樟葉越桔根優(yōu)勢內(nèi)生菌對宿主組培苗干旱脅迫生理的影響

安雪菲 羅旭璐 唐軍榮 劉 云 楊曉琴 馬煥成 趙 平

（1. 西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650233；2. 西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650233；3. 云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650233）

內(nèi)生真菌是指在其生活史中的一定階段或全部階段生活在健康植物的組織和器官內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌，具有促進(jìn)宿主生長，提高宿主活性次生代謝產(chǎn)物，增強(qiáng)植物抗病、抗蟲和抗干旱脅迫等能力等功能[1-7]。近年來，內(nèi)生真菌對宿主植物影響的研究，尤其是抗旱方面逐漸成為研究熱點(diǎn)之一[7-8]。劉曉珍等[9]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生葡萄孢菌（Botrytissp.）和球毛殼菌（Chaetomium globosum）有利于菊花（Chrysanthemum morifolium）耐旱性的提高，龔記熠等[10]報(bào)道從野生金釵石斛（Dendrobium nobile）內(nèi)分離出的3種內(nèi)生真菌通過提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）的活性，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸（Pro）和可溶性糖含量，以增強(qiáng)金釵石斛的抗旱能力。鄒暉等[11]發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛（D. officinale）瘤菌根菌屬（Ephlorhzasp.）內(nèi)生真菌可以提高宿主盆栽苗的存活率和抗旱能力。馬碧花等[12]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌通過提高寄主的滲透調(diào)節(jié)和活性氧清除系統(tǒng)進(jìn)而提高寄主的抗旱性，李超等[13]從玉米（Zea mays）及小麥（Triticum aestivum）組織中的4 株內(nèi)生真菌對玉米幼苗的促生作用明顯，并增強(qiáng)玉米幼苗的抗干旱能力。宋方圓[14]從藍(lán)莓根分離得到的1 株座囊菌綱（Dothideomycetes）內(nèi)生菌株能夠顯著提高藍(lán)莓苗的抗旱性。

樟葉越桔（Vaccinium dunalianum）為杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）野生植物，主要分布云南、四川、貴州和西藏等地，其全株具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)等功效[15]。Zhao 等[16]發(fā)現(xiàn)該植物富含咖啡酰熊果苷類物質(zhì)，并先后建立了其組培苗快繁、扦插和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系[17-22]。Fan 等[23]評價(jià)了樟葉越桔葉內(nèi)生真菌的物種多樣性，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)內(nèi)生真菌對白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）等常見農(nóng)作物病原真菌具有較強(qiáng)的拮抗活性[24-25]。羅旭璐[26]發(fā)現(xiàn)傘狀霉科（Umbelopsidaceae）傘狀霉屬（Umbelopsis）二型傘霉（U. dimorpha）為樟葉越桔根部的優(yōu)勢內(nèi)生真菌，徐超等[27]發(fā)現(xiàn)該菌株在提高鐵皮石斛生長速度、抗旱能力等方面的作用效果顯著，推測該菌在樟葉越桔中也具有類似的功能。因此，本研究將樟葉越桔根優(yōu)勢內(nèi)生真菌二型傘霉回接于宿主植物樟葉越桔組培苗中，測定其對宿主組培苗干旱脅迫生理的影響，以期為進(jìn)一步闡明二型傘霉對宿主植物的抗旱分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試菌株為分離鑒定自樟葉越桔根部的優(yōu)勢內(nèi)生真菌二型傘霉[26]，保存于西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。植物材料為1 年生樟葉越桔組培苗[17]。

1.2 儀器和試劑

超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國），ZHWY-211B 恒溫培養(yǎng)振蕩器（常州中誠儀器制造有限公司，中國），HVE-50KB高壓蒸氣滅菌鍋（華粵行儀器有限公司，中國），榮盛GSP 醫(yī)藥專用冰箱（浙江華美冰箱有限公司，中國），ECLIPSE 80i 尼康生物數(shù)碼顯微鏡（尼康儀器有限公司，日本）。瓊脂（上?？蒲派锟萍加邢薰?，中國），分析純冰醋酸、乙醇、氫氧化鉀、濃鹽酸、雙氧水、茚三酮、脯氨酸、丙二醛等（西隴化工股份有限公司，中國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 二型傘霉菌液的制備

將樟葉越桔根部的優(yōu)勢內(nèi)生真菌二型傘霉接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上進(jìn)行活化，用滅菌后的打孔器在菌落邊緣處切取菌餅，接入100 mL 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）中（250 mL錐形瓶），每瓶接入3 個(gè)菌餅，設(shè)置5 個(gè)重復(fù)以避免污染。置于搖床上，在27 ℃、140 r/min 條件下培養(yǎng)7～10 d。

1.3.2 二型傘霉的回接及定殖檢測

用滅菌后的打孔器在二型傘霉活化菌落的邊緣處切取菌餅，埋入樟葉越桔組培苗[17]的根附近，每盆接入3 塊菌餅。用移液槍吸取制備好的菌液澆在樟葉越桔組培苗的根部，每盆接入10 mL菌液，對照組（CK）同時(shí)澆10 mL 未接菌的空白PDB 液體培養(yǎng)基。此后每隔3 d 澆1 次菌液，每次每盆澆10 mL，共接種5 次。15 d 后取樟葉越桔組培苗根系，用自來水沖洗干凈，置入10% KOH水溶液中60 ℃水浴浸泡10～30 min，蒸餾水沖洗3～5 次后用2% HCl 水溶液室溫浸泡10～20 min，蒸餾水沖洗3 次，然后用5% 醋酸墨水染色液60 ℃水浴上進(jìn)行染色10～30 min 后，在蒸餾水中浸泡2～12 h 并保存。挑取處理好的根段置于載玻片中心，滴入1～2 滴蒸餾水，蓋上蓋玻片后置于40 倍顯微鏡下進(jìn)行定殖檢測，觀察到有部分根細(xì)胞仍然保持鮮明的藍(lán)色，表明這些根細(xì)胞受到了真菌菌絲的侵染，二型傘霉成功定殖的樟葉越桔組培苗供后續(xù)試驗(yàn)用。

1.3.3 分組實(shí)驗(yàn)

將接菌和未接菌的樟葉越桔組培苗分別分為2 組（水分正常組和干旱脅迫組），分別為：Ⅰ組（未接菌，未干旱）、Ⅱ組（未接菌，干旱）、Ⅲ組（接菌，未干旱）和Ⅳ組（接菌，干旱）。干旱脅迫處理即從試驗(yàn)的第0 天開始停止?jié)菜?，試?yàn)從干旱脅迫的第1 天開始取樣，每隔3 d 取1 次，取樣時(shí)間為干旱脅迫處理后的第1、5、9、13、17、21 天，每次于固定時(shí)間從植株的相同部位采取葉片用于生理指標(biāo)的測定，同時(shí)同步檢測葉片及土壤的含水率。4 組實(shí)驗(yàn)分別取3 組平行樣品，每組樣品3 個(gè)重復(fù)，樣品采集后保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用，用于測量抗旱生理指標(biāo)。

1.3.4 抗旱生理指標(biāo)測定

SOD 活性采用NBT 核黃素比色法[28]、POD 活性采用愈創(chuàng)木酚比色法[28]、CAT 活性采用鉬酸銨比色法[28]、丙二醛（MDA）含量采用TBA 比色法[28]、可溶性糖含量采用蒽酮比色法[28]、Pro 含量采用茚三酮比色法[29]分別進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱處理對土壤含水率和葉片含水率的影響

由圖1 可知，未干旱脅迫的Ⅰ組和Ⅲ組的土壤含水率較為穩(wěn)定，基本保持在60%左右。干旱脅迫的Ⅱ組和Ⅳ組的土壤含水率則隨著干旱時(shí)間的增加而下降，在干旱的第21 天，接菌的Ⅳ組與未接菌的Ⅱ組的土壤含水率分別為8.64%和7.40%，基本一致。隨著干旱時(shí)間增加的同時(shí)，葉片的含水量也在逐漸下降（圖1b），但Ⅳ組的葉片含水率整體均比Ⅱ組葉片含水率高，在干旱脅迫的第21 天時(shí)，Ⅱ組葉片的含水率為35.56%，而Ⅳ組葉片的含水率則為45.68%，表明二型傘霉有助于樟葉越桔葉片保持水分。

圖1 土壤及葉片含水率隨著干旱時(shí)間的變化Fig. 1 Changes of soil and leaf moisture contents with drought time

2.2 干旱處理對葉片CAT 活性的影響

由圖2a 可知，在水分正常的情況下，Ⅰ組和Ⅲ組組培苗葉片的CAT 活性均呈波動(dòng)狀態(tài)，比較穩(wěn)定，接菌組與未接菌組并無明顯差異，表明二型傘霉在未干旱條件下對葉片CAT 活性沒有明顯的影響。

圖2 干旱處理對組培苗葉片保護(hù)酶活性的影響Fig. 2 Effects of drought treatment on the activities of protective enzymes in tissue cultured seedlings leaves

干旱脅迫下，樟葉越桔組培苗葉片的CAT 活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，未接菌Ⅱ組與接菌Ⅳ組的CAT 活性均在干旱脅迫的第5 天開始上升，從第5 天到第13 天迅速升高，接菌Ⅳ組的CAT 活性均明顯高于未接菌Ⅱ組的活性，在第13 天到達(dá)最大值25.07 U/mL 后逐漸下降，第17天時(shí)CAT 活性下降至13.27 U/mL 后基本保持穩(wěn)定，且明顯高于未干旱組。因此，在干旱脅迫下，二型傘霉有利于組培苗迅速調(diào)節(jié)自身的CAT 活性，起到能夠增強(qiáng)組培苗葉片中CAT 活性的作用。

2.3 干旱處理對葉片POD 活性的影響

如圖2b 所示，在水分正常的情況下，未接菌Ⅰ組和接菌Ⅲ組組培苗葉片的POD 活性均呈波動(dòng)狀態(tài)，相對穩(wěn)定，第Ⅲ組POD 活性波動(dòng)稍大，先上升隨后下降，最終活性相對于起始狀態(tài)的酶活性總體有所增加，從37.22 U/g 上升為48.89 U/g。未接菌Ⅰ組的最終活性相對于起始狀態(tài)的酶活性總體下降，從77.78 U/g 降至51.67 U/g，表明二型傘霉在水分正常的情況下有助于增強(qiáng)POD 的活性。

在干旱脅迫下，未接菌Ⅱ組和接菌Ⅳ組的POD 活性呈現(xiàn)先上升后下降之后整體上升的趨勢。以葉片的含水量（圖1b）作為基線指標(biāo)來比較分析，接菌組與未接菌組的POD 活性波動(dòng)幾乎一致，未接菌Ⅱ組在干旱的第9 天時(shí)，葉片含水量為54.38%，POD 活性為52.78 U/g，位于最低位置并開始上升。而接菌Ⅳ組在干旱的第13 天時(shí)，葉片含水量為55.35%，POD 活性為40.56 U/g，同樣位于最低位置并開始上升。未接菌Ⅱ組在干旱的第13 天時(shí)，葉片含水量為50.35%，POD 活性為79.44 U/g，接菌Ⅳ組在干旱的第17 天時(shí)，葉片含水量為52.63%，POD 活性為76.11 U/g，酶活性提升速度較快。未接菌Ⅱ組在干旱的第17 天時(shí)，葉片含水量為44.38%，POD 活性為98.89 U/g，接菌Ⅳ組在干旱的第21 天時(shí)，葉片含水量為45.68%，POD 活性為127.22 U/g，明顯高于未接菌Ⅱ組。表明在干旱脅迫下，二型傘霉能夠快速且明顯的增強(qiáng)植物中POD 的活性。

2.4 干旱處理對葉片SOD 活性的影響

如圖2c 所示，樟葉越桔組培苗葉片的SOD 活性整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在水分正常的情況下，各取樣同時(shí)點(diǎn)的未接菌Ⅰ組和接菌Ⅲ組組培苗葉片的SOD 活性差別不大，在第21 天時(shí)，接菌Ⅲ組的SOD 活性下降至31.10 U/g，未接菌Ⅰ組下降至29.51 U/g。在干旱脅迫下，在第5 天時(shí)，未接菌Ⅱ組的SOD 活性從第1 d 的51.83 U/g大幅下降到34.44 U/g 的同時(shí)，接菌Ⅳ組的SOD活性從第1 d 的51.36 U/g 略增至57.11 U/g，2 組之間存在明顯差異。除此之外，其余各取樣同時(shí)點(diǎn)的未接菌Ⅱ組和接菌Ⅳ組的SOD 活性差別并無明顯差異，表明在水分正常情況或是干旱條件下，二型傘霉對組培苗葉片的SOD 活性影響不大。

2.5 干旱處理對葉片Pro 含量的影響

如圖3a 所示，在水分正常的情況下，未接菌Ⅰ組Pro 含量的波動(dòng)相對比較穩(wěn)定，接菌Ⅲ組Pro含量的波動(dòng)相對較大，但與未接菌組并無明顯差異，表明二型傘霉對組培苗Pro 含量的影響不大。

圖3 干旱處理對組培苗葉片Pro、MDA 和可溶性糖含量的影響Fig. 3 Effects of drought treatment on the contents of proline, malondialdehyde and soluble sugars in tissue cultured seedlings leaves

干旱脅迫下，樟葉越桔組培苗葉片的Pro 含量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，隨著干旱時(shí)間的不斷增加，從干旱的第5 天到第13 天，未接菌Ⅱ組與接菌Ⅳ組的Pro 含量均迅速升高，未接菌Ⅱ組的Pro 含量由20.10 μg/g 增加至48.45 μg/g，而接菌Ⅳ組的Pro 含量由24.57 μg/g 增加至59.45 μg/g，接菌Ⅳ組Pro 含量的增加速率及增加總量均明顯優(yōu)于未接菌Ⅱ組。在干旱的第13 天時(shí)Pro含量到達(dá)最高點(diǎn)，然后在第13 天到第17 天期間呈現(xiàn)下降趨勢，隨著干旱時(shí)間的繼續(xù)，一直到第21 天，Pro 的含量基本維持穩(wěn)定，此時(shí)，接菌Ⅳ組Pro 含量為35.22 μg/g，未接菌Ⅱ組Pro 含量為27.67 μg/g，明顯看出接菌Ⅳ組的Pro 含量總體上均高于未接菌Ⅱ組，表明在干旱脅迫下，二型傘霉能夠更加快速且明顯的增強(qiáng)組培苗葉片中Pro的含量。

2.6 干旱處理對葉片MDA 含量的影響

如圖3b 所示，在水分正常的情況下，未接菌的Ⅰ組和接菌的Ⅲ組葉片的MDA 含量均呈現(xiàn)相對穩(wěn)定的波動(dòng)狀態(tài)，表明二型傘霉對組培苗葉片MDA 含量的變化影響不大。

在干旱脅迫下，未接菌Ⅱ組和接菌Ⅳ組的MDA 含量前期較為平穩(wěn)，從第9 d 開始略微下降，但在第13 天2 組MDA 含量均迅速上升，接菌Ⅳ組的MDA 含量為51.97 μmol/g，葉片含水量為55.35%，未接菌Ⅱ組的MDA 含量為48.66 μmol/g，葉片含水量為50.35%，接菌組與未接菌組的MDA含量均位于最低值并開始上升。在干旱的第17天，接菌Ⅳ組的葉片含水量為52.63% 時(shí)，MDA含量為72.65 μmol/g，未接菌Ⅱ組的葉片含水量為44.38%時(shí)，MDA 含量為87.06 μmol/g，表明隨著干旱時(shí)間的增加，接菌組與未接菌組植株的MDA 含量均明顯增加。當(dāng)葉片含水量大致相同時(shí)，未接菌組的MDA 含量比接菌組的稍低，但處于干旱狀態(tài)下時(shí)，接菌組MDA 含量的增加比未接菌組的低，在干旱的第17 天時(shí)，接菌干旱組MDA 含量（72.65 μmol/g）低于未接菌未干旱組MDA 含量（75.02 μmol/g），因此植株中的MDA含量波動(dòng)較大，未能呈現(xiàn)很好的規(guī)律性。而接菌后的植株MDA 含量相對較穩(wěn)定，表明接菌能夠幫助植株更好的維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性，有助于增強(qiáng)植物的耐旱能力。

2.7 干旱處理對葉片可溶性糖含量的影響

如圖3c 所示，在水分正常的情況下，未接菌的第Ⅰ組和接菌的第Ⅲ組組培苗的可溶性糖含量均呈現(xiàn)相對穩(wěn)定的波動(dòng)狀態(tài)，總體含量也有所增加，表明在植物正常生長的情況下，接菌和未接菌對植株可溶性糖含量的變化影響不大。

在干旱脅迫下，與MDA 含量的趨勢大致相似，接菌Ⅵ組和未接菌Ⅱ組可溶性糖含量前期較為平穩(wěn)，波動(dòng)不大，但均在干旱脅迫的第13 天開始含量迅速上升。在干旱的第13 天，接菌Ⅵ組可溶性糖的含量為256.06 μmol/g，葉片含水量為55.35%，未接菌Ⅱ組可溶性糖含量為252.70 μmol/g，葉片含水量為50.35%時(shí)，可溶性糖含量的調(diào)控開始響應(yīng)。未接菌組在干旱的第17 天，葉片含水量為44.38%時(shí)，可溶性糖含量為418.40 μmol/g，而接菌組在葉片含水量為45.68% 時(shí)，可溶性糖含量為442.17 μmol/g，表明二型傘霉能夠提高組培苗可溶性糖的調(diào)控響應(yīng)速度，在干旱脅迫下有助于植物體中可溶性糖的累積。以葉片的含水量作為基線指標(biāo)來比較分析，接菌組組培苗的可溶性糖響應(yīng)調(diào)控速度明顯優(yōu)于未接菌組，當(dāng)接菌組的葉片含水量為52.63% 時(shí)，可溶性糖含量為370.27 μmol/g，顯著高于未接菌組相同葉片含水量時(shí)的可溶性糖含量（252.70 μmol/g），同樣說明二型傘霉能夠提高組培苗可溶性糖的調(diào)控響應(yīng)速度。

3 結(jié)論與討論

將樟葉越桔根中的優(yōu)勢內(nèi)生真菌二型傘霉回接到組培苗中進(jìn)行干旱脅迫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在水分正常的情況下，樟葉越桔根中優(yōu)勢內(nèi)生真菌在植物正常的生長過程中有助于增強(qiáng)POD 的活性，在干旱脅迫下，樟葉越桔根中優(yōu)勢內(nèi)生真菌能夠快速且顯著的增強(qiáng)植物中POD 的活性，有利于組培苗迅速調(diào)節(jié)自身的CAT 活性，起到能夠增強(qiáng)組培苗中CAT 活性的作用。同時(shí)，二型傘霉能夠更加快速且明顯地增強(qiáng)植物中Pro 的含量和可溶性糖的累積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樟葉越桔根中的優(yōu)勢內(nèi)生真菌二型傘霉能夠增強(qiáng)樟葉越桔抵御干旱的能力。

植物在受到干旱脅迫時(shí)，在細(xì)胞中過量的積累如過氧化氫、超氧陰離子和羥自由基等，會(huì)引發(fā)膜脂過氧化反應(yīng)，使過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物MDA 增加，而產(chǎn)生的過多MDA會(huì)損害細(xì)胞膜系統(tǒng)，使膜喪失透性選擇性，因此MDA 通常被作為衡量干旱程度的重要指標(biāo)之一，以反映細(xì)胞膜氧化損傷程度和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[8,30-31]。在干旱脅迫的過程中，未接菌組的MDA含量波動(dòng)性較大，而接菌后的MDA 含量穩(wěn)定性較好，表明接種二型傘霉可以通過抑制膜脂過氧化反應(yīng)，較好地維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而有助于增強(qiáng)宿主植物的抗旱能力。植物體中的POD、CAT、SOD等抗氧化酶能夠幫助植物清除體內(nèi)累積的活性氧，所以這類抗氧化酶的活性與植物干旱抗性緊密相關(guān)[7,32]。植物葉片中POD 酶活性的增加表明植物初期啟動(dòng)保護(hù)酶系統(tǒng)來清除體內(nèi)相關(guān)自由基，以此來減少干旱初期體內(nèi)這些自由基對植物的傷害。結(jié)果顯示，二型傘霉在植物正常的生長過程中有助于增強(qiáng)POD 的活性，在干旱脅迫下，接菌后的植株能夠快速且顯著的增強(qiáng)POD 的活性，同時(shí)能夠迅速地調(diào)節(jié)CAT 的活性，有助于幫助植物緩解和抵御干旱脅迫。

植物受到干旱脅迫時(shí)，同時(shí)還能夠產(chǎn)生Pro、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，使細(xì)胞的滲透壓升高，減少水分流失，從而降低或消除干旱脅迫對植物造成的傷害[7-8,33-35]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示，在干旱脅迫時(shí)，接菌的植株能夠更加快速且明顯的增強(qiáng)Pro 的含量，并提高可溶性糖含量的調(diào)控響應(yīng)速度，接菌有助于Pro 和可溶性糖的累積，增加植株的抗旱性。本研究僅對樟葉越桔根中優(yōu)勢內(nèi)生真菌二型傘霉的抗旱作用進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)該菌株有助于增強(qiáng)宿主植物的抗旱能力，與徐超等[27]的研究結(jié)果較為吻合。但樟葉越桔中其他的內(nèi)生真菌及內(nèi)生細(xì)菌是否具有類似功能有待進(jìn)一步挖掘。由于內(nèi)生菌株侵染宿主植物后，在宿主體內(nèi)定殖呈現(xiàn)出一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，不僅是在植物各組織間的定殖，還包括在植物體內(nèi)定殖的時(shí)間軸上，其定殖量也呈現(xiàn)出消長的動(dòng)態(tài)變化[36]，有必要對二型傘霉在宿主中的定殖消長變化規(guī)律開展進(jìn)一步的深入研究。內(nèi)生菌在與宿主植物長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，在植物體內(nèi)形成龐大的微生態(tài)系統(tǒng)，所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)是多種內(nèi)生菌協(xié)同作用的結(jié)果。因此，進(jìn)一步加強(qiáng)對多個(gè)菌種的混合接種即多菌株制劑的開發(fā)利用，或能使各個(gè)菌株的功能產(chǎn)生累加效應(yīng)，將有助于更好地開發(fā)和利用內(nèi)生真菌這一獨(dú)特的功能性資源。