呋喃酚葡萄糖醛酸結(jié)合物在呋喃丹染毒家兔體內(nèi)的死后分布及死后再分布

文巖，韓昱哲，龔鐸，解文凱，呂晨曦，孟宇珍，張潮，尉志文，贠克明

1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.太原市公安局萬柏林分局，山西 太原 030001

呋喃丹是一種氨基甲酸酯類農(nóng)藥，中高毒性，主要通過呼吸道、消化道吸收入體，在體內(nèi)可以與膽堿酯酶可逆性地結(jié)合，產(chǎn)生類膽堿能樣反應(yīng)[1]。呋喃丹還可作為干擾劑影響生物體內(nèi)生殖激素及其他內(nèi)分泌激素分泌水平[2]。呋喃丹入體后在肝細(xì)胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）催化下發(fā)生Ⅰ相代謝反應(yīng)，生成呋喃酚（carbofuran-7-phenol，7PH）、3-羥基呋喃丹（3-hydroxy carbofuran）、3-酮基呋喃丹（3-keto carbofuran）等Ⅰ相代謝產(chǎn)物[3-4]。7PH 等Ⅰ相代謝物又會(huì)與內(nèi)源性葡萄糖醛酸及硫酸等物質(zhì)結(jié)合，生成Ⅱ相代謝產(chǎn)物，通過腎排出體外[4-5]。呋喃酚葡萄糖醛酸結(jié)合物（carbofuran-7-phenyl glucuronic acid，Glu-7PH）是呋喃丹的Ⅱ相代謝物[6]。

呋喃丹常見于自殺或投毒案件[7-8]，在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中有時(shí)需要對(duì)呋喃丹是生前服毒還是死后染毒進(jìn)行鑒定，而法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)是解決毒物生前或死后入體難題的重要手段。目前，關(guān)于呋喃丹的研究主要集中在特異性生物降解菌株的篩選鑒定和對(duì)環(huán)境中呋喃丹原體及代謝物新型檢測手段的建立上[9-10]，本課題組前期已經(jīng)建立了生物檢材中Glu-7PH 的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）檢測法[11]。本研究擬建立呋喃丹灌胃染毒的家兔動(dòng)物模型，觀察呋喃丹不同染毒劑量下Glu-7PH 在大鼠體內(nèi)的死后分布及死后再分布特點(diǎn)，為呋喃丹中毒案件的檢材采集和法醫(yī)學(xué)鑒定提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜串聯(lián) 6460 Triple Quad MS/MS（美國Agilent 公司），ET3301 全自動(dòng)氮吹濃縮儀[歐陸科儀（遠(yuǎn)東）有限公司]，Vortex-Genie 2 渦旋振蕩器（美國Scientific Industries 公司），SC-3610 低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），A10 Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

乙腈（色譜純，美國Sigma-Aldich 公司），甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），Glu-7PH標(biāo)準(zhǔn)品（上海美迪西生物醫(yī)藥股份有限公司）。超純水由A10 Milli-Q 超純水系統(tǒng)制得，10%呋喃丹懸浮種衣劑（臨汾海蘭實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 儀器分析條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX HILIC Plus（4.6 mm×100 mm，3.5 μm，美國Agilent 公司），柱溫20 ℃；流動(dòng)相A 相為水，B 相為乙腈（含0.1%甲酸溶液）；梯度洗脫0 min 時(shí)V水∶V乙腈=20∶80，5 min 內(nèi)梯度遞增至V水∶V乙腈=40∶60，保持1 min 后，2 min 內(nèi)梯度遞減至V水∶V乙腈=20∶80；掃描時(shí)間為8 min；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI）采用負(fù)離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，Glu-7PH 母離子m/z339，碎裂能量94 V；子離子m/z163，碰撞池能量（collision energy，CE）28 V；定量子離子m/z113，CE 10 V。

1.3 樣品處理

移取心血1 mL 或稱取器官組織1 g，加入1 mL水、6 mL 乙腈，渦旋混勻1 min，4 ℃放置20 min 后，4 472×g離心20 min，取上清液于45 ℃下氮?dú)獯蹈桑?00 μL 水復(fù)溶，0.2 μm 水溶性膜過濾后進(jìn)樣。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

王穎等[11]對(duì)本方法的檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantitation，LOQ）、工作曲線、精密度和回收率進(jìn)行了驗(yàn)證。心血、肝組織中Glu-7PH 的LOD 分別為10.00、9.93 ng/mL。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康家兔44 只，雌雄不限，體質(zhì)量（2.5±0.2）kg，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（晉）2015-0003]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)2019LL097），按照國家衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》執(zhí)行。

1.5.1 死后分布模型

健康家兔24 只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（18 只，每劑量點(diǎn)6 只）和對(duì)照組（6 只，每劑量點(diǎn)2 只）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前禁食12 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)組按1/2 LD50（3.75 mg/kg）、LD50（7.5 mg/kg）、2LD50（15 mg/kg）劑量灌胃給藥[12-13]，對(duì)照組按等質(zhì)量生理鹽水灌胃。觀察動(dòng)物表現(xiàn)，記錄死亡時(shí)間。待呼吸停止、心臟停搏后立即取心血、心肌、肝、脾、肺、腎、腦、右下肢肌肉，灌胃后2 h 仍未死亡的家兔以二氧化碳（CO2）吸入處死后立即解剖取材。-20 ℃冰箱內(nèi)保存待檢驗(yàn)。

1.5.2 死后再分布模型

健康家兔20 只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（15 只，每時(shí)間點(diǎn)3 只）和對(duì)照組（5 只，每時(shí)間點(diǎn)1 只）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前禁食12 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)組以4LD50（30 mg/kg）劑量灌胃給藥，對(duì)照組以等質(zhì)量生理鹽水灌胃。分別于動(dòng)物呼吸停止、心臟停搏后0、12、24、48、72 h 取心血、心、肝、脾、肺、腎、腦、右下肢肌肉，-20 ℃冰箱內(nèi)保存待檢驗(yàn)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 軟件（美國IBM 公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，并進(jìn)行方差齊性和正態(tài)分布檢驗(yàn)。若數(shù)據(jù)方差齊且符合正態(tài)分布則采用單因素方差分析，Dunnett’s T3 法進(jìn)行兩兩比較；若數(shù)據(jù)方差不齊或不符合正態(tài)分布，則采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 中毒癥狀

家兔灌胃后出現(xiàn)流涎、反胃、抽搐、大小便失禁、瞳孔縮小等反應(yīng)。1/2LD50 劑量組家兔在給藥后2 h均未死亡，LD50 劑量組家兔有2 只在給藥后2 h 未死亡，2LD50 和4LD50 劑量組家兔灌藥后均死亡。2LD50 劑量組染毒家兔死亡時(shí)間為（2.0±0.5）h，4LD50 劑量組染毒家兔死亡時(shí)間為（19.7±5.9）min。

2.2 死后分布

經(jīng)檢驗(yàn)，部分組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊，數(shù)據(jù)處理采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonferroni 法。從表1 可見，1/2LD50 劑量組脾中未檢測到Glu-7PH，各組織不同劑量下Glu-7PH的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。相同劑量下不同組織間Glu-7PH 含量采用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較，1/2LD50 劑量組中心血-腎、心肌-腎、肺-腎的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LD50 劑量組中心血-腎、腦-腎、脾-腎的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；2LD50 劑量組中腦-肝、腦-腎、右下肢肌肉-腎的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其他組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。從表2 可見，4LD50 劑量組0 h 各組織中Glu-7PH 的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 Glu-7PH 在不同劑量組家兔體內(nèi)各器官的死后分布Tab.1 Postmortem distributions of Glu-7PH in different organs of rabbits from different groups（n=6，）

表1 Glu-7PH 在不同劑量組家兔體內(nèi)各器官的死后分布Tab.1 Postmortem distributions of Glu-7PH in different organs of rabbits from different groups（n=6，）

注：1）與腎組織相比，P<0.05；2）與腦組織相比，P<0.05?！?”表示未檢出Glu-7PH。

2.3 死后再分布

由于部分組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊，數(shù)據(jù)處理采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonfer?roni法。表2可見，心血、心肌、脾、腎、腦及右下肢肌肉中各時(shí)間點(diǎn)的Glu-7PH含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。肝和肺中各時(shí)間點(diǎn)Glu-7PH的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），肝中Glu-7PH在72 h和12 h的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），12 h含量升高，72 h含量降低；其他組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。對(duì)照組的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本中均未檢出Glu-7PH。

表2 Glu-7PH 在4LD50 組家兔體內(nèi)各器官的死后再分布Tab.2 Postmortem redistribution of Glu-7PH in different organs of rabbits from the 4LD50 group（n=3，）

表2 Glu-7PH 在4LD50 組家兔體內(nèi)各器官的死后再分布Tab.2 Postmortem redistribution of Glu-7PH in different organs of rabbits from the 4LD50 group（n=3，）

注：1）與72 h 相比，P<0.05。

3 討論

3.1 動(dòng)物模型

據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道，體外兔肝微粒體對(duì)呋喃丹轉(zhuǎn)化效率接近于人。因此，本研究以家兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過灌胃染毒方式模擬呋喃丹毒物經(jīng)胃入體。同時(shí)，采用群體動(dòng)物模型有利于消除動(dòng)物個(gè)體差異帶來的影響。本研究中，家兔呋喃丹灌胃后出現(xiàn)了流涎、反胃、抽搐、大小便失禁、瞳孔縮小等反應(yīng)，中毒癥狀與人中毒表現(xiàn)[15-17]相似。

3.2 死后分布

呋喃丹化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，可降解產(chǎn)生呋喃酚[18-19]，有學(xué)者[20-21]對(duì)呋喃丹及其Ⅰ相代謝物呋喃酚在動(dòng)物體內(nèi)的分布進(jìn)行研究。呋喃酚既是呋喃丹的代謝產(chǎn)物又是呋喃丹的降解產(chǎn)物，因此不宜作為呋喃丹生前入體的中毒標(biāo)志物。肝中與內(nèi)源性葡萄糖醛酸結(jié)合生成的Ⅱ相代謝物說明呋喃丹入體后經(jīng)過了體內(nèi)代謝，可作為呋喃丹生前入體的生物標(biāo)志物。因此，本研究選擇呋喃酚的Ⅱ相代謝物Glu-7PH 研究其性質(zhì)和法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)特征，驗(yàn)證其是否可作為呋喃丹生前入體生物標(biāo)志物。

本研究中，除1/2LD50 劑量組脾未檢測到Glu-7PH 外，余各劑量組組織器官均檢出Glu-7PH。1/2 LD50 和LD50 劑量組中Glu-7PH 在腎中含量高于心血，這與呋喃丹和呋喃酚在犬和大鼠心血和腎中的死后分布不同，呋喃酚在犬和大鼠心血中含量高于腎[20]。呋喃丹在大鼠體內(nèi)死后分布2LD50 劑量組心血含量高于腎，4LD50 劑量組腎中高于心血，而呋喃丹在犬死后分布4LD50 劑量組心血含量高于腎，由此可見呋喃丹在動(dòng)物體內(nèi)死后分布受中毒劑量和種屬影響[20-21]。Glu-7PH 在動(dòng)物體內(nèi)死后分布是否受中毒劑量和種屬影響，將進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

3.3 死后再分布

死后的藥物濃度不一定反映死亡時(shí)的濃度，這是由于藥物濃度可以隨著取樣位置和死亡到取樣時(shí)間間隔發(fā)生變化，這些位置和時(shí)間依賴性變化稱為死后再分布。死后再分布發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，主要有藥物從蓄積庫釋放而被動(dòng)擴(kuò)散至周圍器官和組織、細(xì)胞自溶和腐敗、藥物的分布容積等因素[22]。

本研究以4LD50 呋喃丹一次性灌胃給藥，檢測了家兔死后72 h 內(nèi)5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)Glu-7PH 在各主要組織器官中的含量。肝、肺中Glu-7PH 含量在各時(shí)間點(diǎn)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），因此，Glu-7PH 在家兔肝、肺中發(fā)生了死后再分布。心血、心肌、脾、腎、腦及右下肢肌肉中各時(shí)間點(diǎn)的Glu-7PH 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此認(rèn)為Glu-7PH 在以上組織中沒有發(fā)生死后再分布。由以上死后再分布結(jié)果可知，在法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中如采用肝和肺作為分析檢材需要考慮到死后再分布的影響，而心血作為尸檢常規(guī)和必取檢材，未發(fā)生死后再分布，可作為Glu-7PH 檢測的最佳檢材。

本研究結(jié)果提示，在家兔心血、心肌、肝、肺、腎、腦及右下肢肌肉均檢測到Glu-7PH，在呋喃丹中毒案件中可通過以上組織中檢測到Glu-7PH 作為呋喃丹入體的證據(jù)。由于家兔肝和肺中Glu-7PH 存在死后再分布現(xiàn)象，因此，在檢材提取時(shí)應(yīng)注意檢材提取時(shí)間以及提取部位對(duì)檢測結(jié)果的影響；心血在72 h 內(nèi)不發(fā)生死后再分布，是法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的最優(yōu)檢材，肝和肺中的檢驗(yàn)結(jié)果需結(jié)合心血結(jié)果進(jìn)行分析。