電子煙油和毛發(fā)中合成大麻素CUMYL-PEGACLONE 的檢測

焦臺(tái)風(fēng)，李亞慶，康剛，陳深樹，程良紅

廣東南天司法鑒定所，廣東 深圳 518003

近幾年，我國禁毒部門持續(xù)推進(jìn)專項(xiàng)行動(dòng)，加之疫情影響，我國呈現(xiàn)吸毒人數(shù)減少、規(guī)?；贫净顒?dòng)減少、國內(nèi)繳毒總量減少的積極變化，冰毒、海洛因、氯胺酮等3 類主流毒品濫用治理成效顯現(xiàn)。吸毒者為尋求替代品滿足毒癮，交叉濫用非慣用毒品形勢日趨嚴(yán)峻[1-3]，其中以合成大麻素為代表的新精神活性物質(zhì)（new psychoactive substance，NPS）是這類非慣用毒品的典型代替物。合成大麻素類物質(zhì)是一類人工合成物質(zhì)，具有與四氫大麻酚（△9-tetrahydrocan?nabinol，△9-THC）類似的生理、藥理作用和激動(dòng)大麻素受體的能力，吸食后能產(chǎn)生和傳統(tǒng)大麻同樣甚至更強(qiáng)烈的欣快感[4-6]，由于合成大麻素類物質(zhì)成本更低，更易獲取，現(xiàn)已成為NPS 中涵蓋物質(zhì)種類最多、濫用最為嚴(yán)重的家族。

自2021 年7 月1 日我國將合成大麻素類物質(zhì)整類列管以來，市面上販賣和吸食含有合成大麻素電子煙油的情況雖有好轉(zhuǎn)但仍屢見不鮮。國內(nèi)已報(bào)道合成大麻素的檢測方法主要有傅里葉變換紅外光譜法（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[9]和超高效液相色譜-四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography series quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLCQTOF-MS）[10]等，對新出現(xiàn)的合成大麻素則大多是經(jīng)制備液相分離后綜合采用FTIR、GC-MS、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等多技術(shù)聯(lián)合進(jìn)行結(jié)構(gòu)剖析[11-12]。合成大麻素類NPS 的鑒定是當(dāng)前法醫(yī)毒物實(shí)驗(yàn)室工作的重要需求，5-戊基-2-（2-苯基丙-2-基）-2,5-二氫-1H-吡啶[4，3-b]吲哚-1-酮（5-pentyl-2-（2-phenylpropan-2-yl）-2,5-dihydro-1Hpyrido[4,3-b] indol-1-one，CUMYL-PEGACLONE）屬于吲哚類新型合成大麻素，是一種大麻素受體強(qiáng)效激動(dòng)劑[13-14]，本研究旨在建立聯(lián)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）和GC-MS 快速測定毛發(fā)和電子煙油中合成大麻素 CUMYLPEGACLONE 的方法，并應(yīng)用于實(shí)際案例。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1290 Infinity II 液相色譜-6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（美國Agilent 公司），7890B 氣相色譜-5977B MSD 系統(tǒng)（美國Agilent 公司），Ultra PFPP 液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μm；美國Restek 公司），J&W GC 柱（DB-5MS；30 m×0.25 mm，0.25 μm；美國Agilent 公司），Milli-Q?Integral 系統(tǒng)（美國Millipore公司），MS-Hunter 工作站（美國Agilent 公司），AUW220D 型分析天平（日本Shimadzu 公司），Centri?fuge 5430 高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司），KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），P1000L 移液器、P200L 移液器、P20L 移液器（美國Gilson 公司），JXMF-12 型毛發(fā)研磨粉碎儀[雷萌生物科技（上海）有限公司]，Nonsterile 13 mm Millex?微孔濾膜（0.22 μm，美國Millipore 公司）。

CUMYL-PEGACLONE（5-戊基-2-（2-苯基丙-2-基）-2，5-二氫-1H-吡啶[4，3-b]吲哚-1-酮）標(biāo)準(zhǔn)對照品（上海原思標(biāo)物科技有限公司），甲氧那明標(biāo)準(zhǔn)對照品（中國食品藥品檢定研究院），甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck 公司），蟻酸、乙酸銨（色譜純，北京百靈威科技有限公司），丙酮（分析純，廣州化學(xué)試劑），實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q?Integral 系統(tǒng)制得的超純水。

1.2 檢測方法

1.2.1 GC-MS

色譜條件：J&W GC柱；初始溫度60 ℃，以15 ℃/min升溫至310 ℃，保持15 min；載氣He；柱流量1 mL/min；分流比為20∶1；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（electron impact，EI）離子源，電子能量為70 eV；進(jìn)樣口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；全掃描模式，m/z40～500。

1.2.2 HPLC-MS/MS

色譜條件：Ultra PFPP液相色譜柱；室溫；流動(dòng)相A為乙腈，B 為20 mmol/L 乙酸銨和0.1%蟻酸緩沖液；流動(dòng)相洗脫梯度程序?yàn)?～1 min，5%B；1～2 min，20%B；2～3 min，5%B；流速350 μL/min，進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）正離子模式，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（multiple re?action monitoring，MRM）模式，加熱氣流速10 L/min，離子源電壓5 500 V，接口溫度300 ℃，碰撞氣、氣簾氣、霧化氣及輔助氣均為高純氮?dú)?。?yōu)化CUMYLPEGACLONE 的MRM 參 數(shù)，取1 μg/mL 的CUMYLPEGACLONE 標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣進(jìn)行母離子掃描，獲取其母離子，將母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離分析得到二級全掃描質(zhì)譜特征子離子，選取豐度最大的子離子后，使用MS-Hunter 工作站自動(dòng)完成MRM 參數(shù)的優(yōu)化。

采用MS-Hunter 工作站采集數(shù)據(jù)和控制系統(tǒng)。

1.3 檢材及其前處理

對深圳市公安局某禁毒大隊(duì)抓獲的15 例涉毒嫌疑人毛發(fā)及繳獲的含合成大麻素電子煙油約70 g進(jìn)行檢測?？瞻酌l(fā)采自本實(shí)驗(yàn)室工作人員（男性，32 歲，無吸毒史），空白電子煙油來自深圳市某辦案機(jī)關(guān)送檢的電子煙油（未檢出毒品成分）。

毛發(fā)檢材：毛發(fā)檢材依次用適量的超純水和丙酮振蕩清洗2次，晾干后剪成長1～2 mm，置冷凍研磨儀中粉碎，準(zhǔn)確稱取毛發(fā)粉末20 mg（±0.1 mg），加入1 mL 內(nèi)標(biāo)甲氧那明標(biāo)準(zhǔn)工作液（1 ng/mL），冰水浴超聲15 min，離心后取上清液于60 ℃水浴氮吹吹干，殘留物用100 μL甲醇復(fù)溶，供HPLC-MS/MS分析。

電子煙油檢材：稱取電子煙油約10 mg，置于15 mL一次性微量離心管中，加入10 mL甲醇，旋渦混勻15 s，超聲萃取20 min，冷卻至室溫，高速離心后上清液通過Nonsterile 13 mm Millex?微孔濾膜，用甲醇稀釋后，轉(zhuǎn)移1 mL 至樣品瓶，供GC-MS 和HPLC-MS/MS分析。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.4.1 線性、檢出限和定量限

分別稱取20 mg 空白毛發(fā)和10 mg 電子煙油添加CUMYL-PEGACLONE 標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成2、4、8、16、30 和50 ng/mL 的加標(biāo)樣品，使用HPLC-MS/MS 分析，根據(jù)CUMYL-PEGACLONE 的保留時(shí)間和碎片離子定性，以色譜峰面積進(jìn)行定量，以3 倍信噪比（signalnoise，S/N）對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限（limit of detection，LOD），以S/N=10 作為方法的定量限（limit of quantitation，LOQ）。以CUMYL-PEGACLONE 的色譜峰峰面積（y）對進(jìn)樣質(zhì)量濃度（x，ng/mL）進(jìn)行回歸計(jì)算，繪制對應(yīng)基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線。

1.4.2 精密度和準(zhǔn)確度

按毛發(fā)和電子煙油基質(zhì)中CUMYL-PEGACLONE的線性范圍選取包括LOQ 在內(nèi)的低、中、高3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，分別取毛發(fā)基質(zhì)0.02、0.04、0.25 ng/mg（對應(yīng)上機(jī)質(zhì)量濃度4、8、50 ng/mL），電子煙油基質(zhì)2、8、50 ng/mL，按優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件，每個(gè)添加水平做6 次平行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)測定5 d，考察日內(nèi)精密度、日間精密度及準(zhǔn)確度。

1.4.3 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）是液相色譜-質(zhì)譜法分析時(shí)存在的一個(gè)非常明顯的現(xiàn)象，是由于樣品基質(zhì)、樣品前處理過程、色譜分離效果、流動(dòng)相和離子化等因素造成的離子增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，從而影響目標(biāo)物的定量檢測。基質(zhì)效應(yīng)的公式ME=(Km/Ks-1)×100中，ME 是空白基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率（Km）與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（Ks）之差，與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比值，當(dāng)|ME|小于20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)|ME|為20%～50%時(shí)為中等基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)|ME|大于50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[15]。分別在毛發(fā)和電子煙油基質(zhì)中選取包括LOQ 在內(nèi)的3 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，按1.3節(jié)方法處理后采用HPLC-MS/MS 測得的峰面積（S1），對應(yīng)的空白基質(zhì)樣品按照1.3 節(jié)處理后加入相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液用HPLC-MS/MS 測得的峰面積（S2），以S1/S2計(jì)算提取回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS 檢測結(jié)果

使用GC-MS 分析電子煙油，總離子流圖見圖1，保留時(shí)間15 min 之前出峰明顯，7890B 氣相色譜-5977B MSD 系統(tǒng)自帶的美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）譜庫檢索結(jié)果為乙二醇、丙三醇和不同聚合度的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG），推斷可能是煙油中的基質(zhì)；在保留時(shí)間為17.75 min 處出現(xiàn)可疑色譜峰（圖2），特征離子碎片為m/z91、179、197、254和372，7890B 氣相色譜-5977B MSD 系統(tǒng)自帶的NIST 譜庫檢索無匹配結(jié)果。經(jīng)《新精神活性物質(zhì)分析手冊：質(zhì)譜分冊》[16]中質(zhì)譜分析譜庫檢索與質(zhì)譜特征推測，電子煙油中可能含有CUMYL-PEGACLONE（圖3），在EI 離子源轟擊下，CUMYL-PEGACLONE 可能的裂解途徑見圖4，質(zhì)譜圖中的基峰m/z254 可能是由CUMYL-PEGACLONE 分子離子結(jié)構(gòu)中與吡啶環(huán)上N 原子連接的C-N 鍵斷裂形成，同時(shí)生成m/z119 的苯基丙基碎片離子；碎片離子m/z254 進(jìn)一步丟失戊基碎片形成碎片離子m/z197，m/z119 碎片離子丟失C2H4+形成碎片離子m/z91。將質(zhì)譜圖與CUMYL-PEGACLONE 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對比，保留時(shí)間和特征離子碎片離子豐度均一致。

圖1 電子煙油檢材的GC-MS 總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion flow diagram of electronic cigarette oil

圖2 保留時(shí)間為17.75 min 的可疑色譜峰Fig.2 The suspicious chromatographic peak with retention time of 17.75 min

圖3 CUMYL-PEGACLONE 的GC-MS 及化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.3 GC-MS and chemical structure of CUMYLPEGACLONE

圖4 EI源下CUMYL-PEGACLONE 的主要碎裂途徑Fig.4 The main cleavage pathways of CUMYLPEGACLONE under EI ion source

2.2 HPLC-MS/MS 檢測結(jié)果

進(jìn)樣體積是高效液相色譜柱產(chǎn)生溶劑效應(yīng)的重要影響因素，為盡量減少溶劑效應(yīng)保證定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究對進(jìn)樣體積進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果（圖5）表明，選用4種進(jìn)樣體積均可以實(shí)現(xiàn)有效分離，目標(biāo)物色譜峰未出現(xiàn)向前遷移或色譜峰分叉現(xiàn)象，綜合考慮響應(yīng)和峰形，最終選取的進(jìn)樣體積為5 μL。對CUMYLPEGACLONE的MRM參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，一級離子掃描得到母離子m/z373.2，將m/z373.2進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)得到二級全掃描質(zhì)譜特征子離子，選取離子豐度相對較大的m/z255.1、m/z185.0、m/z119.0 和m/z91.0子離子與m/z373.2組成MRM離子對，通過MS-Hunter工作站優(yōu)化得到的碰撞能量分別為8、48、28和50 V，去簇電壓均為105 V、加速電壓均為4 V。

圖5 不同進(jìn)樣體積下的色譜圖Fig.5 Chromatogram acquired using different injection volumes

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性、檢出限和定量限

CUMYL-PEGACLONE 在空白基質(zhì)、毛發(fā)基質(zhì)和電子煙油基質(zhì)中2～50 ng/mL 與色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，毛發(fā)中CUMYL-PEGACLONE 的方法檢出限為0.01 ng/mg，定量限為0.02 ng/mg；電子煙油中CUMYL-PEGACLONE的方法檢出限為1 ng/mg，定量限為2 ng/mg（表1）。

表1 不同基質(zhì)中CUMYL-PEGACLONE 的線性范圍、線性方程、檢出限和定量限Tab.1 Linear ranges，linear equations，limits of detection and limit of quantitation of CUMYL-PEGACLONE in different matrices

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)、回收率、精密度和準(zhǔn)確度

CUMYL-PEGACLONE 在毛發(fā)基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)值為-33.8%，存在中等強(qiáng)度離子抑制現(xiàn)象，而電子煙油基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)值為5.8%，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。據(jù)文獻(xiàn)[17]報(bào)道，在毛發(fā)基質(zhì)中合成大麻素存在離子抑制現(xiàn)象，且目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)受濃度影響較大，濃度越低越容易受到離子抑制影響。CUMYLPEGACLONE 在毛發(fā)中含量較低且毛發(fā)基質(zhì)相對復(fù)雜導(dǎo)致出現(xiàn)離子抑制現(xiàn)象，而在電子煙油中，基質(zhì)大多為乙二醇、丙三醇和聚乙二醇等相對單一的小分子，在同等離子化效率下，受基質(zhì)效應(yīng)影響較小。

CUMYL-PEGACLONE 在不同基質(zhì)中的回收率和精密度見表2。在各自的加標(biāo)濃度下，毛發(fā)基質(zhì)中CUMYL-PEGACLONE的提取回收率為98.2%～132.4%，日內(nèi)精密度為1.2%～12.9%，連續(xù)測定5 d 日間精密度為1.3%～6.1%；電子煙油基質(zhì)中提取回收率為93.5%～110.6%，日內(nèi)精密度為0.8%～1.5%，日間精密度0.7%～2.9%，準(zhǔn)確度和精密度滿足法醫(yī)毒物測定要求。

表2 CUMYL-PEGACLONE 的回收率、精密度、準(zhǔn)確度和基質(zhì)效應(yīng)Tab.2 Recovery，precision，accuracy and matrix effect of CUMYL-PEGACLONE （%）

2.4 案例應(yīng)用

經(jīng)檢測，送檢的15 名涉毒人員毛發(fā)中均檢出CUMYL-PEGACLONE（表3），除1人低于定量限，另14人毛發(fā)中CUMYL-PEGACLONE 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.035～0.563 ng/mg；2 份電子煙油中CUMYL-PEGACLONE 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.17%和0.21%。

表3 15 名涉毒人員年齡、性別和毛發(fā)中CUMYL-PEGACLONE 含量Tab.3 Age，gender and the content of CUMYL-PEGACLONG in hair of 15 suspects

3 結(jié)論

本研究以涉毒專案中查獲人員的毛發(fā)和電子煙油為例，在前期沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下利用GC-MS 在EI 源轟擊下生成的碎片離子進(jìn)行裂解途徑推導(dǎo)，結(jié)合文獻(xiàn)資料鎖定目標(biāo)物，后期使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)一步確證，建立了聯(lián)合HPLC-MS/MS 和GC-MS 鑒定電子煙油和毛發(fā)中合成大麻素CUMYL-PEGACLONE 的方法，為辦案機(jī)關(guān)快速偵辦涉毒專案提供了有力證據(jù)支撐，亦可為今后涉及此類物質(zhì)的鑒定提供參考。