南方紅豆杉根際促生細(xì)菌蠟狀芽孢桿菌CLY07 的接種效應(yīng)

馮 丹 曹永清 劉 艷 任嘉紅

（1. 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041000；2. 長治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 長治 046011）

南方紅豆杉（Taxus chinensisvar.mairei）為紅豆杉科紅豆杉屬常綠大喬木，是我國Ⅰ級重點(diǎn)保護(hù)植物，素有“活化石”之稱[1]，是我國特有的集觀賞、藥用和材用于一體的珍稀樹種。長期以來，人們對南方紅豆杉的亂砍亂伐以及對紫杉醇過度開發(fā)利用，加之紅豆杉自然繁殖率低、生長速度慢等多原因?qū)е乱吧t豆杉屬植物現(xiàn)存數(shù)量越來越少[2]。

植物根際促生細(xì)菌（plant growth promoting rhizobacteria, PGPR）是指能夠促進(jìn)植物生長、增加植物產(chǎn)量，并能防止病害的一類植物根際細(xì)菌。研究發(fā)現(xiàn)，PGPR 含有固氮、解磷、產(chǎn)IAA等多種促生長特性[3]，其中，ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）脫氨酶是PGPR 的一個重要的促生指標(biāo)，也是許多PGPR 的共同特征[4]，可通過將ACC 降解為α-酮丁酸和氨，來降低應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的乙烯的內(nèi)部濃度，提高植物抗逆性；同時，α-酮丁酸和氨可作為C、N 源利用，促進(jìn)植物生長[5-6]。

筆者課題組前期從南方紅豆杉根際土壤中分離篩選出一株具較強(qiáng)產(chǎn)ACC 脫氨酶能力的CLY07 菌株，本研究通過形態(tài)學(xué)、生理生化、基于16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育分析等方法對該菌株進(jìn)行鑒定，以確定其分類地位，對其產(chǎn)ACC 脫氨酶能力進(jìn)行定量測定，并克隆其ACC 脫氨酶acds基因；同時還對其解磷、產(chǎn)IAA、產(chǎn)嗜鐵素能力等促生長特性進(jìn)行測定。此外，利用GFP 標(biāo)記技術(shù)明確該菌株在南方紅豆杉根際的定殖情況，并將菌株回接于紅豆杉幼苗根際，通過測定生長參數(shù)指標(biāo)評估CLY07 對南方紅豆杉的促生長效應(yīng)。本研究為開發(fā)南方紅豆杉細(xì)菌肥料提供了優(yōu)良的菌株資源，對南方紅豆杉的人工栽培及珍貴野生資源的保護(hù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

菌株CLY07，由本實(shí)驗(yàn)室從南方紅豆杉根際土壤中分離得到，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號：CCTCC NO：M 2010157。

1.1.2 培養(yǎng)基

TSB、DF 和ADF 參照文獻(xiàn)[7]，LB 和NBRIP參照文獻(xiàn)[8]，CAS 參照文獻(xiàn)[9]。

1.2 ACC 脫氨酶活性的測定

ACC 脫氨酶酶活性通過每毫克蛋白質(zhì)在每小時產(chǎn)生的α-酮丁酸鹽的量來測定[10]。具體方法參照文獻(xiàn)[11]。蛋白質(zhì)含量使用Bradford 蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量測定，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 產(chǎn)ACC 脫氨酶細(xì)菌的促生能力測定

1.3.1 產(chǎn)IAA 能力測定

將甘油管保藏的供試菌株按1%的比例接種于液體LB 中于30 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h 進(jìn)行活化，吸取活化后的菌懸液500 μL 分別接種于含有L-色氨酸（終濃度為100 mg/L）與不含色氨酸的50 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，進(jìn)行顯色反應(yīng)[12]，顏色越紅則表示菌株產(chǎn)IAA 能力越強(qiáng)。根據(jù)顯色后的顏色變化，初步測定供試菌株產(chǎn)IAA 能力。

培養(yǎng)液離心之后取上清液與S2 顯色劑等體積混合，室溫避光放置30 min 后，于530 nm 處測OD 值。同時配制濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL 的IAA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)IAA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線估計(jì)菌株產(chǎn)生的IAA 含量。具體方法參照文獻(xiàn)[12]。

1.3.2 解磷能力測定

將甘油管保存的供試菌株在LB 固體培養(yǎng)基上劃線，于30 ℃倒置培養(yǎng)18 h。待有單菌落長出后，挑取單菌落至50 mL LB 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)24 h。將活化好的菌株參照白變霞等[13]的方法測CLY07 的解有機(jī)磷能力。

將活化好的菌株接種于NBRIP 固體培養(yǎng)基中，做3 個平行對照，觀察菌落周圍透明圈的大小。將菌液以1%的接種量接種于NBRIP 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d，發(fā)酵液以4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，采用鉬銻抗比色法測定上清液有效磷含量。參照于淼等[14]方法計(jì)算CLY07 的解無機(jī)磷能力。

1.3.3 產(chǎn)嗜鐵素能力測定

根據(jù)通用CAS 瓊脂平板法測定細(xì)菌的鐵載體活性。若菌落周圍產(chǎn)生黃色或橙色透明圈，則說明該菌株具有分泌鐵載體能力；并定量測定CLY07 的產(chǎn)嗜鐵素能力[15]。其中，產(chǎn)嗜鐵素能力=嗜鐵素單位數(shù)/OD600。

1.4 產(chǎn)ACC 脫氨酶細(xì)菌耐鹽能力檢測

將CLY07 接種于含NaCl 濃度分別為1%、2%、4%、6%、8% 的LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)18 h 后測定OD600，以鹽濃度為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制供試菌株耐鹽能力曲線。

1.5 產(chǎn)ACC 脫氨酶細(xì)菌的鑒定

1.5.1 形態(tài)和生理生化鑒定

將活化后的菌株接種在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，于30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察其菌落的形態(tài)特征，參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[16]對菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢、鞭毛、伴孢晶體染色。參照《常見細(xì)菌鑒定手冊》[17]進(jìn)行生理生化鑒定。

1.5.2 CLY07 菌株16S rDNA 序列的測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

采用CTAB 法提取菌株基因組DNA，用16S rDNA 通用引物（16S-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S-R：5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′）對基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)合格并純化后送至北京華大基因進(jìn)行測序。將得到的16S rDNA 序列在NCBI 上通過BLAST 搜索分析并根據(jù)其最臨近菌株進(jìn)行鑒定后，向GeneBank 提交序列，同時用MEGA 6.0 構(gòu)建該菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 產(chǎn)ACC 脫氨酶細(xì)菌acds 基因序列的克隆與分析

通過CTAB法提取細(xì)菌總DNA，采用Blaha等[18]的acds基因引物（ACDS-F1936：5′-GHGAM GACTGCAAYWSYGGC-3′；ACDS-F1938：5′-A TCATVCCVTGCATBGAYTT-3′）對基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證成功后，切取大小為1 000 bp 左右的條帶進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選與菌液PCR 檢驗(yàn)后，挑選出陽性克隆送至北京華大基因進(jìn)行測序，將得到的DNA 序列在NCBI 進(jìn)行分析，并將其編碼蛋白的氨基酸序列在NCBI 比對，采用Mega6.0 繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 CLY07 在南方紅豆杉幼苗根際的定殖測定

采用修改后反復(fù)凍融的方法[19]將帶有綠色熒光蛋白（GFP）基因的質(zhì)粒pGFP4412 轉(zhuǎn)入到CLY07的感受態(tài)中，用含新霉素和氨芐霉素的LB 固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆子，并用瓊脂糖凝膠電泳和熒光顯微鏡進(jìn)行檢測，將綠色熒光較強(qiáng)且能穩(wěn)定遺傳的陽性克隆子接種于南方紅豆杉幼苗根際，每5 d 對根際土壤中的標(biāo)記菌株進(jìn)行回收，檢測CLY07 在南方紅豆杉幼苗根際的定殖動態(tài)與存活規(guī)律，并通過熒光顯微鏡觀察菌株在根表面的定殖情況。

1.8 CLY07 盆栽苗實(shí)驗(yàn)

將甘油管保存的菌株劃線活化后，挑取單菌落接種于NB 培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min 下振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液離心（4 ℃，6 000 r/min）去上清后用無菌生理鹽水將菌體洗滌2～3 次，制成菌懸液。以每株5 mL 接種量接種于南方紅豆杉1 年生幼苗根際，以等量無菌水為空白對照。置于溫室統(tǒng)一管理，2 d 澆1 次水。接種1 年后，采用對氨基苯磺酸氨比色法測定硝酸還原酶、 H2SO4-H2O2消煮及凱氏定氮法測定含氮量、分光光度法測定硝基氮、Folin-酚試劑法測定可溶性蛋白以及鉬銻抗比色法測定含磷量等營養(yǎng)代謝指標(biāo)；此外，利用分光光度法對葉綠素含量、氯化三苯基四氮唑（TTC）法對根系活力，烘干法對生物量進(jìn)行測定，同時，利用卷尺測量盆栽苗的苗高和地徑等。具體方法參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CLY07 菌株的促生能力

對從南方紅豆杉根際土壤中分離篩選出的產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株CLY07 的發(fā)酵液進(jìn)行α-酮丁酸鹽含量測定結(jié)果顯示，CLY07 菌株的產(chǎn)ACC 脫氨酶酶活為0.20 mmol/(mg·h)，定性檢測結(jié)果顯示產(chǎn)ACC 脫氨酶能力很強(qiáng)。

對CLY07 菌株的產(chǎn)IAA、溶無機(jī)磷以及產(chǎn)嗜鐵素能力進(jìn)行定性檢測，結(jié)果表明，菌株CLY07具有產(chǎn)IAA、溶磷和產(chǎn)嗜鐵素能力（圖1～3），其中產(chǎn)IAA 與解有機(jī)磷能力較強(qiáng)。通過定量測定，CLY07 菌株產(chǎn)IAA 能力為8.35 mg/L，溶有機(jī)磷能力為26.65 mg/L，溶無機(jī)磷能力為635.21 mg/L，產(chǎn)嗜鐵素能力為23.93%。

圖1 CLY07 菌株產(chǎn)IAA 能力Fig. 1 IAA production of strain CLY07

圖2 CLY07 菌株解無機(jī)磷能力Fig. 2 Phosphate-solubilizing effects of strain CLY07

圖3 CLY07 菌株CAS 平板檢測Fig. 3 CAS detecting plate cultivation result of strain CLY07

2.2 CLY07 的耐鹽能力

通過用含有不同濃度NaCl 的LB 液體培養(yǎng)基對CLY07 進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌株具有一定的耐鹽性。隨著鹽濃度增加，菌液OD 值呈現(xiàn)先不變后下降的趨勢。當(dāng)NaCl 濃度超過2%時，菌液OD 值開始下降，當(dāng)鹽濃度達(dá)到4% 時，菌液OD 值降至最低，因此推測該菌耐受的最高鹽濃度為2%（約342 mmol/L 氯化鈉）（圖4）。按照Vreeland[21]對耐鹽菌的分類方法可推斷，CLY07為輕度耐鹽菌株，有望為南方紅豆杉減輕鹽脅迫。

圖4 CLY07 的耐鹽能力Fig. 4 Salt tolerance of CLY07

2.3 CLY07 菌株的鑒定

CLY07 為革蘭氏陽性桿菌，菌體桿狀，大小約0.95 μm×1.45 μm～2.50 μm×4.10 μm；中生芽孢，周生鞭毛，不產(chǎn)伴孢晶體；在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，菌落呈乳白色，無光澤，圓形，邊緣整齊，菌落大且干燥；好氧，氧化酶反應(yīng)、3% KOH試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)和檸檬酸鹽生長試驗(yàn)均為陰性；接觸酶實(shí)驗(yàn)、硝酸還原試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、VP 試驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)以及淀粉水解實(shí)驗(yàn)均為陽性。

將CLY07 菌株的16S rDNA 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，并運(yùn)用MEGA6 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。由圖5 可以看出，CLY07 菌株與芽孢桿菌屬（Bacillus）同源性較高，其中與蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）最為相似，相似度達(dá)到100%。結(jié)合CLY07 的形態(tài)學(xué)鑒定以及生理生化分析，將該菌株鑒定為蠟狀芽孢桿菌；同時，向GeneBank 提交序列獲得登錄號MT775468。

圖5 基于菌株CLY07 16S rDNA 及其同源序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of the strain CLY07 based on 16S rDNA sequence

2.4 acds 基因序列的克隆與分析

以CLY07 菌株的基因組DNA 為模板，采用acds基因引物擴(kuò)增出約為1 000 bp 條帶，經(jīng)測序知該基因序列大小為996 bp。在NCBI 上進(jìn)行序列比對，并運(yùn)用MEGA 6.0 構(gòu)建CLY07 的acds基因編碼的氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)其與菌株Bacillus albus（WP 166 688 352.1）處于同一遺傳分支，且同源性達(dá)到88%，由此確定，CLY07 菌株acds基因序列與菌株Bacillus albus的acds基因序列在進(jìn)化上最為相近（圖6）。這表明該菌株具有與合成ACC 脫氨酶相關(guān)的acds基因，在分子水平揭示該菌株具有產(chǎn)ACC 脫氨酶能力，與前期產(chǎn)ACC 脫氨酶的測定結(jié)果一致。

圖6 CLY07 菌株的acds 基因編碼氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Phylogenetic tree of amino acids encoded by the acds gene of strain CLY07

2.5 CLY07 在南方紅豆杉根際的定殖動態(tài)

通過GFP基因的轉(zhuǎn)化獲得陽性克隆菌株，將篩選出的綠色熒光強(qiáng)且能穩(wěn)定遺傳的陽性克隆子接種于南方紅豆杉幼苗根際，通過對目的菌株的回收檢測，發(fā)現(xiàn)回收菌株數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在接種5 d 時，土壤中的菌數(shù)達(dá)到最大值（1.0×108cfu/g 干土）；當(dāng)接種時間超過30 d時，菌數(shù)穩(wěn)定在1.6×107cfu/g 干土（圖7）。推斷其主要原因是菌種在根表面定殖后大量繁殖，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的減少，競爭逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致數(shù)量菌體減少最后處于穩(wěn)定。這說明CLY07 菌株具有在南方紅豆杉根際持久定殖的能力。利用熒光顯微鏡對紅豆杉根表面進(jìn)行觀察，根表面含有大量的GFP 標(biāo)記的菌株（圖8），進(jìn)一步表明菌株CLY07能在南方紅豆杉根表面長期穩(wěn)定定殖，從而發(fā)揮促生效應(yīng)。

圖7 GFP 標(biāo)記CLY07 菌株在南方紅豆杉根際的數(shù)量變化動態(tài)Fig. 7 Population fluctuation of strain CLY07 tagged with GFP in T. chinensis var. mairei rhizosphere

圖8 GFP 標(biāo)記CLY07 菌株在南方紅豆杉根表面的定殖Fig. 8 Strain CLY07 tagged with GFP in the root surface of T. chinensis var. mairei

2.6 CLY07 對南方紅豆杉的接種效果

在溫室條件下，CLY07 對南方紅豆杉有明顯的促生長作用。接種1 年后苗高、葉綠素、生物量、地徑以及根活力等指標(biāo)顯著高于對照組（表1），增長率分別為36.90%、73.68%、16.67%、4.11%和4.07%。接種CLY07 對南方紅豆杉的營養(yǎng)代謝同樣有較好的促進(jìn)作用（表2），與CK相比，南方紅豆杉中可溶性蛋白、硝基氮、含氮量與磷含量均增長了224.30%、100.19%、23.03%和25.37%，而硝酸還原酶活性降低了9.67%，這表明CLY07 可通過改善南方紅豆杉對N、P 等養(yǎng)分的吸收能力以促進(jìn)植物的生長。

表1 CLY07 對南方紅豆杉的接種效應(yīng)Table 1 Inoculation effect of CLY07 on T. chinensis var. mairei

表2 CLY07 對南方紅豆杉養(yǎng)分代謝的影響Table 2 Effect of CLY07 on nutrient metabolism of T. chinensis var. mairei

3 結(jié)論與討論

由于市場對紫杉醇的需求日益增加，野生南方紅豆杉已經(jīng)不足以維持市場的需求，現(xiàn)階段主要通過人工種植該屬植物來滿足所需的紫杉醇。由于其生長速度慢、對環(huán)境的要求較為嚴(yán)苛，傳統(tǒng)人工栽培成活率低，導(dǎo)致無法大面積種植。雖然化學(xué)肥料能有效地促進(jìn)南方紅豆杉的生長[22]，但對環(huán)境的危害也在日益嚴(yán)重。因此，尋得一種既能高效促進(jìn)南方紅豆杉生長，又不污染環(huán)境的肥料顯得尤為重要。

大量研究表明產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株能夠有效的促進(jìn)植物的生長發(fā)育。植物在逆境脅迫下，會合成高濃度乙烯，進(jìn)而抑制植物的生長。產(chǎn)ACC 脫氨酶細(xì)菌能夠利用ACC 脫氨酶分解植物中乙烯的直接前體ACC 來降低乙烯含量，從而抑制植物中乙烯的積累，緩減乙烯對植物的抑制作用，提高植物對逆境的耐受能力[23]。Sarkar 等[10]將Enterobactersp.接種于水稻種子與幼苗后，發(fā)現(xiàn)株高、葉綠素含量較對照相比都顯著提高；費(fèi)詩萱等[5]在紅棗（Zizyphus jujuba）幼苗根際接種Pseudomonas putida，幼苗在株高、生物量以及植株中的N、P 含量都比對照有顯著性差異。本課題組將含有GFP 標(biāo)記的蠟狀芽孢桿菌CLY07 接種至南方紅豆杉根際土壤中，并對目標(biāo)菌株進(jìn)行回收及熒光顯微鏡觀察，菌株數(shù)量最后穩(wěn)定至1.6×105cfu/g干土，可見CLY07 能夠在紅豆杉根際土壤中穩(wěn)定持久定殖；將CLY07 接種于南方紅豆杉的幼苗中，幼苗的生長狀況明顯優(yōu)于對照組，尤其是苗高增長率為36.90%，葉綠素含量提高了73.68%。通過測定南方紅豆杉營養(yǎng)代謝能力，發(fā)現(xiàn)CLY07能夠促進(jìn)紅豆杉對土壤中N、P 等元素的吸收，極好地促進(jìn)了南方紅豆杉的生長。

芽孢桿菌作為PGPR 中極有應(yīng)用前景的一大類群，它們通過固氮、溶磷、產(chǎn)IAA 以及鐵載體等多途徑增加環(huán)境中營養(yǎng)元素，以促進(jìn)植物生長；通過分泌次生代謝產(chǎn)物或誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）來防治植物病害[24]。Maxton[25]分離得到的Bacillus cereus對辣椒（Capsicum annuum）有明顯的促生作用；李文英等[26]于香蕉（Musa nana）根際土壤中篩選出的Bacillusspp.能顯著促進(jìn)幼苗的生長，并能有效防治香蕉枯萎病發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)前期從南方紅豆杉根際土壤中篩選出的CLY07 菌株具有高效的產(chǎn)ACC 脫氨酶能力，同時具有溶磷、產(chǎn)IAA、產(chǎn)嗜鐵素、耐鹽等能力。此外，通過PCR 技術(shù)克隆出了ACC 脫氨酶相關(guān)acds基因，從基因水平進(jìn)一步證實(shí)了該菌株具有產(chǎn)ACC 脫氨酶能力。由此推測，CLY07 具有較好的應(yīng)用前景，為開發(fā)南方紅豆杉專用微生物肥料奠定一定的理論基礎(chǔ)，對保護(hù)我國南方紅豆杉珍貴野生資源具有重要意義。