CEACAM5在肺腺癌中的表達(dá)及臨床意義

劉傳 李麗娟 王嶸 湯兵祥

肺癌是一種由支氣管黏膜或腺體引發(fā)的常見惡性腫瘤，臨床癥狀表現(xiàn)為干咳、胸痛、氣急等。惡性腫瘤具有侵襲周圍組織和轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官的能力，最終會(huì)導(dǎo)致腫瘤治療失敗[1]。在惡性腫瘤中，肺癌發(fā)病率及死亡率居于首位[2]，且呈上升趨勢(shì)，全球肺癌患者5年生存率為10%-15%，在中國僅5.5%左右[3]，嚴(yán)重危害人類健康。癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子5(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5，CEACAM5)屬于免疫球蛋白CEACAMs家族，有研究證實(shí)CEACAMs家族在惡性腫瘤中有重要的檢測(cè)價(jià)值，比如，CEACAM5 mRNA雙標(biāo)記的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)提示乳腺癌患者預(yù)后不良[4]，食管腺癌患者CEACAM1高表達(dá)[5]。目前關(guān)于CEACAM5基因在肺腺癌中的表達(dá)研究較少，有關(guān)肺腺癌發(fā)生機(jī)制尚不明確，本研究采用免疫組化法檢測(cè)肺腺癌患者中CEACAM5基因表達(dá)情況，并利用Ualcan數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)分析CEACAM5在肺腺癌中的表達(dá)情況以及和預(yù)后的關(guān)系，探究CEACAM5和肺腺癌中的關(guān)系和臨床學(xué)意義，為進(jìn)一步探索肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

一、一般資料

1 經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論后批準(zhǔn)，選擇2016年8月-2017年8月在本院確診為肺腺癌的患者51例，取肺腺癌患者病變肺部組織作為實(shí)驗(yàn)組；從中隨機(jī)選取42例，取癌旁組織作為對(duì)照組。本組所有患者均符合肺腺癌的國際多學(xué)科新分類方案中診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 確診為肺腺癌；② 臨床病理資料完整；③ 無明顯肝腎功能損壞；④ 患者及家屬知情并自愿參加此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 因其他原因中途停止參與者；② 具有惡性腫瘤史及其他部位原發(fā)腫瘤者；③ 曾接受放療、化療、免疫治療。術(shù)后對(duì)所有患者進(jìn)行3年隨訪，每3-6個(gè)月通過電話或門診進(jìn)行隨訪，截至患者死亡或隨訪至2020年2月，期間無失訪案例。

2 主要試劑與儀器

鼠抗人CEACAM5單克隆抗體(貨號(hào)：MAB3848)，艾美捷科技有限公司；SP試劑盒(貨號(hào)：XY-SP-Hu)，上海信裕生物科技公司；DAB顯色劑(貨號(hào)：CTS010)，上海嶸葳達(dá)實(shí)業(yè)有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 取材及免疫組化檢測(cè)

手術(shù)中取受試者的肺腺癌組織和癌旁組織，將肺腺癌組織和癌旁組織均切成2～3微米切片，先用10%福爾馬林溶液固定，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋制成4 μm厚切片備用。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)CEACAM5蛋白表達(dá)水平，染色方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，酒精脫蠟，PBS沖洗3次，梯度酒精水化，然后在枸櫞酸鹽緩沖液(0.01 M，PH6.0)中加熱20 min修復(fù)抗原，PBS沖洗切片3次；晾干后滴加5%山羊血清蛋白孵育30 min；加抗體，4 ℃孵育12 h；復(fù)溫90 min，PBS清洗后加二抗，39 ℃環(huán)境下孵育25 min，然后用PBS清洗3次；(4)采用DAB顯色劑染色，蘇木素復(fù)染、顯色后，自來水沖洗，二甲苯固定3次，每次5 min，風(fēng)干后封片，并將處理好的切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍鏡視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2 染色及判定標(biāo)準(zhǔn)

CEACAM5陽性為細(xì)胞膜以內(nèi)細(xì)胞核以外出現(xiàn)顆粒狀棕黃色，判定標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞染色百分比及染色程度。按染色程度評(píng)分：基本無色(0分)，淺黃色(1分)，深黃色(2分)，褐色(3分)；按陽性細(xì)胞染色百分比評(píng)分：陰性(0分)，25%以下(1分)，25%-50%(2分)，50%以上(3分)。免疫組化評(píng)分(染色程度評(píng)分×陽性細(xì)胞百分率評(píng)分)為最終評(píng)分：≤1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為陽性()，>6分為強(qiáng)陽性()，定義陰性組包含陰性和弱陽性，陽性組包含陽性和強(qiáng)陽性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)數(shù)資料以率表示，行卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)；采用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析肺腺癌中CEACAM5的表達(dá)與性別、年齡、吸煙史之間的關(guān)系以及預(yù)后情況；采用Kaplan-Meier生存曲線對(duì)肺腺癌患者進(jìn)行生存分析，并分析肺腺癌中CEACAM5與CEACAM6、CEACAM1相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料比較

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組性別、年齡、吸煙史、臨床分期等資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)所示。

表1 一般資料比較

二、Ualcan數(shù)據(jù)庫分析CEACAM5在肺腺癌中的表達(dá)

Ualcan數(shù)據(jù)庫顯示，CEACAM5在肺腺癌組織中的表達(dá)高于正常組織(P<0.05)；CEACAM5在正常組織中表達(dá)水平低于患肺腺癌男性患者、女性患者(P<0.05)；CEACAM5在正常組織中表達(dá)水平低于≥41歲的肺腺癌患者(P<0.05)；CEACAM5在正常組織中表達(dá)水平低于肺腺癌各臨床分期的表達(dá)水平(P<0.05)(見圖1)。

三、兩組中CEACAM5的表達(dá)及與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)組CEACAM5陽性表達(dá)率62.75%(32/51)高于對(duì)照組陽性表達(dá)率21.43%(9/42)(χ2=15.950，P<0.001)(見圖2)。其中CEACAM5陽性組在年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、腫瘤大小與陰性組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而陽性組和陰性組性別上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)( 見表2)。

表2 CEACAM5表達(dá)和肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

四、CEACAM5與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)Ualcan數(shù)據(jù)庫分析，肺腺癌CEACAM5高表達(dá)者126例，中低表達(dá)者376例，比較高、低表達(dá)者的遠(yuǎn)期生存狀況，結(jié)果顯示CEACAM5高表達(dá)的肺腺癌患者遠(yuǎn)期生存率與低表達(dá)患者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.53)。見圖3A。而本研究根據(jù)Kaplan-Meier生存曲線分析肺腺癌患者3年生存率，CEACAM5陽性表達(dá)患者生存率50.0%(16/32)低于陰性表達(dá)生存率78.9%(15/19)，兩組比較log-rank值為4.324，P=0.038。見圖3B。同時(shí)經(jīng)COX回歸分析顯示，CEACAM5及臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響肺腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素(見表3)。

圖3 CEACAM5表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

五、CEACAM5與CEACAM6、CEACAM1相關(guān)性分析

應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CEACAM5與CEACAM6、CEACAM1存在明顯的相關(guān)性(r=0.48，0.43，P<0.05)(見圖4)。

圖4 肺腺癌中基因CEACAM5與CEACAM6、

討 論

肺腺癌病情發(fā)展緩慢，惡性程度低，但因?yàn)榇嬖谖⑥D(zhuǎn)移灶，使其向血管和淋巴等轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)時(shí)已是癌癥中晚期[7]。從1965年至今，CEACAM5在各種癌癥中的研究逐漸增多，比如呼吸道、胃腸道以及乳腺腫瘤等，CEACAM5在惡性腫瘤中至關(guān)重要。有研究表明，CEACAM5在腫瘤細(xì)胞分化、增殖過程中起調(diào)節(jié)作用，高表達(dá)CEACAM5使細(xì)胞極性和正常組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，影響細(xì)胞的分化成熟，其抗失調(diào)凋亡的功能，制約著惡性腫瘤的分化和侵襲[8-9]。但CEACAM5和肺腺癌的研究較少，因此探尋CEACAM 5與肺腺癌關(guān)系及發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。

CEACAM5是哺乳動(dòng)物免疫球蛋白家族的糖蛋白之一，通過與同源性蛋白以及異源性蛋白相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞粘著性，對(duì)細(xì)胞識(shí)別有重要作用[10]。馮世兵[10]研究CEACAM5在胃良惡性病變中的表達(dá)時(shí)指出，CEACAM5在正常胃黏膜上皮中不表達(dá)，在胃良性和惡性病變患者的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，且細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)混合表達(dá)增加。此外，CEACAM5在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，分別代表著癌前病變以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，胃癌前病變的標(biāo)志物是膜染色，是良惡性的標(biāo)志[10]。本研究數(shù)據(jù)顯示肺腺癌患者癌組織中CEACAM5陽性率比癌旁組織高，和Ualcan數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果一致，表明CEACAM5可能參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。CEACAM5是人類組織和腫瘤細(xì)胞分化及增殖的重要調(diào)節(jié)分子，CEACAM5 在結(jié)、直腸癌樣本中高表達(dá)，與結(jié)、直腸癌病程進(jìn)展密切相關(guān)，可作為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移早期復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)標(biāo)志[9，11]。CEACAM5表達(dá)量的升高可能說明惡性程度嚴(yán)重、侵襲能力強(qiáng)、轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后性差[12]。有研究比較了乳腺癌治療前后CEACAM5mRNA CT值水平變化與預(yù)后的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)治療后CEACAM5 mRNA降低的患者預(yù)后要優(yōu)于未降低[4]。本研究結(jié)果顯示CEACAM5陽性表達(dá)患者的3年生存率低于陰性患者，同時(shí)經(jīng)COX回歸分析顯示，CEACAM5及臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響肺腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素，提示CEACAM5陽性表達(dá)可能是肺腺癌患者預(yù)后不良的影響因素。而單因素分析顯示年齡及腫瘤大小是影響患者預(yù)后的相關(guān)因素，而經(jīng)多因素分析顯示并非影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素，與虞林湘等[13]研究相似，但也可能受研究對(duì)象較少而影響結(jié)果準(zhǔn)確性，因此仍有待擴(kuò)大樣本進(jìn)一步明確相關(guān)危險(xiǎn)因素。Ualcan數(shù)據(jù)庫分析顯示，CEACAM5高、低表達(dá)患者遠(yuǎn)期生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)楸狙芯侩S訪時(shí)間較短，樣本量較少，從而導(dǎo)致研究結(jié)果存在差異。

CEACAM1是免疫球蛋白超家族成員之一，亦是一種抑制腫瘤的蛋白，通過提升表達(dá)量，維持上皮細(xì)胞正?；蛐?，應(yīng)對(duì)腫瘤病發(fā)[14]。CEACAM1已被證實(shí)參與調(diào)節(jié)接觸依賴性腫瘤免疫反應(yīng)。以往研究表明，CEACAM1在胃癌及口腔癌血管生成中起重要作用。CEACAM1在食管腺癌組織中表達(dá)水平明顯增高,其表達(dá)與食管腺癌患者病理分化與分期及預(yù)后有關(guān),表明CEACAM1可能是食管癌的新靶點(diǎn)[5]。CEACAM6屬于細(xì)胞表面糖蛋白，經(jīng)糖基磷脂酰肌醇固定在細(xì)胞膜上，在致癌因子刺激下，CEACAM6表達(dá)升高，使腫瘤細(xì)胞增殖、活性提高[15]。有研究認(rèn)為CEACAM6腫瘤中高表達(dá)與耐受失巢凋亡現(xiàn)象相關(guān)[16]。Ualcan數(shù)據(jù)庫分析顯示，CEACAM5和CEACAM6、CEACAM1在肺腺癌中均呈正相關(guān)，可能是CEACAM5、CEACAM1、CEACAM6在肺腺癌中有協(xié)同作用，共同參與調(diào)控肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，說明CEACAMs家族在致癌機(jī)制上可能存在一定聯(lián)系；通過進(jìn)一步分析顯示，CEACAMs家族中 CEACAM分子均是連接在細(xì)胞膜上的，其中CEACAM5和CEACAM6以及CEACAM7主要是通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)與細(xì)胞膜連接的，而CEACAM1主要是通過疏水的跨膜結(jié)構(gòu)連接在細(xì)胞膜上的，其配體可能和GPI連接分子的相互作用，或通過CEACAM1的跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)⑿盘?hào)傳入細(xì)胞內(nèi)[17]，但是由于目前關(guān)于各個(gè)分子的生物學(xué)功能是否存在受體復(fù)合體系統(tǒng)目前尚不明確，因此CEA基因家族在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中扮演的角色還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，肺腺癌患者癌組織CEACAM5陽性率高于癌旁組織，CEACAM5與CEACAM6、CEACAM1存在明顯的相關(guān)性，CEACAM5表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后密切相關(guān)，可能是治療肺腺癌的潛在靶點(diǎn)。但是由于肺腺癌發(fā)生機(jī)制尚不清楚，且本研究選取樣本數(shù)量較少，未選取健康對(duì)照及良性病變組進(jìn)行鑒別分析等諸多不足之處，同時(shí)關(guān)于其CEACAM5對(duì)肺腺癌患者的診斷及預(yù)后評(píng)估價(jià)值尚未進(jìn)行分析，導(dǎo)致本研究不能準(zhǔn)確反映CEACAM5與肺腺癌確切關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。