辛伐他汀對(duì)哮喘小鼠細(xì)胞自噬和炎癥的影響及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

黃蘭 蔣振歡 杜月君

近年來(lái)，隨著環(huán)境污染加重及生活壓力增大，哮喘的發(fā)病率和死亡率仍較高,給世界帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，但目前尚無(wú)特定、有效的治療方法[1]。其發(fā)病機(jī)制包括氣道免疫-炎癥、神經(jīng)調(diào)節(jié)等，現(xiàn)大量研究表明細(xì)胞自噬與哮喘氣道炎癥、氣道重塑密切相關(guān)[2-4]。近年來(lái)，大量研究表明辛伐他汀可通過(guò)mTOR信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞自噬，從而治療心血管疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，但辛伐他汀對(duì)哮喘細(xì)胞自噬的調(diào)控及其機(jī)制國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道，故該研究將通過(guò)建立小鼠哮喘模型進(jìn)一步探討辛伐他汀對(duì)哮喘小鼠細(xì)胞自噬和炎癥的影響及其可能的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更新的理論依據(jù)。

資料與方法

一、一般材料

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 共32只6～8周齡雌性BALB/C小鼠，購(gòu)于重慶騰鑫科技公司，體重在15～18 g之間， 于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后體重增加至18～25 g。 所有小鼠均由倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)物品 飼料，卵清蛋白(美國(guó)Sigma公司)，氫氧化鋁(美國(guó)Pierce公司)，辛伐他汀(10 mg/片)，灌胃針，移液槍，試劑盒，抗體。

二、方法

1 動(dòng)物分組 使用隨機(jī)法將32只小鼠分為4組,平均每組8只，分別為正常對(duì)照組(A組)、哮喘模型組(B組)、低劑量辛伐他汀組(C組40 mg/Kg)、高劑量辛伐他汀組(D組60 mg/Kg)。

2 哮喘模型建立 B、C、D三組于第0、7、14天腹腔注射100 ug卵清蛋白(OVA)+2 mg氫氧化鋁致敏，并在第21～60天給予5%水合氯醛瞬時(shí)麻醉后用50 ug OVA滴鼻激發(fā)，每周3次，A組給予等量生理鹽水腹腔注射致敏及滴鼻激發(fā)。

3 給藥方法 自第21天起，C、D兩組激發(fā)前1小時(shí)分別給予辛伐他汀40 mg/kg、60 mg/kg灌胃，每天1次，A、B兩組給予等量生理鹽水灌胃。

4 標(biāo)本獲取 第70天給藥結(jié)束后采取斷頭法處死小鼠后置于手術(shù)臺(tái)，消毒后打開(kāi)胸腔留取左側(cè)肺葉。用鑷子小心分離小鼠左肺葉，從矢狀面切取2mm厚度的中外帶肺組織，迅速置于4%多聚甲醛固定液中浸泡48小時(shí)后用于制備石蠟切片，剩余肺組織置于-80攝氏度冰箱中保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) H.E染色檢測(cè)氣道炎癥及結(jié)構(gòu)變化，Western blot檢測(cè)肺組織自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、自噬信號(hào)通路蛋白t-mTOR、p-mTOR表達(dá)水平，RT-PCR法檢測(cè)自噬相關(guān)基因Atg5 mRNA和Beclin1 mRNA表達(dá)水平。取約100 mg肺組織通過(guò)trizol法充分溶解提取組織總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，之后再以cDNA(互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸)為模板行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物如下，結(jié)果(見(jiàn)表1)。

表1 肺組織引物序列情況

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，模型組與對(duì)照組采用t檢驗(yàn)分析；模型組和兩個(gè)給藥組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊時(shí)多重比較采用LSD法分析，方差不齊時(shí)則采用Games-Howell法分析；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠哮喘發(fā)作癥狀

在哮喘激發(fā)過(guò)程中小鼠均出現(xiàn)哮喘急性發(fā)作表現(xiàn)，呼吸急促，呼吸動(dòng)度增強(qiáng)、煩躁不安、安靜少動(dòng)、嗆咳、打噴嚏。

二、病理學(xué)結(jié)果

A組小鼠肺組織及支氣管均呈正常表現(xiàn)，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管管腔規(guī)則，黏膜上皮、肌層結(jié)構(gòu)正常；B組可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜破壞，基底膜增厚，平滑肌細(xì)胞增殖，杯狀細(xì)胞表達(dá)增加，黏液分泌增加；C、D兩組可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜破壞，杯狀細(xì)胞表達(dá)增加，黏液分泌也有增加，但與B組比較明顯減輕(見(jiàn)圖1)。

圖1 小鼠肺組織病理像

三、自噬相關(guān)基因表達(dá)水平

Western Blot與RT-PCR法分析結(jié)果顯示，與A組比較，B組LC3 Ⅱ/Ⅰ、Atg5 mRNA、Beclin1mRNA表達(dá)水平增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，C、D兩組LC3 Ⅱ/Ⅰ、Atg5 mRNA、Beclin1 mRNA表達(dá)水平增加，D組變化更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖2、表2)。

圖2 小鼠肺組織微管相關(guān)蛋白l輕鏈3(LC3 Ⅱ/Ⅰ)水平變化

表2 各組自噬相關(guān)基因表達(dá)水平

四、信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平

Western Blotting法結(jié)果分析顯示，與A組比較，B組通路蛋白p-mTOR/mTOR表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，C、D兩組p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，D組變化更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖3、4)。

圖3 各組小鼠肺組織自噬信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平

圖4 各組小鼠肺組織自噬信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平

討 論

細(xì)胞自噬是指錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器通過(guò)溶酶體依賴性途徑被降解,該過(guò)程涉及Atg5, Atg7，Atg12, Beclin1等，LC3 II/I比例是檢測(cè)自噬水平高低的金標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。自噬蛋白可能影響程序性細(xì)胞死亡、炎癥、細(xì)胞增殖、先天免疫功能等；同時(shí)，細(xì)胞自噬在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，它為細(xì)胞更新修復(fù)提供原料與營(yíng)養(yǎng)，保持能量穩(wěn)態(tài)[4-5]?，F(xiàn)研究磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT/mTOR)通路是影響細(xì)胞自噬的重要信號(hào)通路之一，PI3K可以通過(guò)其下游分子AKT、mTOR磷酸化調(diào)節(jié)自噬[5-6]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)是一種在進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其包括mTORC1和mTORC1兩種復(fù)合物，它是細(xì)胞內(nèi)的中心信號(hào)調(diào)節(jié)因子，受能量狀態(tài)、氨基酸、生長(zhǎng)因子、激素、氧化應(yīng)激等多種因素調(diào)節(jié)?？傊?，m TOR通路在炎癥、細(xì)胞凋亡、腫瘤等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外， RAS-PKA信號(hào)通路、LKB1-AMPK通路、MAPK-JNK通路也參與了自噬調(diào)節(jié)[7-8]。

哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥疾病，同時(shí)，它也是一種Th2途徑占主導(dǎo)作用的免疫性疾病?，F(xiàn)大量研究表明哮喘氣道炎癥過(guò)程還伴隨細(xì)胞自噬水平增加。通過(guò)電鏡人們發(fā)現(xiàn)哮喘患者成纖維細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞自噬體形成增多[9]。Ban GY等發(fā)現(xiàn)哮喘患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞有較高的自噬水平[10]。研究還發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組小鼠比較，OVA激發(fā)的哮喘組小鼠肺組織自噬蛋白LC3、嗜酸性粒細(xì)胞自噬體顯著增加[11]。該實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果。與A組相比，B組小鼠肺組織中LC3-Ⅱ/Ⅰ、Atg5 mRNA、Beclin1 mRNA表達(dá)水平顯著增加，p-mTOR/t-mTOR通路蛋白表達(dá)降低。近年來(lái)，Suzuki 等[12]發(fā)現(xiàn)敲除自噬基因可誘導(dǎo)哮喘嗜中性粒細(xì)胞氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，牟艷等[13-14]發(fā)現(xiàn)給予自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素處理后小鼠哮喘氣道炎癥得到緩解，可能與自噬水平增加有關(guān)。總之，自噬的激活代表對(duì)氧化應(yīng)激等的一種重要防御反應(yīng)，它通過(guò)先天性和適應(yīng)性免疫，在宿主防御中發(fā)揮多功能作用[7,15]。在肺疾病中，已有研究證明細(xì)胞自噬在一定程度上對(duì)哮喘氣道炎癥具有保護(hù)作用。

辛伐他汀是一種半合成的他汀類降脂藥物，它還可抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗凋亡等，現(xiàn)大量研究表明它還具有自噬調(diào)控作用。在帕金森、阿爾茨海默癥、腦出血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，辛伐他汀可以通過(guò)mTOR信號(hào)通路上調(diào)細(xì)胞自噬從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用[16]；心血管疾病方面，辛伐他汀通過(guò)抑制Rac1-m TOR通路增加細(xì)胞自噬，從而防止冠狀動(dòng)脈肌細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，同時(shí)還可通過(guò)增強(qiáng)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬，減弱脂質(zhì)聚集[17]；現(xiàn)有研究表明辛伐他汀可通過(guò)增強(qiáng)自噬來(lái)改善口腔種植體骨結(jié)合，改善肌營(yíng)養(yǎng)不良患者的生理功能[18-19]。同樣，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立哮喘模型發(fā)現(xiàn)辛伐他汀具有自噬調(diào)控作用，給予辛伐他汀干預(yù)后，小鼠肺組織炎癥、細(xì)胞自噬水平、信號(hào)通路蛋白發(fā)生了重要變化，且與辛伐他汀劑量有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與B組比較，C、D兩組LC3-Ⅱ/Ⅰ、Atg5 mRNA、Beclin1 mRNA表達(dá)進(jìn)一步增加，p-mTOR/t-mTOR通路蛋白表達(dá)降低，且辛伐他汀劑量越大細(xì)胞自噬水平越高，mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)越低，哮喘氣道炎癥緩解越明顯。該研究表明，通過(guò)抑制mTOR通路上調(diào)細(xì)胞自噬，可能是辛伐他汀治療哮喘的潛在機(jī)制之一。

綜上所述，細(xì)胞自噬與哮喘氣道炎癥密切相關(guān)，在一定程度上具有保護(hù)性作用。辛伐他汀通過(guò)mTOR信號(hào)通路調(diào)控自噬可能是其改善哮喘氣道炎癥的機(jī)制之一，但該研究仍存在較多局限性，如動(dòng)物數(shù)量少、對(duì)照組不充分等，需進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步研究。