中毒案件中滇烏頭堿鑒定1 例

范先煜，王鑫，向平，劉偉，趙君博

司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063

1 案 例

1.1 簡(jiǎn)要案情

某日，7 名人員在某酒店用餐飲酒過程中出現(xiàn)不同程度的頭暈、嘔吐癥狀，懷疑食物中毒。經(jīng)辦案民警調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，所涉及人員均飲用過某不明藥酒，藥酒中含有烏頭樣植物塊莖。當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)監(jiān)督管理局提供現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)的剩余藥酒（棕色液體，1 號(hào)檢材）及塊莖浸泡液（2 號(hào)檢材）送本鑒定中心進(jìn)行檢驗(yàn)鑒定。

1.2 毒物分析

1.2.1 主要儀器與試劑

UltimateTM3000 標(biāo)準(zhǔn)二元系統(tǒng)-LTQ Orbitrap XL 線性離子阱軌道阱高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher 公 司），AcQuityTMUltra Performance LC 超高效液相色譜（美國Waters 公司）-4000 Q Trap LC-MS/MS 三重四級(jí)桿離子阱質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司），TDZ4-WS 低速臺(tái)式離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司），Milli-Q Advantage A10 超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore 公司），Vortex-Genie2 渦旋振蕩器（美國Scientific Industries 公司），DK-S22 雙孔恒溫水預(yù)鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

甲醇、乙腈為色譜純，購自美國Sigma-Aldrich 公司；乙酸銨、甲酸、氫氧化鈉為色譜純，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；烏頭堿和滇烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2.2 色譜-質(zhì)譜條件

1.2.2.1 超高效液相色譜-線性離子阱靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography/linear ion trap orbitrap mass spectrometer，UPLC/LTQ Orbitrap MS）條件

采用電噴霧離子源，在正離子模式下，全掃描及自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜掃描（Full MS/dd-MS2）。噴霧電壓為3.5 kV，毛細(xì)管和噴霧溫度分別為325 ℃和300 ℃，“Tube lens”電壓為60 V，鞘氣（N2）壓力為40 Arb，輔助氣（N2）壓力為18 Arb，采集范圍為50～1 000，一級(jí)及二級(jí)質(zhì)譜分辨率分別為60 000 和30 000，碰撞池能量為35 eV。

色譜柱為Allure PFPP 柱（100 mm×2.1 mm，5 μm；美國RESTEK 公司）。流動(dòng)相B 為70%的乙腈，流動(dòng)相A 為30%的20 mmol/L 乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈），流速0.25 mL/min。

1.2.2.2 LC-MS/MS 條件

采用電噴霧離子源，在正離子模式下，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)定性分析。離子噴射電壓為5 500 V，離子源溫度為500 ℃。氮?dú)庾鳛榕鲎矚?，氣簾?0 psi，霧化氣40 psi，輔助氣50 psi。

色譜柱為Capcell Pak C18 MGⅡ（250 mm×2.0 mm，5 μm；日本Osaka Soda 公司）。流動(dòng)相B 為70%的乙腈，流動(dòng)相A 為30%的20 mmol/L 乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈），流速0.2 mL/min。

1.2.3 樣品前處理

取液體1 mL 于離心管中，加入1 mL pH 為9.2 的硼砂緩沖溶液，渦旋振蕩3 min，再加入3 mL 乙醚，以1 650×g離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，于50 ℃ DK-S22 雙孔恒溫水預(yù)鍋中揮干，用200 μL 流動(dòng)相A 復(fù)溶，并用流動(dòng)相A 稀釋10 000 倍和100 倍，分別進(jìn)行LC-MS/MS 和UPLC/LTQ Orbitrap MS 分析。

1.2.4 檢驗(yàn)結(jié)果

首先使用LC-MS/MS 法對(duì)45 種常見有毒生物堿[1]進(jìn)行篩選。分析結(jié)果顯示，1 號(hào)和2 號(hào)檢材中未檢出烏頭堿等45 種常見有毒生物堿，均在烏頭堿的兩個(gè)離子對(duì)通道內(nèi)出現(xiàn)色譜峰（646.4>586.1，646.4>526.2，保留時(shí)間3.57 min），但對(duì)烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，該色譜峰保留時(shí)間、離子對(duì)豐度比與烏頭堿均不一致。鑒于案情高度指向中毒，推測(cè)檢材中可能含有篩選目標(biāo)化合物以外的有毒生物堿。

再使用UPLC/LTQ Orbitrap MS “Full MS/dd-MS2”模式對(duì)2份檢材進(jìn)行篩選分析，2份檢材均在10.7 min左右出現(xiàn)色譜峰（圖1）。其一級(jí)質(zhì)譜圖中，質(zhì)荷比m/z660.336 7 為基峰，根據(jù)準(zhǔn)確分子質(zhì)量計(jì)算，推測(cè)其元素組成可能為C35H50NO11。其二級(jí)質(zhì)譜圖中的特征碎片離子主要為600.317 4、568.291 4 和550.280 6。結(jié)合一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用Chemspider 化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（www.chemspider.com）進(jìn)行檢索，匹配結(jié)果顯示，本研究得到可疑峰的一級(jí)質(zhì)譜高分辨數(shù)據(jù)及二級(jí)質(zhì)譜特征碎片離子（即裂解規(guī)律）與滇烏頭堿相吻合。因此，初步推測(cè)兩種檢材中可能含有滇烏頭堿。

圖1 離子流色譜圖（m/z 660.336 7）Fig.1 Extracted ion chromatograms（m/z 660.336 7）

滇烏頭堿的元素組成、準(zhǔn)確分子質(zhì)量及相對(duì)偏差見表1。為進(jìn)一步確證檢材中是否含有滇烏頭堿，首先利用UPLC/LTQ Orbitrap MS “Full MS/dd-MS2模式”對(duì)滇烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，所得一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜特征碎片離子和豐度比與1號(hào)、2號(hào)檢材一致（圖2）。同時(shí)，利用LC-MS/MS 分析空白樣品、滇烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品、1 號(hào)檢材、2 號(hào)檢材，結(jié)果表明，空白樣品無干擾，1 號(hào)、2 號(hào)檢材中出現(xiàn)滇烏頭堿的特征色譜峰（特征離子對(duì)m/z660.3>600.3，660.3>568.3），色譜保留時(shí)間和特征碎片離子豐度比均匹配（圖3）。綜合分析得知，1 號(hào)、2 號(hào)檢材中均含有滇烏頭堿。

圖2 10.7 min 左右色譜峰對(duì)應(yīng)的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 The primary and secondary mass spectra around 10.7 min

圖3 滇烏頭堿的LC-MS/MS 色譜圖Fig.3 LC-MS/MS chromatograms of Yunaconitine

2 討論

我國烏頭屬植物有200 多種，主要產(chǎn)于西南地區(qū)[2]。大多數(shù)烏頭屬植物中所含有的主要毒性成分為二萜生物堿，具有強(qiáng)烈的心臟毒性和神經(jīng)毒性[3]，因此，誤服烏頭造成的中毒案件時(shí)有發(fā)生[4]。烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿為烏頭屬植物所主要含有的有毒生物堿成分，因此在對(duì)該類中毒案件的分析鑒定中，常以此作為目標(biāo)成分[3]。滇烏頭堿為云南產(chǎn)烏頭屬植物和藏藥康定烏頭中的主要生物堿成分，與烏頭堿型生物堿結(jié)構(gòu)的區(qū)別在于C14酯基，滇烏頭堿型生物堿具有C14茴香?；鵀躅^堿型生物堿為C14苯甲?；?，但兩者毒性相似[3,5]。研究[6]表明，滇烏頭堿能夠抑制心肌細(xì)胞的活性，破壞心肌細(xì)胞生物膜的穩(wěn)定性，從而對(duì)心臟產(chǎn)生毒性作用，進(jìn)一步的毒理機(jī)制有待深入研究。本案例提示，在對(duì)烏頭屬植物中毒案件進(jìn)行鑒定時(shí)應(yīng)考慮滇烏頭堿型生物堿的存在，以免漏檢。

傳統(tǒng)的LC-MS/MS 法通常是對(duì)一定范圍內(nèi)已知目標(biāo)物的篩選、定性與定量分析，在對(duì)未知毒（藥）物篩查時(shí)有一定的局限性。而在實(shí)際案件中則經(jīng)常遇到對(duì)未知檢材中未知毒（藥）物進(jìn)行篩選鑒定，因此，傳統(tǒng)的LC-MS/MS 不能滿足分析鑒定要求時(shí)，高靈敏度和高選擇性的UPLC/LTQ Orbitrap MS[7]通過色譜保留時(shí)間、準(zhǔn)確分子質(zhì)量、同位素豐度比、一級(jí)和多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及已有的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫等，可實(shí)現(xiàn)對(duì)未知毒（藥）物的鑒定[8-9]。