乙型病毒性肝炎患者血清微小RNA-101、脂肪酸結(jié)合蛋白4 mRNA、脂肪酸結(jié)合蛋白5 mRNA表達(dá)水平與肝纖維化程度的相關(guān)性

譚莉霞，董勇，華靜，魏書堂

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 開封 475000)

乙型病毒性肝炎是常見的傳染性疾病，其發(fā)病率較高[1]。肝纖維化是眾多慢性肝病共有的可逆性病理過程，是慢性活動(dòng)性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)階段[2]。因此，早期評(píng)估和診斷肝纖維化對(duì)預(yù)防肝硬化的發(fā)生有十分重要的意義。目前肝穿刺病理學(xué)檢查是診斷和評(píng)估肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)，但肝穿刺作為一種有創(chuàng)性檢查方式，無(wú)法動(dòng)態(tài)和重復(fù)進(jìn)行，臨床中將其作為常規(guī)檢查較為困難[3]。微小RNA-101(microRNA-101，miR-101)是一種與纖維化疾病有關(guān)的miRNA。王旭天等[4]研究發(fā)現(xiàn)miR-101a水平與乙型肝炎病毒相關(guān)性肝纖維化的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP)是一類同源性較高的細(xì)胞內(nèi)蛋白，對(duì)脂肪酸的親和力較高，主要參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸[5]。FABP4是一種脂肪型FABP，同時(shí)也是FABP家族中最具特征性的成員，可參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程[6]。FABP5是一種表皮型FABP，在腫瘤血管生成的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要作用[7]。本研究前期通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScanHuman(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-101與FABP4、FABP5均存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)FABP4、FABP5也可能參與肝纖維化的進(jìn)展過程。因此，本研究通過探討96例乙型病毒性肝炎患者血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平與肝纖維化程度的相關(guān)性，以期為肝纖維化的評(píng)估和診斷提供新指標(biāo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2020年3月至2021年3月于河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診的96例乙型病毒性肝炎患者，納入乙型肝炎組。選取同期河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康體檢者94例作為對(duì)照組。對(duì)照組年齡36～60(46.83±9.25)歲，乙型肝炎組年齡36～59(46.94±8.76)歲。根據(jù)乙型病毒性肝炎患者肝纖維化程度將其分為S0期(40例)、S1期(28例)、S2期(16例)、S3期(12例)。(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①乙型病毒性肝炎患者經(jīng)穿刺活檢、乙肝五項(xiàng)等綜合檢查確診，符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)且符合肝纖維化分期S0～S3期；②首次發(fā)病，確診前未進(jìn)行抗結(jié)核桿菌及抗乙型肝炎病毒治療；③臨床及影像學(xué)檢查資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并支氣管炎、肺氣腫、支氣管擴(kuò)張以及肺癌等；②伴有藥物性肝病、自身免疫性肝病等影響肝功能指標(biāo)的疾病；③孕婦及哺乳期女性或有嚴(yán)重精神障礙；④合并人類免疫缺陷病毒或其他病毒感染。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。所有受試者簽署知情同意書。收集整理所有受試者性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、年齡、飲酒史、吸煙史、高血壓、高脂血癥等一般資料。

1.2 主要試劑與儀器RNA提取試劑盒(貨號(hào)：NEP017)購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：GOY-C6397)購(gòu)自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司；qPCR SYBR?Green Mix(貨號(hào)：GV357571)購(gòu)自上海一基實(shí)業(yè)有限公司；Rox reference dye(貨號(hào)：BYLP-31110)購(gòu)自南京北魚生物科技有限公司；qRT-PCR儀(型號(hào)：ABI 7700)購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1樣品采集 采集健康體檢者體檢當(dāng)天及乙型病毒性肝炎患者確診后清晨空腹外周靜脈血樣5 mL，以3 000 r·min-1離心15 min(離心半徑15 cm)后收集血清待測(cè)。

1.3.2血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平檢測(cè) 采用RNA提取試劑盒提取各受試者血清總RNA后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)儀擴(kuò)增目的基因miR-101、FABP4、FABP5及其內(nèi)參。qRT-PCR反應(yīng)體系：qPCR SYBR?Green Mix(2×)5 μL，Rox reference dye(50×)0.2 μL，ddH2O 3.0 μL，上下游引物(10 μm)各0.4 μL，cDNA模板(50 mg·L-1)1 μL，引物序列見表1。各樣品均重復(fù)3次，采用2-△△CT法定量分析血清中miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 一般資料乙型肝炎組性別、年齡、BMI、飲酒史、吸煙史、高血壓、高脂血癥與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 乙型肝炎組和對(duì)照組一般資料比較

2.2 血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平乙型肝炎組血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平高于對(duì)照組，miR-101水平低于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 乙型肝炎組和對(duì)照組血清miR-101、FABP4 mRNA、FABP5 mRNA水平比較

2.3 不同肝纖維化分期患者血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平與S0期比較，S3期、S2期、S1期血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平較高，miR-101水平較低(P<0.05)；與S1期比較，S3期、S2期血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平較高，miR-101水平較低(P<0.05)；S3期血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平高于S2期，miR-101水平低于S2期(P<0.05)。見表4。

表4 不同肝纖維化分期患者血清miR-101、FABP4 mRNA、FABP5 mRNA水平比較

2.4 乙型病毒性肝炎患者血清miR-101與FABP4mRNA、FABP5mRNA水平的相關(guān)性Pearson法分析結(jié)果顯示，乙型病毒性肝炎患者血清miR-101與FABP4mRNA、FABP5mRNA水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.524、-0.590，P<0.05)，見圖1和圖2。

2.5 血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平與乙型病毒性肝炎患者肝纖維化程度的相關(guān)性Spearman法分析結(jié)果顯示，乙型病毒性肝炎患者肝纖維化程度與血清FABP4mRNA、FABP5mRNA均呈正相關(guān)(r=0.654、0.723，P<0.05)，與miR-101呈負(fù)相關(guān)(r=-0.861，P<0.05)，見圖3。

miR-101為微小RNA-101；FABP為脂肪酸結(jié)合蛋白。

miR-101為微小RNA-101；FABP為脂肪酸結(jié)合蛋白。

miR-101為微小RNA-101；FABP為脂肪酸結(jié)合蛋白。

3 討論

乙型病毒性肝炎病情發(fā)展緩慢，肝炎癥反應(yīng)明顯，病毒無(wú)法被輕易清除，隨著病情不斷發(fā)展，可能會(huì)出現(xiàn)肝纖維化甚至肝硬化[9]。肝纖維化是肝對(duì)慢性損傷的一種愈合反應(yīng)，各種因素所致的細(xì)胞外基質(zhì)沉積與降解的動(dòng)態(tài)平衡被打破，從而造成肝基質(zhì)成分發(fā)生改變，最終導(dǎo)致肝纖維化[10]。探討肝纖維化相關(guān)診斷和評(píng)估指標(biāo)對(duì)進(jìn)一步深入研究肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及過程、指導(dǎo)研發(fā)新的治療手段有重要意義。

FABP4是聯(lián)系代謝性和炎癥性疾病的重要因子，不僅能調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝，還參與炎癥過程及血管新生[11-12]。FABP5廣泛分布于脂肪組織、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝、腎等多種組織及器官中，且在宮頸癌、肝癌等多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，并具有刺激腫瘤血管生成和促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[13-14]。本研究結(jié)果顯示，乙型病毒性肝炎患者血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平高于健康人群，且血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平隨著肝纖維化分期的增加而上升。這表明血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平的升高可能對(duì)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展有重要提示作用?；诩韧芯恐蠪ABP4、FABP5的作用機(jī)制，推測(cè)在乙型病毒性肝炎患者體內(nèi)持續(xù)的慢性炎癥刺激下，F(xiàn)ABP4、FABP5以及白細(xì)胞介素等因子大量分泌并參與炎癥反應(yīng)，造成肝星形細(xì)胞活化，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和重塑平衡傾向于細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展。本研究中乙型病毒性肝炎患者血清miR-101與FABP4mRNA、FABP5mRNA水平呈正相關(guān)，與前期生物學(xué)信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果一致。這進(jìn)一步提示miR-101與FABP4mRNA、FABP5mRNA間存在靶向關(guān)系，F(xiàn)ABP4mRNA、FABP5mRNA受miR-101靶向調(diào)控進(jìn)而參與肝纖維化進(jìn)展。miR-101與FABP4mRNA、FABP5mRNA表達(dá)水平均能反映肝纖維化程度，為評(píng)估肝纖維化提供可靠依據(jù)。但目前關(guān)于FABP4mRNA、FABP5mRNA與肝纖維化程度相關(guān)性的研究較少，且本研究中FABP4mRNA、FABP5mRNA表達(dá)水平可能受其他因素的影響，今后仍需更多的研究數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平與乙型病毒性肝炎患者肝纖維化程度密切相關(guān)，對(duì)肝纖維化的早期評(píng)估有一定的參考價(jià)值。臨床可通過監(jiān)測(cè)血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA全面評(píng)估患者肝纖維化程度，積極調(diào)整用藥及臨床治療方式，改善患者肝功能，提高疾病治療效果。這進(jìn)一步提示血清學(xué)指標(biāo)對(duì)于評(píng)估肝功能和肝纖維化程度有潛在應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步探討和推廣。但本研究年限較短且樣本量有限，其結(jié)果尚需延長(zhǎng)研究年限、擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。