒，收集表達(dá)整合酶(phiC31)和攜帶attP位點(diǎn)果蠅(; attP40;或;;attP2)的卵并注射shRNA質(zhì)粒，卵孵化后的果蠅即G0為淺紅眼，G0與淺紅眼果蠅()雜交，去除整合酶并根據(jù)眼睛顏色深淺確定轉(zhuǎn)基因果蠅，深紅眼果蠅是攜帶轉(zhuǎn)基因的果蠅，但由于深紅眼與淺紅眼色差不大，初學(xué)者挑選深紅眼需要在孵化成蟲后6個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。深紅眼轉(zhuǎn)基因果蠅(G1)進(jìn)一步與攜帶平衡子的果蠅雜交，得到轉(zhuǎn)基因干擾果蠅品系，經(jīng)提取DNA測序確認(rèn)后，編號(TH代表清華，R代表RNAi)并存儲資源庫(圖3)。利用此技術(shù)，清華大學(xué)果蠅中心針對果蠅中與人類基因高度同源的致病基因構(gòu)建了數(shù)千株品系。

與基因突變相比，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因干擾果蠅周期短、成本低、便于保存，特別是在研究因基因缺失而產(chǎn)生組織器官的表型時(shí)，轉(zhuǎn)基因干擾表型均一，可重復(fù)性高，所以轉(zhuǎn)基因干擾是研究基因功能的重要工具。雖然新一代轉(zhuǎn)基因干擾技術(shù)相比于第三代技術(shù)有了多維度的改進(jìn)，但其單個(gè)shRNA調(diào)控基因表達(dá)的效率較之第三代并無顯著提升，這是由新一代系統(tǒng)使用的DSCP啟動子本身轉(zhuǎn)錄水平?jīng)Q定的。因此，繼續(xù)研發(fā)下一代轉(zhuǎn)基因干擾技術(shù)，提升干擾效率，對發(fā)育生物學(xué)研究具有重要意義。

圖3 RNA干擾果蠅構(gòu)建體系

3 flySAM轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)

研究基因的功能、挽救敲低或敲除基因產(chǎn)生的表型，都離不開目的基因的過表達(dá)。傳統(tǒng)的過表達(dá)方式主要利用Gal4/UAS系統(tǒng)，組織特異性驅(qū)動目的基因cDNA的轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)過表達(dá)的目的[34]，但是，此方式存在相關(guān)載體構(gòu)建復(fù)雜，時(shí)間成本高，難以同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的過表達(dá)等缺點(diǎn)，盡管利用現(xiàn)有cDNA質(zhì)粒資源庫可省略克隆步驟，但過表達(dá)所用序列只能依靠現(xiàn)有質(zhì)粒資源庫，且仍未解決難以同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因過表達(dá)的問題[35]，因此亟需一種簡單的基因過表達(dá)或基因激活系統(tǒng)。

近年來，對CRISPR/dCas9系統(tǒng)的深入研究為轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)(CRISPR/Cas9-based transcriptional activation，CRISPRa)的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)[36]。通過對Cas9蛋白的內(nèi)切酶活性位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突形成dCas9，使其失去DNA雙鏈切割能力，但仍可以與sgRNA結(jié)合，引起其構(gòu)象的改變，如果dCas9羧基端融合轉(zhuǎn)錄激活因子，則能夠在sgRNA引導(dǎo)下靶向特定位置并激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。與構(gòu)建CRISPR/Cas9突變系統(tǒng)類似，該激活系統(tǒng)也僅需20 bp sgRNA就可實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄激活。

為了在果蠅中建立CRISPRa系統(tǒng)，許多實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了不同的嘗試。VPR(VP64-p65-Rta)系統(tǒng)可應(yīng)用于果蠅體外細(xì)胞系或個(gè)體體內(nèi)，能夠激活靶基因的轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生相應(yīng)的發(fā)育表型，但其效率較低，且需要兩個(gè)sgRNA才能完成對基因的激活，增加了載體構(gòu)建的成本及時(shí)間，此外，應(yīng)用時(shí)需要提前將兩個(gè)元件(如Gal4和UAS-dCas9-VPR、Gal4和sgRNA、UAS-dCas9-VPR和sgRNA)整合在果蠅上，整合周期長[37,38]。為了進(jìn)一步提高激活效率，降低毒副作用，簡化遺傳操作步驟，通過對比各種轉(zhuǎn)錄激活因子及其組合分析，清華大學(xué)果蠅中心主導(dǎo)研發(fā)了flySAM(synergistic activation mediator)系統(tǒng)[13,39]。此系統(tǒng)包括UAS-dCas9激活元件和sgRNA元件(圖4)。對于UAS-dCas9激活元件，dCas9轉(zhuǎn)錄激活融合蛋白受Gal4/UAS二元系統(tǒng)調(diào)控，可以表達(dá)dCas9-VP64和T2A介導(dǎo)的MCP-p65-HSF1。sgRNA元件除了有靶向目的基因的引導(dǎo)序列外，還有能被MCP識別的MS2序列。MCP序列能夠結(jié)合MS2，因此在sgRNA的帶領(lǐng)下，dCas9-VP64結(jié)合到靶位點(diǎn)處，同時(shí)，MCP-p65-HSF1與MS2結(jié)合，從而增加了轉(zhuǎn)錄激活元件，提高效率。為了簡化遺傳操作的步驟，將以上兩個(gè)元件整合到同一載體上，其注射產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因品系直接與現(xiàn)存的Gal4品系雜交，一步實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的激活。

圖4 flySAM基因轉(zhuǎn)錄激活模式圖

與傳統(tǒng)方法比，flySAM有顯著的優(yōu)勢：(1)載體僅需克隆20 bp DNA，成本低，操作簡單；(2)實(shí)現(xiàn)原位基因的轉(zhuǎn)錄激活，與傳統(tǒng)Gal4/UAS強(qiáng)制過表達(dá)相比，能夠減少副作用；(3)可以同時(shí)克隆多個(gè)sgRNA，便于激活多個(gè)基因；(4)許多基因如泛素化連接酶經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后剪切修飾，形成多個(gè)不同的成熟轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而翻譯出多個(gè)蛋白異構(gòu)體，不同異構(gòu)體可能發(fā)揮不同功能。使用傳統(tǒng)過表達(dá)方式只能過表達(dá)其中一種異構(gòu)體，為研究基因功能造成了一定障礙。使用flySAM系統(tǒng)在基因組水平上激活基因表達(dá)，可同時(shí)提高目的基因所有轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄水平，在研究基因功能時(shí)有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。

此系統(tǒng)的效率高度依賴于sgRNA中20 bp靶向序列的選擇，為了提高flySAM的效率，對sgRNA參數(shù)進(jìn)行探究后發(fā)現(xiàn)：(1)通常sgRNA GC堿基含量愈高，激活愈顯著；(2)存在位置效應(yīng)，激活有效區(qū)主要集中在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游150 bp左右，當(dāng)sgRNA遠(yuǎn)離起始位點(diǎn)上游600 bp時(shí)，盡管GC含量高，也失去激活能力；(3) sgRNA靶向DNA非模板鏈時(shí)，與靶向模板鏈相比激活效果更加顯著[40]。完備的工作效率測試和工作條件探索極大地提升了flySAM系統(tǒng)應(yīng)用的高效性和便利性，完整的sgRNA設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)對所有希望使用該系統(tǒng)的科研工作者開放，幫助他們實(shí)現(xiàn)高效的基因轉(zhuǎn)錄激活。構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活果蠅時(shí)首先根據(jù)已知優(yōu)化條件設(shè)計(jì)高效sgRNA，并構(gòu)建質(zhì)粒，質(zhì)粒的注射及轉(zhuǎn)基因激活果蠅的篩選與轉(zhuǎn)基因干擾果蠅構(gòu)建流程相似，得到轉(zhuǎn)錄激活品系后，測序確認(rèn)，編號(TH代表清華，A代表激活)并存儲資源庫(圖5)?；谠撓到y(tǒng)清華大學(xué)構(gòu)建了豐富的轉(zhuǎn)基因品系資源庫，與基因突變和基因干擾技術(shù)互相補(bǔ)充，為疾病模型構(gòu)建、藥物功能篩選等科研工作提供了極大助力。

目前flySAM系統(tǒng)仍存在一定的缺陷，比如利用flySAM系統(tǒng)激活某些基因時(shí)，與轉(zhuǎn)基因干擾或傳統(tǒng)過表達(dá)相比，出現(xiàn)表型的概率較低。另外，雖然該系統(tǒng)可以在體細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效、特異的基因轉(zhuǎn)錄激活，但在生殖系統(tǒng)中效果較差并有降低胚胎孵化率的副作用。因此為了進(jìn)一步提高該系統(tǒng)的激活效率，還可以對載體進(jìn)行改造，如測試其他的轉(zhuǎn)錄激活因子等。

圖5 flySAM轉(zhuǎn)基因果蠅構(gòu)建體系

4 結(jié)語與展望

果蠅是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域經(jīng)典的遺傳、發(fā)育模式動物，各項(xiàng)轉(zhuǎn)基因調(diào)控技術(shù)可與其他模式動物相互借鑒。得益于果蠅得天獨(dú)厚的優(yōu)勢，以及遺傳學(xué)工具的多樣性，特別是基因編輯、轉(zhuǎn)基因干擾和基因過表達(dá)的應(yīng)用，在發(fā)育、神經(jīng)、代謝以及免疫等領(lǐng)域相關(guān)的科研成果不斷涌現(xiàn)。近10年來，國內(nèi)果蠅實(shí)驗(yàn)室迅猛發(fā)展，科研成果大幅度增加，對轉(zhuǎn)基因品系需求日益增長。盡管果蠅飼養(yǎng)簡單，但品系維持成本非常高，限制了果蠅轉(zhuǎn)基因資源庫的規(guī)模。清華大學(xué)果蠅中心(https://thfc.zzbd.org) (圖6)及實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的包括基因突變、轉(zhuǎn)基因干擾和轉(zhuǎn)基因激活系統(tǒng)在內(nèi)的世界前沿技術(shù)，被國內(nèi)外科研工作者廣泛應(yīng)用，但各項(xiàng)技術(shù)仍然有改進(jìn)和提升空間。在生命科學(xué)領(lǐng)域高速發(fā)展、高通量技術(shù)逐漸泛用化的時(shí)代背景下，各類模式生物的品系資源庫的構(gòu)建愈發(fā)重要。目前已有的品系構(gòu)建技術(shù)基本可以覆蓋科研需求，但仍存在調(diào)控部分基因效率較低，構(gòu)建品系周期較長，人力成本較高等問題。在提升系統(tǒng)工作效率的同時(shí)，優(yōu)化品系構(gòu)建的方法、縮短品系構(gòu)建周期是未來研發(fā)工作的重點(diǎn)所在。清華果蠅資源庫與國內(nèi)其他品系資源庫的建立大大改善了之前國內(nèi)果蠅品系構(gòu)建周期長、運(yùn)輸成本高、運(yùn)輸途中果蠅死亡率高等眾多不利情況，更重要的是，利用自身研發(fā)的前沿轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可免受國外技術(shù)的知識產(chǎn)權(quán)限制。

圖6 清華果蠅中心平臺

附加材料詳見文章電子版www.chinagene.cn。

附表1 果蠅培養(yǎng)所需試劑耗材及注射緩沖液配方

Supplementary Table 1 Materials forculture and formulations of injection buffer

項(xiàng)目備注 果蠅食物混合玉米面（濟(jì)南佳碩生物技術(shù)有限公司）、紅糖（網(wǎng)山）、白砂糖（龍二）、酵母（安琪）、瓊脂（科百奧）、乙醇（滬試）、丙酸（滬試）、抗生素（Amresco） 果蠅瓶塞濟(jì)南佳碩生物技術(shù)有限公司 果蠅管紹興上虞八達(dá)通信電器有限公司 注射緩沖液0.1 mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.8)、5 mM KCl

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The cutting edge of gene regulation approaches in model organism

Yuting Han, Bowen Xu, Yutong Li, Xinyi Lu, Xizhi Dong, Yuhao Qiu, Qinyun Che, Ruibao Zhu, Li Zheng, Xiaochen Li, Xu Si, Jianquan Ni

Transgenic gene regulatory techniques play a critical role in biomedical fields since they are essential for researchers to study the molecular mechanisms of development and diseases. The currently prevalent transgenic techniques include specific gene mutation, transgenic RNAi and targeting activation, etc. Specifically, various gene regulatory tools have been developed to temporarily and spatially modulate genes in, which is a typical model organism with evolutionally conserved genome and without ethical issues in scientific research. Here, we introduce several gene regulatory techniques commonly used in, includingthe principle, procedure, toolbox and related transgenic resource of CRISPR/Cas9-triggered heritable gene mutation system, next-generation transgenic RNAi and CRISPR/dCas9-based transcriptional activation (flySAM) approach. We wish to take this opportunity to raise the awareness of the importance of transgenic gene regulatory techniques development and related resource construction and thus to promote biomedical research progression.

; gene regulation; CRISPR/Cas9; gene editing; transgenic RNAi; CRISPRa

2021-10-07;

2021-12-21;

2022-01-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：20181300988，20201300797)和科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(編號：2016YFE0113700)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 20181300988, 20201300797) and the National Key Technology Research and Development Program of the Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China (No. 2016YFE0113700)]

韓玉婷，在讀博士研究生，研究方向：基因調(diào)控技術(shù)。E-mail: hanyt19@mails.tsinghua.edu.cn

倪建泉，博士，研究員，研究方向：發(fā)育遺傳學(xué)。E-mail: nijq@mail.tsinghua.edu.cn.

10.16288/j.yczz.21-347

倪建泉課題組以果蠅為模式動物，開發(fā)遺傳工具，研究表觀遺傳蛋白與信號通路在干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮的作用。課題組開發(fā)了包括基于CRISPR的基因編輯技術(shù)、基因定點(diǎn)激活技術(shù)和新一代轉(zhuǎn)基因干擾技術(shù)在內(nèi)的一系列果蠅遺傳學(xué)新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)在個(gè)體水平上特異調(diào)控細(xì)胞組織器官基因的表達(dá)。利用這些技術(shù)，建立轉(zhuǎn)基因果蠅資源庫，并進(jìn)行了發(fā)育與干細(xì)胞相關(guān)的研究，主要成果包括確立組蛋白H1對干細(xì)胞的直接和間接調(diào)控作用；發(fā)現(xiàn)HP1c直接參與Notch信號的抑制，調(diào)控消化道干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；確定了3個(gè)組蛋白乙酰化酶在果蠅眼睛發(fā)育中的協(xié)同作用及機(jī)制。相關(guān)研究成果發(fā)表在、、等期刊上。現(xiàn)作為課題組長，參與科技部支撐計(jì)劃和發(fā)育代謝重大研發(fā)計(jì)劃等。

(責(zé)任編委: 韓俊海)