氧氣輔助濕熱預(yù)處理對玉米秸稈酒精發(fā)酵的影響

張強(qiáng)，陳詩陽

（長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022）

隨著全球能源危機(jī)的不斷加劇，生物質(zhì)能源的研究引起了人們極大的興趣。利用地球上成本低廉、數(shù)量巨大的玉米秸稈等纖維質(zhì)原料生產(chǎn)燃料酒精的研究備受關(guān)注。玉米秸稈主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，它們通過化學(xué)鍵連接成牢固的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對相關(guān)的降解酶類具有較強(qiáng)的抗性，導(dǎo)致纖維素酶水解效率低下，因此秸稈酒精發(fā)酵首先要進(jìn)行預(yù)處理。目前秸稈類物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理的方法大致可分為物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法及生物法。作為氧化劑，氧在堿性條件下可被還原為氧離子自由基（·O）以及羥基自由基（·OH）等，這些衍生的活性基團(tuán)對木質(zhì)素中常見的雙鍵、芳香環(huán)等基團(tuán)有較強(qiáng)的反應(yīng)性，能夠選擇性地氧化降解生物質(zhì)中的木質(zhì)素，并且?guī)缀醪挥绊懤w維素，因此在秸稈預(yù)處理過程中起著重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)是在丹麥瑞素國家實(shí)驗(yàn)室所做的玉米秸稈濕熱預(yù)處理實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行的，195℃、15min被認(rèn)為是玉米秸稈最佳濕熱預(yù)處理?xiàng)l件。本文在此基礎(chǔ)上，加入氧氣設(shè)置三種不同預(yù)處理?xiàng)l件，即條件1 （195℃，15min）、條件2 （195℃，15min，12bar O，1bar=0.1MPa）和條件3 （195℃，15min，12bar O，2g/L NaCO）對玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理，對比氧氣輔助預(yù)處理后玉米秸稈中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量變化以及纖維素酶解葡萄糖收率，并對預(yù)處理后抑制劑對酒精發(fā)酵的影響進(jìn)行研究，以期為纖維質(zhì)原料預(yù)處理及酒精發(fā)酵技術(shù)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 玉米秸稈

玉米秸稈首先經(jīng)過氣流干燥，然后粉碎并篩分成1mm備用。

1.2 氧氣輔助濕熱預(yù)處理實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用丹麥瑞素國家實(shí)驗(yàn)室2L 環(huán)型高壓容器進(jìn)行。取60g處理好的玉米秸稈加入1L水，按照設(shè)置條件進(jìn)行濕熱預(yù)處理實(shí)驗(yàn)，然后將處理液過濾為固體濾餅及水解液兩部分。

1.3 原料玉米秸稈及預(yù)處理后固體濾餅組成分析

首先稱取0.16g 樣品，用1.5mL 72% HSO于30℃水解1h，然后加42mL 蒸餾水及標(biāo)準(zhǔn)樣品，121℃水解1h 過濾，糖的含量可由HPLC 測得，固體殘留物經(jīng)過干燥及稱重可計(jì)算出木質(zhì)素的含量。

1.4 預(yù)處理后水解液成分分析

濕熱預(yù)處理后所得的水解液用80g/L HSO在121℃下水解10min，糖的含量（葡萄糖及木糖等）可由HPLC測得。

1.5 纖維素酶解葡萄糖實(shí)驗(yàn)

首先將預(yù)處理后干燥的原料粉碎，稱取110mg樣品加入0.2mol/L檸檬酸緩沖溶液（pH=4.8），加入纖維素酶（L）30FPU/DM（干重），50℃反應(yīng)24h，水解后樣品于4000r/min離心10min。

纖維素酶解葡萄糖收率（ECC）計(jì)算如式(1)。

式中，為酶水解后的D?葡萄糖濃度，g/L；為總體積，L；為酶水解之前纖維素的質(zhì)量，g。

1.6 同步糖化發(fā)酵（SSF）實(shí)驗(yàn)

預(yù)處理后的玉米秸稈固體部分與水解液的質(zhì)量比為8%（水解液預(yù)先用5mol/L NaOH 調(diào)整到pH 4.8）。首先在50℃進(jìn)行24h預(yù)水解，加酶量10FPU/g（秸稈干重），然后再加入纖維素酶20FPU/g，同時(shí)加入0.2g 干酵母和0.2mL（24%）尿素，發(fā)酵在32℃進(jìn)行。發(fā)酵完成后發(fā)酵液于3000r/min 離心處理10min，酒精濃度、糠醛及乙酸等抑制劑皆通過HPLC進(jìn)行檢測，結(jié)果為三次實(shí)驗(yàn)平均值。

1.7 液相色譜（HPLC）分析

色譜柱為Aminex HPX?87H （BIO?RAD），溫度63℃，流動相為4mmol/L HSO，流速0.6mL/min，檢測器為日本Shimadzu公司生產(chǎn)。

1.8 計(jì)算

纖維素及半纖維素的回收率計(jì)算如式(2)、式(3)。

2 結(jié)果和討論

2.1 不同加氧預(yù)處理?xiàng)l件對玉米秸稈組分的影響

采用上述三種條件對玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理后分為固體濾餅與水解液兩部分。纖維素主要存在于固體濾餅中，而半纖維素主要存在于水解液中，化學(xué)組成發(fā)生了明顯變化。從表1 和圖1 可見，與原料玉米秸稈相比，玉米秸稈經(jīng)過三種條件預(yù)處理后，固體濾餅中主要為纖維素，而半纖維素含量明顯減少。固體濾餅中纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為55.9%、74.7%和73.3%，半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.5%、7.1%和4.9%，而木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為25.2%、17.5%和13.7%。水解液中纖維素含量較低，半纖維素含量較高。經(jīng)計(jì)算，預(yù)處理后纖維素總體收率分別為91.2%、94.6%和95.9%，而半纖維素總體收率分別為74.5%、50.3%和68.2%。從以上數(shù)據(jù)分析中可知，3種預(yù)處理?xiàng)l件下，纖維素收率都比較高，平均在90%以上，而且纖維素絕大部分都保留在固體中，表明加氧預(yù)處理對纖維素收率影響不大。但是預(yù)處理過程中堿液NaCO能夠削弱纖維素和半纖維素之間的氫鍵及皂化半纖維素和木質(zhì)素分子之間的酯鍵，對纖維素起緩沖保護(hù)作用形成堿化纖維素，導(dǎo)致纖維素溶脹不易被破壞。另外與使用強(qiáng)堿性物質(zhì)NaOH 等相比，NaCO能夠減少對環(huán)境和設(shè)備傷害和腐蝕，也能改善微生物發(fā)酵效果，因此經(jīng)過條件3預(yù)處理獲得了更高的纖維素收率。而半纖維素收率變化較大，主要由于大部分半纖維素發(fā)生了溶解或降解，O的加入促進(jìn)了半纖維素的溶出，所以經(jīng)過預(yù)處理?xiàng)l件2 和條件3 后半纖維素?zé)o論從固體濾餅中的含量還是從總收率來看都低于條件1。

表1 預(yù)處理后玉米秸稈化學(xué)組成（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）單位：%

圖1 不同預(yù)處理?xiàng)l件下固體濾餅中各部分組成

木質(zhì)素是由苯丙素類單體構(gòu)成的無定形態(tài)高聚物，結(jié)構(gòu)中包含大量苯環(huán)、雙鍵等不飽和結(jié)構(gòu)。在條件1濕熱預(yù)處理過程中，半纖維素發(fā)生脫乙?；磻?yīng)，形成乙酸等酸性物，導(dǎo)致半纖維素的酸性降解和水解。由于弱酸處理不能有效脫除木質(zhì)素，因而濕熱預(yù)處理后玉米秸稈的木質(zhì)素相對含量較高，木質(zhì)素殘留量達(dá)到25.2%。氧在反應(yīng)過程中產(chǎn)生的氧離子自由基（·O）以及羥基自由基（·OH）等能夠?qū)δ举|(zhì)素中的雙鍵、芳香環(huán)等基團(tuán)有較強(qiáng)的反應(yīng)性，從而造成木質(zhì)素和木聚糖的共價(jià)連接被破壞而成為水溶性成分，而且較高的氧氣壓力更有效，能夠明顯提高木質(zhì)素的分解速率，所以經(jīng)過有氧預(yù)處理能夠明顯降低木質(zhì)素含量。加入堿性物質(zhì)NaCO能使木質(zhì)素中的酚羥基和烯醇基變?yōu)楦谢钚缘姆欲}和烯酮鹽，能夠加快氧的反應(yīng)速度，促進(jìn)木質(zhì)素降解，因此采用預(yù)處理?xiàng)l件3后木質(zhì)素最低含量降為13.7%，可見氧氣和堿協(xié)同作用更有利于木質(zhì)素的去除。

2.2 葡萄糖收率

采用葡萄糖收率來評估玉米秸稈預(yù)處理的效果。葡萄糖主要來自于玉米秸稈預(yù)處理后固體濾餅中纖維素的酶解，另外預(yù)處理過程中纖維素降解也會產(chǎn)生少量的葡萄糖。纖維素酶水解纖維素生成葡萄糖是生產(chǎn)酒精的關(guān)鍵。從圖2 可以看出，經(jīng)過條件3 處理后的葡萄糖總收率達(dá)到73.5%，高于經(jīng)條件1 和條件2 處理的69.4%和72.1%。其中三種處理?xiàng)l件下的葡萄糖酶解率分別為64.8%、65.8%和67.6%，遠(yuǎn)高于未經(jīng)預(yù)處理的原料玉米秸稈的16.2%?？梢婎A(yù)處理破壞了玉米秸稈的致密結(jié)構(gòu)，提高了纖維素酶的酶解效率，從而獲得了較高的葡萄糖收率。在木質(zhì)纖維素原料中，纖維素降解性能與木質(zhì)素含量密切相關(guān)，纖維素降解性能越好，原料中木質(zhì)素含量越低，主要由于木質(zhì)素可以吸附部分纖維素以及對纖維素酶具有一定的物理屏障作用。因此木質(zhì)素被認(rèn)為是影響纖維素酶水解的主要障礙，消除或減弱木質(zhì)素的阻礙作用是提高纖維素水解效率的關(guān)鍵，因此經(jīng)過條件3處理后獲得了最高的葡萄糖收率。

圖2 不同預(yù)處理?xiàng)l件下葡萄糖收率

2.3 抑制劑對酒精發(fā)酵的影響

玉米秸稈在濕熱預(yù)處理過程中主要產(chǎn)生了兩類抑制劑：一類是以糠醛為代表的醛類抑制劑，主要由己糖和戊糖在酸性環(huán)境下脫水生成；另一類是以乙酸為代表的羧酸類抑制劑，乙酸由半纖維素脫乙酰生成。本研究主要測定了三種預(yù)處理?xiàng)l件下水解液中糠醛和乙酸的含量，見表2。從表2 中可以看出，由于O的加入促進(jìn)了半纖維素的溶出，半纖維素發(fā)生脫乙?；磻?yīng)會形成乙酸等酸性物質(zhì)，所以采用加氧預(yù)處理后乙酸的含量會有較為明顯的升高。從圖3可知，隨著發(fā)酵進(jìn)行，乙酸濃度緩慢增加，主要因?yàn)樗褂玫尼劸平湍钢泻猩倭咳樗峋?，代謝部分木糖會產(chǎn)生少量乙酸，通過酸化作用使細(xì)胞生長受到抑制。通常乙酸濃度達(dá)到2g/L可引起菌體數(shù)量下降，達(dá)到4g/L 可引起酒精產(chǎn)量下降，但較低的濃度則不會對發(fā)酵產(chǎn)生明顯的影響。糠醛主要由己糖和戊糖在酸性環(huán)境下脫水生成，所以采用加氧預(yù)處理后酸性條件下糠醛的含量也會有較為明顯的增加。醛類化合物主要會抑制酵母生長，使發(fā)酵過程出現(xiàn)遲滯期?？啡舛纫话氵_(dá)到1g/L 會對酵母產(chǎn)生抑制作用，另外酵母菌也能夠代謝或降解部分糠醛等物質(zhì)，利用遲滯期進(jìn)行脫毒作用，所以從圖3中看到，隨著發(fā)酵進(jìn)行，糠醛濃度會逐漸降低。

圖3 發(fā)酵過程中抑制劑濃度的變化

表2 水解液中主要抑制劑的組成

采用釀酒酵母對濕熱處理后的玉米秸稈固體與水解液混合液（底物濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%）進(jìn)行同步糖化發(fā)酵（SSF）實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以原料玉米秸稈作為對照，結(jié)果如圖4。從圖4 可知，142h 發(fā)酵，經(jīng)過條件3處理的玉米秸稈酒精產(chǎn)量達(dá)到25.0g/L，高于條件1和條件2下的17.2g/L和24.3g/L，而原料玉米秸稈酒精濃度僅為4.2g/L。另外從圖4 也可以看到，經(jīng)過加氧預(yù)處理的玉米秸稈發(fā)酵液在4h 左右會出現(xiàn)由于醛類物質(zhì)作用短暫出現(xiàn)的遲滯期，由于發(fā)酵液中糠醛濃度均較低，所以抑制作用并不明顯，隨后酒精濃度迅速增加，經(jīng)過條件3處理的玉米秸稈酒精發(fā)酵液最終獲得了25.0g/L 的最高酒精產(chǎn)量。

圖4 發(fā)酵過程中酒精濃度變化

3 結(jié)論

采用三種不同氧氣輔助濕熱預(yù)處理?xiàng)l件處理玉米秸稈：條件1（195℃，15min），條件2（195℃，15min，12bar O），條件3（195℃，15min，12bar O，2g/L NaCO）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過條件3 處理的玉米秸稈纖維素收率和葡萄糖收率最高，分別為95.9%和73.5%，并且利用釀酒酵母，在底物濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%時(shí)，經(jīng)過142h發(fā)酵，獲得最高酒精濃度25.0g/L，發(fā)酵過程沒有明顯的抑制作用發(fā)生。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氧氣輔助濕熱預(yù)處理玉米秸稈過程中，氧氣主要與木質(zhì)素發(fā)生反應(yīng)，降低了木質(zhì)素含量，尤其與堿性物質(zhì)碳酸鈉（NaCO）結(jié)合，有效提高了纖維素收率和纖維素酶解效率，最終獲得了較高的酒精收率，而且發(fā)酵過程中沒有明顯的抑制作用發(fā)生。