二甲雙胍對斑馬魚骨骼發(fā)育及損傷修復的機制研究

賈婷婷，雷蕾，吳歆媛，蔡順有，陳藝璇，薛鈺

二甲雙胍對斑馬魚骨骼發(fā)育及損傷修復的機制研究

賈婷婷1，雷蕾1，吳歆媛1，蔡順有2，陳藝璇1，薛鈺1

1. 閩南師范大學，福建省菌類活性物質工程技術研究中心，漳州 363000 2. 閩南師范大學，化學化工與環(huán)境學院，福建省現(xiàn)代分離分析重點實驗室，漳州 363000

二甲雙胍(metformin, MET)是治療糖尿病的一線藥物，對骨骼疾病也有一定的治療效果，但具體作用機制尚不明確。本研究利用斑馬魚()構建骨質疏松模型，通過熒光觀察、骨骼染色、半定量PCR、原位雜交及ELISA等技術方法，探究MET對斑馬魚骨骼發(fā)育及損傷修復的作用機制。首先通過胚胎致死率、骨骼礦化及鈣化程度確定了MET的工作濃度是0.1%，該濃度MET對斑馬魚胚胎和幼魚的骨骼發(fā)育均有顯著的促進作用，可通過增強骨骼調控基因的mRNA水平和蛋白質水平實現(xiàn)。進一步利用枸櫞酸鐵銨(ferric ammo-nium citrate, FAC)和硝基還原酶/甲硝唑(nitroreductase/metronidazole, NTR/MTZ)系統(tǒng)構建斑馬魚體外和體內骨質疏松模型，并利用MET進行恢復實驗，結果表明MET能顯著修復FAC或MTZ誘導引起的骨骼礦化面積減小、脊椎鈣化減少、成骨分化減弱等骨質疏松表型，通過促進成骨細胞再生、增強成骨細胞標記物(ALP)表達和抑制破骨細胞標記物(、TRAP)的活性發(fā)揮修復作用。最后，通過檢測Bmp信號成員的表達水平變化，初步證明MET不僅可以增強Bmp的mRNA和蛋白表達，還可通過激活Bmp下游信號通路促進斑馬魚骨骼發(fā)育和損傷修復。綜合本研究的實驗結果表明，MET作為治療糖尿病專用藥的同時，對斑馬魚骨骼發(fā)育也有促進作用，且對骨質疏松癥具有顯著的修復功效，為老藥新用提供了新的研究方向和實驗支撐。

二甲雙胍；斑馬魚；骨質疏松；損傷修復；Bmp

最近的研究已經證實MET可以減少巨噬細胞促炎癥細胞因子的產生，在多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS)治療中表現(xiàn)出理想的免疫調節(jié)活性[12]。此外，最近的一項蛋白組學研究表明，由于MET的抗病毒活性以及在動物模型中具有減輕急性肺損傷的效果，因此認為MET可以通過增強人體蛋白ACE2磷酸化水平，從而改變其構象來破壞病毒蛋白與ACE2受體之間的相互作用直接抑制SARS-CoV-2感染，可被用作SARS-CoV-2感染和其他病毒感染的潛在治療藥物[13]。研究表明，MET可以促進體外骨細胞的增殖、分化及細胞外基質礦化，逆轉高濃度葡萄糖對成骨細胞功能的損傷，抑制破骨細胞的形成，保護2型糖尿病(adult-onset diabetes mellitus, DM)患者的骨質[14]。

骨質疏松癥(osteoporosis)是由于骨組織中完成骨吸收功能的破骨細胞，與主導骨形成功能的成骨細胞，二者之間的平衡被打破從而引起的骨代謝性疾病[15]，主要表現(xiàn)為骨折風險增加，嚴重威脅患者生命安全。目前全球已超過2億人患有骨質疏松病，我國約有1.4億骨質疏松癥患者，其中40歲以上人群的患病率為24.6%，位列全球慢性病第3位。隨著人口老齡化的加劇，骨質疏松癥已成為全球性健康問題[16]。

骨組織的發(fā)育、重建是一個完整的動態(tài)過程。目前已在小鼠()、兔()、猴()等動物中成功構建了骨質疏松模型[17]，但存在造模用藥周期長、工作量大且成本高等限制因素，上述模型本身無法動態(tài)追蹤骨骼損傷及重建過程。斑馬魚()由于軀體透明度高、便于觀察，在20

世紀80～90年代初就被確立為一種新的模式動物。由于其基因與人類基因的相似度較高，尤其是骨骼發(fā)育過程的分子調控機制與哺乳動物具有高度的同源性。目前已經發(fā)展出多種成熟的研究骨骼發(fā)育的技術手段，包括不同的骨骼染色技術及對特異標記骨骼的轉基因品系的熒光追蹤，為建立骨疾病模型的構建以及藥物篩選提供了有力支撐[18]。本實驗室在前期工作中，利用高鐵脅迫成功構建了斑馬魚骨質疏松疾病模型，該模型可用于抗骨質疏松藥物的篩選及機理研究，且對臨床知名抗骨質疏松藥物阿倫磷酸鈉具有同樣適用性[19]。本研究進一步利用斑馬魚骨質疏松模型探究了MET促進成骨再生的活性及損傷修復的作用機制，為其用于骨疾病臨床治療提供思路和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

MET緩釋片為中美上海施貴寶制藥有限公司生產。

本研究所使用的斑馬魚品系包括：TU、成骨細胞特異表達的()表征Bmp信號活性的()。()品系由清華大學孟安明課題組構建和篩選；()品系由中國科學院動物研究所王強課題組贈予。所有斑馬魚品系均飼養(yǎng)于28±0.5℃淡水循環(huán)系統(tǒng)中，光照周期14 h光照/10 h黑暗，水循環(huán)系統(tǒng)pH恒定為7.0～7.4，每日定時定量喂食豐年蝦3次[20]。

實驗前一晚，挑選達到性成熟、交配成功率高的斑馬魚于配魚缸中，隔板將雌雄魚隔開，于次日上午8:00換水后抽出中間隔板，30 min后收集受精卵于含有Holfreter水(3.5 g/L NaCl、0.1 g/L CaCl2、0.05 g/L KCl、0.025 g/L NaHCO3)的培養(yǎng)皿中，28℃恒溫培養(yǎng)。

2018年8月6日起北京一輪雨勢來臨的幾天里，我們當年黑龍江建設兵團老九連的一幫“老職工”又出遠門了，去距京六七百公里的內蒙古東蒙克什克騰旗一帶旅行。

1.2 給藥濃度的確定

用Holfreter水配制不同濃度MET溶液(濃度分別為0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL)，以6孔板為實驗容器，每孔加入30枚胚胎，同一濃度設兩組平行，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每12 h換藥；同時記錄挑走的死亡胚胎數(shù)和存活胚胎的發(fā)育狀況，72 h后統(tǒng)計并計算致死率，選擇致死率較低的為給藥濃度。

1.3 MET對骨骼發(fā)育的影響

TU品系自交，收集受精后0.75 h的胚胎，分于6孔板中，每孔30枚；Holfreter水設為空白對照組，給藥組為實驗組，每12 h換藥，保持藥物濃度不變，28℃恒溫培養(yǎng)至8 d。用雙蒸水清洗幼魚，收集樣品用于后續(xù)實驗。

1.4 MET對體外骨質疏松斑馬魚模型的修復

本實驗室在前期的研究工作中通過摸索確定500 g/mL枸櫞酸鐵銨(ferric ammonium citrate, FAC)可成功構建斑馬魚骨質疏松模型。本研究中，將受精后的胚胎于Holfreter水培養(yǎng)4 d后分為：空白對照即CTR組(Holfreter水繼續(xù)培養(yǎng)至第8 d)、FAC持續(xù)造模組(500 g/mL FAC培養(yǎng)至第8 d)、Holfreter水陰性對照組(FAC培養(yǎng)2 d后，換為Holfreter水培養(yǎng)2 d)、依替膦酸二鈉(etidronate, ED)陽性對照組(FAC培養(yǎng)2 d后，換為1 mg/mL ED培養(yǎng)2 d)和MET實驗組(FAC培養(yǎng)2 d后，換為1 mg/mL MET培養(yǎng)2 d)，共5組，對培養(yǎng)至8 d的幼魚進行染色或其他實驗。

1.5 MET對體內骨質疏松模型的損傷修復

NTR/MTZ細胞消融體系中，當加入硝基還原酶(nitroreductase, NTR)底物甲硝唑(metronidazole, MTZ)時，MTZ與NTR反應，可特異性殺死被熒光標記的細胞，熒光表達消失。本研究利用成骨細胞特異表達的轉基因品系()，在該品系中通過MTZ誘導可特異破壞殺死成骨細胞，從體內模擬骨質疏松癥。對發(fā)育至48 hpf的胚胎，將其分為：空白對照即CTR組(Holfreter水繼續(xù)培養(yǎng)至第5 d)、MTZ持續(xù)造模組(8 mmol/L MTZ培養(yǎng)至第5 d)、ED組(MTZ培養(yǎng)1 d后，換為1 mg/mL ED培養(yǎng)2 d)和MET實驗組(MTZ培養(yǎng)1 d后，換為1 mg/mL MET培養(yǎng)2 d)，共4組，收集5 d的幼魚進行后續(xù)實驗。

1.6 茜素紅和鈣黃綠素染色

茜素紅(alizarin red)染色骨鈣化基質，與骨骼中的鈣離子螯合發(fā)生顯色反應，產生深紅色的有色化合物，以此來判斷干細胞向骨細胞轉化的程度，可用于檢測斑馬魚成骨的發(fā)育程度[21,22]。鈣黃綠素(calcein)在進入斑馬魚體內后可與骨骼中鈣化的骨基質結合，產生強烈的綠色熒光。因此鈣黃綠素可用于標記斑馬魚成骨骨結構，是活體斑馬魚骨染色最好的染色劑[23]。茜素紅和鈣黃綠素染色方法參考文獻[24]。染色完成后，拍照記錄染色情況。

1.7 整胚原位雜交及半定量PCR

利用整胚原位雜交及半定量PCR技術在mRNA水平上檢測骨骼相關基因和的表達。Runx2家族作為調控成骨特異性轉錄因子，是間充質細胞向成骨細胞分化的重要標志。研究表明，成骨細胞分化初期，、起始骨基質蛋白的生成，從而使成骨細胞向骨細胞轉化[25]。是一種重要的早期胚胎發(fā)育相關因子，在軟骨形成中起著極其重要的作用[26]。鋅指轉錄因子s(也稱)是成骨細胞分化和骨骼形成的標記基因，是成骨細胞特異表達的轉錄因子[27]。組織蛋白酶K ()和基質金屬蛋白酶-9 ()是破骨細胞標志基因，破骨細胞吸附到舊骨質上分泌Ctsk和Mmp9等蛋白酶消化骨基質，形成吸收窩陷，導致骨吸收[27]。Bmp(bone morphogenetic proteins)是TGF-β超家族中的一個亞家族，該蛋白家族在不同的組織中具有廣泛的生物活性，參與骨組織、血液、心臟、腎臟、肝臟以及肺等的發(fā)育。Bmp通過胞內信號轉導，調控骨骼發(fā)育，包括軟骨和硬骨形成、顱面骨和肢體骨骼發(fā)育，并且這種調控作用在不同脊椎動物模型中是高度保守的[28]。

總RNA提取、反轉錄和原位雜交實驗步驟參考文獻[24]。

1.8 ELISA檢測蛋白表達量

本研究采用特異檢測斑馬魚骨骼發(fā)育調控因子的ELISA試劑盒(中國臺灣Zgenebio公司)檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(anti-tartrase acid phosphatase, TRAP)、Sox9、Bmp2b及Bmp4的蛋白表達量，實驗步驟根據(jù)試劑盒說明書進行。

2 結果與分析

2.1 二甲雙胍能顯著促進斑馬魚硬骨礦化和鈣化

本研究通過不同濃度梯度的MET溶液培養(yǎng)斑馬魚胚胎，對胚胎發(fā)育毒性進行測試，通過致死率、發(fā)育延緩程度確定合適的MET工作濃度。如圖1所示，與對照組(0 mg/mL)相比，0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL濃度處理組的致死率均小于15%，這幾個濃度下的胚胎發(fā)育速度均正常；5 mg/mL濃度組死亡率超過23.33%，MET濃度為10 mg/mL時致死率最高，高達90%，存活的胚胎發(fā)育遲緩嚴重(圖1：A，B)。選擇0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL濃度MET處理受精后0.75 h的胚胎，收集8 dpf幼魚進行不同的硬骨染色觀察MET對幼魚骨骼發(fā)育的影響。茜素紅染色能觀察到對照組在孔蓋(operculum, op)、脊索(notochord, nc)、匙骨(cleithrum, cl)、副蝶骨(parasphenoid, ps)等部位有清晰的染色信號，當不同濃度的MET處理后，能引起斑馬魚在nc、cl部位的染色信號出現(xiàn)不同程度加深，在op、nc、cl、ps部位的染色區(qū)域擴大(圖1C)；從鈣黃綠素染色結果分析可見：對照組有6節(jié)脊出現(xiàn)鈣化，其中5節(jié)較為完整，不同濃度MET處理后，脊椎的鈣化數(shù)量增至7到8節(jié)，鈣化完整的脊椎進一步增多(圖1D)。通過對上述染色區(qū)域及光密度值(IOD)進行統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，1 mg/mL MET對骨骼礦化及鈣化的促進作用最明顯(圖1E)。故在后續(xù)的實驗中，本研究以1 mg/mL即0.1% MET為主要工作濃度。

2.2 MET促進骨骼發(fā)育調控關鍵因子的表達

MET對斑馬魚幼魚的硬骨發(fā)育有明顯促進作用。為了進一步探究MET對骨骼發(fā)育調控基因表達的影響，本研究首先通過原位雜交檢測了0.1% MET處理24 hpf后基因家族的時空表達情況。在胚胎發(fā)育早期主要在前上頜骨及齒骨表達，本研究結果表明，MET能促進在前上頜骨的表達明顯增強(圖2A)；MET對和在頭部表達也有相同的促進作用(圖2：B，C)，預示著MET對斑馬魚骨骼發(fā)育的影響在胚胎發(fā)育早期開始發(fā)揮作用。本研究進一步檢測了MET處理8 dpf的幼魚，通過ELISA檢測Sox9、ALP和TRAP的蛋白水平變化。其中，在MET誘導下Sox9、ALP的蛋白表達明顯增加，表明MET可以明顯增強成骨細胞的活性(圖2：D，E)；與此相反，MET能顯著下調TRAP的表達水平，表明MET對破骨細胞形成具有抑制作用(圖2F)。

圖1 胚胎致死率及骨骼染色結果

A：二甲雙胍（MET）分子結構示意圖；B：不同濃度下胚胎致死率；C：茜素紅染色腹部觀；D：鈣黃綠素染色側面觀；E：統(tǒng)計分析結果。ps：副蝶骨；nc：脊索；cl：匙骨；op：孔蓋。與空白對照（CTR）組比較，*表示<0.05，**表示<0.01。圖右下角的數(shù)字例如13/17表示17枚胚胎中有13枚胚胎著色如圖所示，具有統(tǒng)計學意義。

圖2 MET處理對成骨相關表達基因在mRNA水平及蛋白質水平的影響

A～C：二甲雙胍（MET）處理后檢測24 hpf成骨相關基因的mRNA表達(A：胚胎背面觀；B、C：胚胎側面觀)；D～F：骨骼相關蛋白標識物的表達。與空白對照（CTR）組比較，*表示<0.05。

2.3 MET對斑馬魚體外骨質疏松模型的損傷修復作用

MET在不同水平上均可促進斑馬魚骨骼發(fā)育。本實驗室在前期工作中成功構建了體外高鐵FAC誘導的斑馬魚骨質疏松模型[19,27]，基于此，為了探究MET對骨骼損傷是否也具有治療作用，本研究進一步探索了MET是否能修復高鐵誘導的骨骼損傷。采用1.4所述的給藥方式(圖3A)，收集發(fā)育至8 dpf的幼魚進行茜素紅染色。結果表明，與CTR組相比，F(xiàn)AC組即模型組在孔蓋(op)和脊索(nc)的染色信號完全消失，僅剩極少的染色信號在匙骨(cl)可見；MET恢復組中op、nc染色面積均有明顯恢復，且cl染色面積及染色深度明顯增加(圖3B)。鈣黃綠素染色結果表明，F(xiàn)AC組脊椎鈣化數(shù)量減少至兩節(jié)，明顯少于CTR組，MET組加藥后可使脊椎節(jié)數(shù)恢復為4節(jié)(圖3C)。對兩種染色結果進行統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)MET可以有效修復由FAC誘導的斑馬魚體外硬骨及脊柱鈣化損傷(圖3：D～F)。

經1.4所述給藥方式處理后，收集不同組別樣品提取總RNA并進行反轉錄和PCR擴增獲得骨骼標記基因的特異擴增片段表征mRNA表達水平，通過對電泳條帶及條帶灰度進行分析，可以看到FAC組的表達量明顯低于CTR組，約為對照組的70%左右，MET組與FAC組相比有顯著升高。而對于和，結果則相反，其中FAC誘導組中這兩個基因的相對表達量均增加了3倍以上，表明破骨細胞與成骨細胞的平衡被明顯破壞，MET能將這種異常升高顯著下調(圖3：G，H)。上述結果表明，MET可以通過調控骨骼標記基因在mRNA水平上的表達促進成骨細胞分化，抑制破骨細胞活性，有效恢復FAC誘導的斑馬魚骨骼損傷。

圖3 MET對FAC誘導的體外骨質疏松模型的修復作用

A：給藥示意圖；B：茜素紅染色腹部觀；C：鈣黃綠素染色側面觀；D～F：染色統(tǒng)計分析結果；G：、、基因PCR擴增電泳圖；H：對G圖中電泳條帶的灰度分析；I：ALP蛋白相對表達量；J：TRAP蛋白相對表達量。CTR：空白對照組；FAC：枸櫞酸鐵銨誘導組；Holf：Holfreter水陰性恢復組；ED：依替膦酸二鈉陽性藥物組；MET：二甲雙胍處理組。cl：匙骨；nc：脊索；op：孔蓋。與CTR組比較，#表示<0.05，##表示<0.01，###表示<0.001；與FAC組比較，*表示<0.05，**表示<0.01，***表示<0.001。

此外，本研究通過ELISA對成骨細胞標記因子ALP及破骨細胞標記因子TRAP進行蛋白水平的檢測，結果與mRNA變化趨勢相似，MET可以促進由FAC引起的ALP表達降低，降低由FAC引起的TRAP的表達升高(圖3：I，J)。證明MET可以在蛋白質水平上修復由FAC誘導的斑馬魚體外骨質疏松。

2.4 MET對成骨細胞再生具有明顯促進作用

本研究還利用轉基因品系()[29]誘導模擬斑馬魚體內骨質疏松模型。該品系中正常胚胎可在成骨細胞特異表達紅色熒光蛋白，當加入NTR底物MTZ時，MTZ與NTR反應特異性殺死成骨細胞，成骨細胞減少，破骨細胞相對增加，骨平衡被打破，進一步誘發(fā)骨質疏松癥。采用1.5所述的處理方式(圖4A)，收集發(fā)育至5 dpf的幼魚，觀察不同組別的紅色熒光蛋白表達情況并進行茜素紅染色。結果發(fā)現(xiàn)：相比于對照組，MTZ模型組的紅色熒光的表達在匙骨(cl)、孔蓋(op)、副蝶骨(ps)、鰓條骨(branchiostegal, bs)、麥柯耳軟骨(Meckel’s car-tilage, mk)及軟骨內成骨(entochondrostosis, en)等區(qū)域整體明顯減弱且呈點狀分布(圖4B)；骨骼染色顯示硬骨脊索(nc)、匙骨(cl)、孔蓋(op)幾乎完全消失(圖4D)，表明成骨細胞大部分被殺死、硬骨被破壞。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，MTZ組的熒光表達區(qū)域及染色面積均顯著減少，約為對照組的1/10甚至更低水平。加入MET后，紅色熒光恢復完整、硬骨染色明顯恢復接近于對照組，甚至超過陽性藥物ED組(圖4：C，E)。結果表明，MET可以有效修復MTZ誘導引起的成骨細胞損傷，且這一修復作用是通過促進成骨細胞再生實現(xiàn)的。

圖4 MET對轉基因斑馬魚Tg(osx: mCherry-Ntr)成骨細胞再生具有明顯促進作用

A：給藥示意圖；B：熒光表達腹部觀；C：相對熒光面積統(tǒng)計分析；D：茜素紅染色腹部觀；E：相對礦化面積統(tǒng)計分析；F：ALP、TRAP蛋白相對表達量。CTR：空白對照組；MTZ：甲硝唑誘導組；ED：依替膦酸二鈉恢復組；MET：二甲雙胍恢復組。cl：匙骨；op：孔蓋；bs：鰓條骨；ps：副蝶骨；mk：麥柯耳軟骨；en：軟骨內成骨；nc：脊索。與CTR組比較，#表示<0.05，##表示<0.01，###表示<0.001；與MTZ組比較，*表示<0.05，**表示<0.01，***表示<0.001。

進一步檢測成骨細胞和破骨細胞標記因子的蛋白質水平變化，得到相似的結果，MTZ誘導引起ALP蛋白水平下降至對照組的30%，MET處理能將其恢復至60%左右，MET能顯著修復由MTZ引起的TRAP表達增高，降低至與對照組相當?shù)乃?圖4F)。上述結果表明MTZ誘導的體內骨質疏松模型中，MET能通過促進成骨細胞再生，增強成骨標記因子的蛋白表達水平，抑制破骨細胞活性發(fā)揮修復功效。

2.5 MET對斑馬魚成骨的促進及損傷修復的作用機制

為了探索MET對斑馬魚成骨的促進及損傷修復的作用機制，本研究檢測了Bmp信號通路基因和的表達情況。收集用0.1% MET處理24 hpf的胚胎進行整胚原位雜交，結果表明：MET能促進和在頭部、軀干和尾部的表達有明顯增加(圖5A)。用MET持續(xù)處理至8 dpf，通過ELISA檢測Bmp相關蛋白，結果同樣表明，與CTR組相比，MET可以顯著增加Bmp2b、Bmp4相關蛋白標識物的表達量(圖5B)，這表明MET對Bmp信號通路的促進作用不僅可以發(fā)生在胚胎的早期發(fā)育階段，還可以持續(xù)到晚期。

本研究還進一步檢測了骨質疏松模型中Bmp信號成員的基因表達和蛋白表達水平變化。在FAC誘導的體外骨質疏松模型中，對不同組別進行反轉錄及PCR擴增、特異片段，通過對電泳條帶及條帶灰度進行分析(圖5：C，D)，發(fā)現(xiàn)FAC組表達量顯著下降，約為對照組的10%，MET組與FAC組相比有顯著升高，修復效果接近對照組水平，且明顯高于陽性對照組。不僅如此，在MTZ誘導的斑馬魚體內骨質疏松模型中，Bmp2b和Bmp4的蛋白表達水平變化與體外誘導骨質疏松模型mRNA變化趨勢相似，MET可以促進由MTZ引起的Bmp2b、Bmp4表達降低(圖5E)。上述結果表明，不論是體外或是體內誘導的斑馬魚骨質疏松模型，MET通過調控Bmp家族成員的轉錄及蛋白水平變化，進而促進骨骼損傷修復。

BRE (Bmp response element)是Bmp信號的下游響應元件，品系可表征Bmp的信號轉導活性。為了探究MET在mRNA水平對骨骼發(fā)育信號通路的作用，本研究通過原位雜交檢測0.1% MET處理24 hpf后的轉基因胚胎。結果可見，MET對在鰓弓(branchial arch, ba)、腹鰭原基(ventral fin primordium, fb)的表達有明顯促進作用(圖5F)，初步表明MET不僅可以增強Bmp的轉錄和蛋白表達，還可以通過激活Bmp下游信號通路促進斑馬魚骨骼發(fā)育和損傷修復。

3 討論

斑馬魚骨質疏松模型廣泛應用于藥物抗骨質疏松有效成分的篩選[17]，MET作為治療2型糖尿病一線藥物的同時，對癌癥、腫瘤以及某些慢性疾病等具有一定的預防作用[2]。本研究結果表明，二甲雙胍對斑馬魚的硬骨、脊椎骨均有明顯促進作用，同時，對由FAC誘導的體外骨質疏松及MTZ誘導的體內骨質疏松模型均有顯著的修復作用，二甲雙胍可能通過激活Bmp信號通路促進成骨細胞再生從而修復骨骼損傷。

目前，二甲雙胍對骨骼影響的作用機制尚未完全明確，本研究僅對骨骼發(fā)育相關信號通路進行了初步探索，對于該信號通路的下游轉錄因子p-Smad1/5/8是否能在MET作用下被磷酸化入核是本課題組今后需要進一步研究的內容。其次，還可利用成魚尾鰭再生模型和骨質疏松模型探究MET是否對斑馬魚成魚的骨骼發(fā)育及損傷修復也具有相同的作用機制，進一步完善MET對斑馬魚不同魚齡階段的骨骼發(fā)育的影響。此外，由于骨質疏松癥為糖尿病慢性并發(fā)癥之一，兩者之間的關系可能并非簡單的單向影響[30,31]，其相互作用關系也有待今后繼續(xù)探究，后續(xù)的工作中我們將通過糖尿病誘導的骨質疏松模型研究MET對糖尿病引發(fā)的骨損傷修復作用及機理。本研究以治療糖尿病的常用藥物為研究對象，用斑馬魚構建骨質疏松模型，探究二甲雙胍在骨骼發(fā)育及損傷修復的作用及機制，研究結果可為二甲雙胍老藥新用提出了新的研究方向和思路。

圖5 MET對斑馬魚成骨的促進及損傷修復的作用機制

A：24 hpf骨骼相關信號通路基因的mRNA水平表達；B：Bmp2b、Bmp4蛋白相對表達量；C：、基因擴增電泳圖；D：對C中電泳條帶的灰度分析；E：Bmp2b、Bmp4蛋白相對表達量；F：表達胚胎背面觀。CTR：空白對照組；FAC：枸櫞酸鐵銨誘導組；Holf：Holfreter水陰性對照組；MTZ：甲硝唑誘導組；ED：依替膦酸二鈉恢復組；MET：二甲雙胍處理組。ba：鰓弓；fb：腹鰭原基。與CTR組比較，#表示<0.05，##表示<0.01，###表示<0.001；與CTR組(B圖)或FAC組(D圖)或MTZ組(E圖)比較，*表示<0.05，**表示<0.01，***表示<0.001。

[1] Pernicova I, Korbonits M. Metformin—mode of action and clinical implications for diabetes and cancer., 2014, 10(3): 143–156.

[2] Aroda VR, Knowler WC, Crandall JP, Perreault L, Edelstein SL, Jeffries SL, Molitch ME, Pi-Sunyer X, Darwin C, Heckman-Stoddard BM, Temprosa M, Kahn SE, Nathan DM Diabetes Prevention Program Research Group. Metformin for diabetes prevention: insights gained from the diabetes prevention program/diabetes prevention program outcomes study., 2017, 60(9): 1601–1611.

[3] Flory J, Lipska K. Metformin in 2019., 2019, 321(19): 1926–1927.

[4] Hostalek U, Gwilt M, Hildemann S. Therapeutic use of metformin in prediabetes and diabetes prevention., 2015, 75(10): 1071–1094.

[5] Heckman-Stoddard BM, DeCensi A, Sahasrabuddhe VV, Ford LG. Repurposing metformin for the prevention of cancer and cancer recurrence., 2017, 60(9): 1639–1647.

[6] Wang GX, Xu MQ, Xie MR. Research advance in anti-lung cancer mechanism of metformin., 2020, 23(4): 282–285.

王高祥, 徐美青, 解明然. 二甲雙胍抗肺癌機制研究進展. 中國肺癌雜志, 2020, 23(04): 282–285.

[7] McCreight LJ, Bailey CJ, Pearson ER. Metformin and the gastrointestinal tract., 2016, 59(3): 426–435.

[8] Inzucchi SE, Davies MJ, Khunti K, Trivedi P, George JT, Zwiener I, Johansen OE, Sattar N. Empagliflozin treatment effects across categories of baseline HbA1c, body weight and blood pressure as an add-on to metformin in patients with type 2 diabetes., 2021, 23(2): 425–433.

[9] Ouyang J, Isnard S, Lin J, Fombuena B, Peng XR, Chen YK, Routy JP. GDF-15 as a weight watcher for diabetic and non-diabetic people treated with metformin., 2020, 11: 581839.

[10] Zeng XL, Zhang YF, Tian Q, Xue Y, An RF. Effects of metformin on pregnancy outcomes in women with polycystic ovary syndrome: a meta-analysis., 2016, 95(36): e4526.

[11] Lv ZQ, Guo YJ. Metformin and its benefits for various diseases., 2020, 11: 191.

[12] Dziedzic A, Saluk-Bijak J, Miller E, Bijak M. Metformin as a potential agent in the treatment of multiple sclerosis., 2020, 21(17): 5957.

[13] Chen XY, Guo HF, Qiu L, Zhang CD, Deng Q, Leng QB. Immunomodulatory and antiviral activity of metformin and its potential implications in treating coronavirus disease 2019 and lung injury., 2020, 11: 2056.

[14] 柏華, 宋璇婧. 二甲雙胍臨床應用現(xiàn)狀及進展. 臨床合理用藥雜志, 2019, 12(16): 175–177.

[15] Li N, Felber K, Elks P, Croucher P, Roehl HH. Tracking gene expression during zebrafish osteoblast differentiation., 2009, 238(2): 459–466.

[16] Fu SQ, Wang ZY, Jiang ZM, Bi ZM, Liu EH. Integration of zebrafish model and network pharmacology to explore possible action mechanisms of morinda officinalis for treating osteoporosis., 2020, 17(5): e2000056.

[17] Bergen DJM, Kague E, Hammond CL. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds., 2019, 10: 6.

[18] Peng W, Zhang WJ, Xue Y. Research progress of zebrafish models of bone diseases., 2019, 27(2): 248–253.

彭偉, 張文娟, 薛鈺. 斑馬魚作為骨骼疾病模型的研究進展. 中國實驗動物學報, 2019, 27(2): 248–253.

[19] Zhang WJ, Xu JJ, Qiu JH, Xing CC, Li XM, Leng B, Su Y, Lin JM, Lin JF, Mei XQ, Huang YQ, Pan YT, Xue Y. Novel and rapid osteoporosis model established in zebrafish using high iron stress., 2018, 496(2): 654–660.

[20] Xu JJ, Zhang WJ, Wang JY, Yao LY, Pan YT, Ou YX, Xue Y. The active component screening ofand the functional study on inhibition of melanogenesis in zebrafish., 2017, 39(12): 1178–1187.

許璟瑾, 張文娟, 王靜怡, 姚麗云, 潘裕添, 歐一新, 薛鈺. 金線蓮抑制斑馬魚黑色素形成的活性組分篩選及機理研究. 遺傳, 2017, 39(12): 1178–1187.

[21] Aceto J, Nourizadeh-Lillabadi R, Bradamante S, Maier JA, Alestrom P, van Loon JJ, Muller M. Effects of microgravitysimulation on zebrafish transcriptomes and bone physiology- exposure starting at 5 days post fertilization., 2016, 2: 16010.

[22] Huo L, Wang L, Yang ZY, Li PY, Geng DC, Xu YZ. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotypes via focal adhesion signaling pathway in zebrafish larvae., 2018, 7(7): bio029405.

[23] Huang HX, Lin H, Lan F, Wu YF, Yang ZG, Zhang JJ. Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis chemical screening., 2018, 1(1): 53–61.

[24] Xue Y. Organizer-drived Bmp signal is required for zebrafish embryonic dorsoventral pattering[Dissertation]Tsinghua University, 2014.

薛鈺. 斑馬魚胚胎組織中心表達的Bmp信號在背腹分化中的作用[學位論文].清華大學, 2014.

[25] Yang J, Tong GX, Zhang XH, Sun ZP, Lv WH, Sun XW, Kuang YY. Comparative analysis of embryonic muscle development in wildtype zebrafish and its intermuscular bone deficiency mutant., 2019, 26(2): 296–303.

楊建, 佟廣香, 鄭先虎, 孫志鵬, 呂偉華, 孫效文, 匡友誼. 肌間刺缺失突變對斑馬魚胚胎發(fā)育過程中肌肉發(fā)育的影響. 中國水產科學, 2019, 26(2): 296–303.

[26] Chen SJ, Guo FJ. Progress research on mechanism of chondrogenic promotion by Sox9 gene., 2010, 31(2): 65–67.

陳少堅, 郭風勁. Sox9基因促軟骨形成作用機制研究進展. 國際骨科學雜志, 2010, 31(2): 65–67.

[27] Lin ZW, Yang F, Huang TY, Chen TT, Cui J, Li MY, Hua YQ. Study on the anti-osteoporosis effect of paeoniflorin on osteoblast apoptosis and zebrafish osteoporosis model., 2019, 35(4): 426–431.

林紫微, 楊菲, 黃天一, 陳婷婷, 崔杰, 李夢雨, 華永慶. 芍藥苷干預成骨細胞凋亡抗骨質疏松作用研究. 南京中醫(yī)藥大學學報, 2019, 35(4): 426–431.

[28] Wan M, Cao X. BMP signaling in skeletal development., 2005, 328(3): 651–657.

[29] Singh SP, Holdway JE, Poss KD. Regeneration of amputated zebrafish fin rays fromosteoblasts., 2012, 22(4): 879-886.

[30] Crandall JP, Knowler WC, Kahn SE, Marrero D, Florez JC, Bray GA, Haffner SM, Hoskin M, Nathan DM; Diabetes Prevention Program Research Group. The prevention of type 2 diabetes., 2008, 4(7): 382–93.

[31] Lecka-Czernik B. Safety of anti-diabetic therapies on bone., 2013, 11(1): 49–58.

Study on the mechanism of me tformin on zebrafish skeletal development and damage repair

Tingting Jia1, Lei Lei1, Xinyuan Wu1, Shunyou Cai2, Yixuan Chen1, Yu Xue1

Metformin (MET) is a well-known first-line drug used to treat diabetes. However, its therapeutic effect and the underlying mechanism in treatment of skeletal diseases are still unclear. In this study, we used the zebrafish osteoporosis model to explore the function and mechanism of metformin in zebrafish bone development and damage repair through fluorescence observation, bone staining, semi-quantitative PCR,hybridizationand ELISA assays. Firstly, the working concentration of MET was determined to be 0.1% through embryonic lethality, bone mineralization and calcification. At this concentration, MET enhanced the bone development of zebrafish embryos and juveniles through up-regulation of bone regulatory factors at the mRNA and protein levels. Furthermore, we used ferric ammonium citrate (FAC) and NTR/MTZ system to build zebrafish osteoporosis modelsand, followed by MET treatment, and the experimental results showed that MET can restore the osteoporotic phenotypes, such as the decreased bone mineralization area, reduced spine calcification, and weakened osteogenic differentiation induced by FAC or MTZ, and it functioned through promoting osteoblast regeneration, enhancing the expression of osteoblast markers (, ALP), and inhibiting the activities of osteoclast markers (,,TRAP). Finally, we detected the expression levels of Bmp signaling components, and our preliminary data showed that MET can not only enhance the transcriptional and protein expression levels of Bmp, but also promote zebrafish bone development and damage repair by activating Bmp downstream signaling. Taken together, our results show that in addition to treating diabetes, MET can also promote zebrafish bone development and has a significant repair effect on osteoporosis, which will provide new research directions and experimental support for the new applications of old drugs.

metformin (MET); zebrafish; osteoporosis; damage rapair; Bmp

2021-07-13;

2021-09-13;

2021-12-03

福建省自然科學基金面上項目(編號：2020J01823，2019J01744)，閩南師范大學培育項目(編號：MSPY202101)和福建省教育廳中青年教師教育科研項目(編號：JAT190357)資助[Supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province (Nos. 2020J01823, 2019J01744), Minnan Normal University Cultivation Project (No. MSPY202101) and Educational Research Project for Young and Middle-aged Teachers of Fujian Provincial Department of Education (No. JAT190357)]

賈婷婷，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：化學生物學。E-mail: 948450471@qq.com

薛鈺，博士，副教授，研究方向：細胞與發(fā)育生物學。E-mail: xueyu0614@163.com

10.16288/j.yczz.21-250

(責任編委: 劉峰)