黑楊派楊樹(shù)種質(zhì)資源的SSR 分析及鑒定

劉 巍 蔄勝軍 蘇曉華 彭儒勝 吳建軍

（1. 遼寧省楊樹(shù)研究所，遼寧 營(yíng)口 115213；2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；3. 遼寧省實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)，遼寧 撫順 113309）

黑楊派（SectionAigeiros）楊樹(shù)是楊屬中最為速生的樹(shù)種，為高大落葉喬木，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和遺傳學(xué)價(jià)值，全世界使用的絕大多數(shù)栽培品種均源于黑楊派[1-2]。黑楊派天然種質(zhì)資源存在豐富的遺傳變異，是楊樹(shù)育種研究重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。從20 世紀(jì)70 年代開(kāi)始，我國(guó)開(kāi)始有計(jì)劃地引進(jìn)黑楊派種質(zhì)資源并對(duì)其進(jìn)行研究，這些豐富的種質(zhì)資源為我國(guó)楊樹(shù)新品種培育奠定了種質(zhì)基礎(chǔ)，使我國(guó)的楊樹(shù)育種研究得到了迅速的發(fā)展，改變了我國(guó)原有楊樹(shù)栽培品種的格局[4]。

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法不能系統(tǒng)地對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳學(xué)評(píng)價(jià)，分子標(biāo)記技術(shù)不受組織、發(fā)育時(shí)期、季節(jié)環(huán)境限制，為楊樹(shù)育種研究提供了新的手段。另外，楊樹(shù)同一類(lèi)的不同品種（系）間形態(tài)特征差異很小，單純以形態(tài)學(xué)差異很難進(jìn)行區(qū)分，給楊樹(shù)新品種的鑒定和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)增加了困難，對(duì)林業(yè)生產(chǎn)影響很大，在良種的推廣應(yīng)用上會(huì)造成一定困難。為保證品種的特異性，利用分子標(biāo)記技術(shù)開(kāi)展遺傳分析并構(gòu)建指紋圖譜信息已逐漸成為品種鑒定的重要手段及良種審定的重要信息。在眾多分子標(biāo)記技術(shù)中，SSR 標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、共顯性等特點(diǎn)，是遺傳多樣性研究和品種鑒定中較為理想的分子標(biāo)記技術(shù)[5-7]，在楊樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[8-9]、品種鑒定[10-11]、指紋圖譜構(gòu)建[12-13]等方面廣泛應(yīng)用。本研究采用毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)對(duì)遼寧地區(qū)引種和自主選育的50 份黑楊派種質(zhì)資源進(jìn)行SSR 遺傳分析，依據(jù)相似系數(shù)構(gòu)建聚類(lèi)圖并對(duì)種質(zhì)進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，同時(shí)對(duì)種質(zhì)的純度進(jìn)行初步鑒定，并對(duì)遼寧地區(qū)主栽的14 份種質(zhì)構(gòu)建指紋圖譜，為楊樹(shù)育種群體篩選、分類(lèi)及雜交育種工作提供參考，同時(shí)為楊樹(shù)新品種的鑒定和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的50 份黑楊派種質(zhì)材料（表1）來(lái)自遼寧省楊樹(shù)研究所黑楊派基因庫(kù)和種質(zhì)資源保存圃，包括美洲黑楊31 份，歐洲黑楊7 份，歐美楊12 份。

表1 試驗(yàn)材料Table 1 Experimental materials

續(xù)表1

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

2020 年春季采集大樹(shù)枝條，于溫室水培后采集嫩葉，采用CATB 法提取DNA[14]。

1.2.2 引物篩選

從李薇等[7]和丁明明[15]所報(bào)道的黑楊派楊樹(shù)引物中選取23 對(duì)SSR 引物用于分析，引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。分別從3 類(lèi)楊樹(shù)種質(zhì)材料中各選取2 份樣品通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行引物篩選，最后篩選出擴(kuò)增條帶清晰、具有多態(tài)性和重復(fù)性好的15 對(duì)引物（表2）進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

表2 15 對(duì)SSR 引物信息表Table 2 Information of 15 pairs of SSR primers

1.2.3 PCR 擴(kuò)增與毛細(xì)管電泳檢測(cè)

采用15 對(duì)SSR 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。SSR-PCR 反應(yīng)體系25 μL，包括模板DNA（20 ng/μL）2 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，dNTP（10 μmol/L）0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL 和ddH2O18.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)在Gene Amp PCR System 9600 型擴(kuò)增儀上進(jìn)行。采用ABI3730X Genetic Analyzer對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用DateFormater 軟件將電泳檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)換為“1，0”矩陣，運(yùn)用POPGENE32 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、期望雜合度（He）、觀測(cè)雜合度（Ho）等遺傳多樣性指標(biāo)。用Excel 2007 計(jì)算每對(duì)引物的多態(tài)信息含量（PIC）。運(yùn)用NTSYS 2.1 軟件將“1，0”矩陣轉(zhuǎn)換為ntsys 格式，采用軟件中的SM 相似系數(shù)程序計(jì)算任意2 個(gè)品種間的相似系數(shù)，采用UPGMA 方法進(jìn)行聚類(lèi)分析并繪制聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 引物多態(tài)性分析

利用15 對(duì)SSR 引物對(duì)參試50 份樣品的基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，3 類(lèi)黑楊派楊樹(shù)種質(zhì)的部分?jǐn)U增結(jié)果見(jiàn)圖1。由表3 可知，15 對(duì)引物共檢測(cè)到187 個(gè)等位位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)187 個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為100%。每對(duì)引物檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)數(shù)8～19 個(gè)，平均12.47 個(gè)，其中引物P3 最多，為19 個(gè)，引物GCPM-2826 和引物P139 次之，為16 個(gè)，引物GCPM-2140 和引物P133 最少，為8 個(gè)。有效等位基因數(shù)（Ne）平均1.184 5 個(gè)。期望雜合度（He）為0.652 5～0.920 4，平均0.820 7，觀測(cè)雜合度（Ho）為0.321 5～0.983 2，平均0.739 1。多態(tài)信息含量（PIC）為0.63～0.91，平均0.79。以上參數(shù)表明，50 份楊樹(shù)種質(zhì)具有豐富的遺傳多樣性，且根據(jù)Botstein[16]提出的理論，所篩選的15 對(duì)引物都具有高度多態(tài)性（PIC＞0.5）。

圖1 引物GCPM-2885 對(duì)部分楊樹(shù)種質(zhì)的電泳圖譜Fig. 1 Electropherogram detected by GCPM-2885 for parts of poplar germplasm

表3 15 對(duì)引物在50 份楊樹(shù)種質(zhì)中的多態(tài)性Table 3 Polymorphisms of 15 pairs of SSR primers in 50 poplar germplasm

續(xù)表3

從分析結(jié)果可知，15 對(duì)SSR 引物中有12 對(duì)引物在17 份樣品中檢測(cè)到了特異性位點(diǎn)（表4），共檢測(cè)到特異性位點(diǎn)36 個(gè)，每個(gè)引物檢測(cè)到特異性位點(diǎn)數(shù)量為1～5 個(gè)。引物GCPM-2885、GCPM-2140 和P133 沒(méi)有檢測(cè)到特異性位點(diǎn)，引物P139檢測(cè)到特異性位點(diǎn)最多，為5 個(gè)。36 個(gè)特異性位點(diǎn)分布于3 類(lèi)楊樹(shù)種質(zhì)中。其中，N024、N018和N51 分別在5 對(duì)引物下都檢測(cè)到特異性位點(diǎn)，N017 分別在3 對(duì)引物下都檢測(cè)到了特異性位點(diǎn)。這充分表明了楊樹(shù)基因組DNA 的多態(tài)性，說(shuō)明了不同參試材料之間的遺傳差異。

表4 SSR 引物特異性位點(diǎn)Table 4 Specific sites of SSR primers

2.2 50 份楊樹(shù)種質(zhì)的聚類(lèi)分析

以50 份楊樹(shù)種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)為依據(jù)，采用UPGMA 法進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到參試樣品的遺傳關(guān)系聚類(lèi)分析圖（圖2）。50 份楊樹(shù)種質(zhì)相似系數(shù)為0.727 3～0.989 3，平均0.804 5，表明參試種質(zhì)間存在較高的遺傳相似度。聚類(lèi)結(jié)果顯示，當(dāng)相似性系數(shù)在0.79 時(shí)，參試樣品可分為4 大類(lèi)。

圖2 基于SSR 結(jié)果的50 份楊樹(shù)種質(zhì)的聚類(lèi)結(jié)果Fig. 2 Clustering results of 50 poplar germplasm based on SSR results

第Ⅰ大類(lèi)包括36 份種質(zhì)，主要以美洲黑楊類(lèi)種質(zhì)為主，其中5030、180-39、180-33 和180-28聚為1 個(gè)小類(lèi)，相似系數(shù)為0.951 9～0.984 0；5028和2017 聚為1 個(gè)小類(lèi)，相似系數(shù)達(dá)到0.978 6；N001 和N027 聚為1 個(gè)小類(lèi)，相似系數(shù)達(dá)到0.962 6；178-2-19 、178-2-122 和178-2-145 聚為1 個(gè)小類(lèi)，相似系數(shù)為0.962 6～0.984 0。以上幾個(gè)小類(lèi)主要與其均為美洲黑楊及引自相同種源有關(guān)。遼寧楊♀、遼寧楊♂和蓋楊聚為1 個(gè)小類(lèi)，相似系數(shù)為0.877 0～0.893 0，與其為同一父本雜交子代有關(guān)；遼河楊♀、遼河楊♂和遼育3 號(hào)楊聚為1 個(gè)小類(lèi)，相似系數(shù)為0.930 5～0.941 2，這可能與其都具有山海關(guān)楊基因有關(guān)。111 楊、遼豐1 號(hào)楊和014 楊之間相似系數(shù)較大，為0.951 9～0.989 3，這3 份種質(zhì)均為歐美楊遺傳背景，另外，這3 個(gè)品種（系）外部形態(tài)及其相似，類(lèi)似108 楊，很難區(qū)分，說(shuō)明其親緣關(guān)系較近，遺傳差異較小。渤豐1 號(hào)楊、渤豐2 號(hào)楊和渤豐3 號(hào)楊聚為1 個(gè)小類(lèi)，相似系數(shù)為0.866 3～0.882 4，與其為同一雜交組合選育的新品種有關(guān)。第Ⅱ大類(lèi)包括N017 和N018，相似系數(shù)為0.828 9，這與其引自同1 種源有關(guān)。第Ⅲ大類(lèi)包括10 份種質(zhì)，主要以歐洲黑楊類(lèi)種質(zhì)為主，其中，N009 與中荷64 楊聚為1 個(gè)小類(lèi)，相似系數(shù)為0.925 1；YN 與中遼1 號(hào)楊聚為1 個(gè)小類(lèi)，相似系數(shù)為0.909 1；N13 和N54 聚為1 個(gè)小類(lèi)，相似系數(shù)為0.946 5，這2 份種質(zhì)均引自歐洲種源，說(shuō)明其親緣關(guān)系較近。第Ⅳ大類(lèi)包括N4 和N51，相似系數(shù)為0.802 1，與其共同引自歐洲種源有關(guān)。

歐美楊是美洲黑楊與歐洲黑楊的雜交種，12 份歐美楊種質(zhì)中有10 份聚到第Ⅰ大類(lèi)中，包括蓋楊、遼育2 號(hào)楊、渤豐1 號(hào)楊、渤豐2 號(hào)楊、渤豐3 號(hào)楊、歐美楊177、111 楊、014 楊、遼豐1 號(hào)楊和I-45 楊，說(shuō)明這10 份種質(zhì)與美洲黑楊親緣關(guān)系較近；中遼1 號(hào)楊和中荷64 楊聚到第Ⅲ大類(lèi)中，說(shuō)明這2 份種質(zhì)與歐洲黑楊的親緣關(guān)系較近。

2.3 14 份主栽種質(zhì)指紋圖譜的構(gòu)建

以遼寧省目前生產(chǎn)上主栽的速生的14 份種質(zhì)為研究對(duì)象，構(gòu)建指紋圖譜。依據(jù)15 對(duì)引物對(duì)14 份種質(zhì)的擴(kuò)增結(jié)果，綜合考慮多態(tài)性和引物擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)，最少可以利用鑒別效率較高的4 對(duì)引物組合GCPM-2826、P139、P3 和P141 構(gòu)建指紋圖譜，該指紋圖譜中，14 份種質(zhì)均可應(yīng)用特有位點(diǎn)或位點(diǎn)組合加以鑒定。

由表5 可知，引物GCPM-2826 可以區(qū)分遼寧楊♀、遼寧楊♂、遼育2 號(hào)楊、渤豐2 號(hào)楊、渤豐3 號(hào)楊、蓋楊和中荷64 楊共7 份種質(zhì)；引物P139 可以區(qū)分除I-45 楊、中遼1 號(hào)楊、歐美楊177 和渤豐1 號(hào)楊共4 份種質(zhì)；引物P3 和引物P141 可以區(qū)分111 楊、遼豐1 號(hào)楊和014 楊共3 份種質(zhì)。通過(guò)4 對(duì)高效引物即可將14 份種質(zhì)完全區(qū)分開(kāi)。

表5 14 份主栽種質(zhì)的指紋圖譜Table 5 Fingerprint map of 14 main planted germplasm

3 結(jié)論與討論

毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、成本低、污染少、精準(zhǔn)度高等優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染技術(shù)自動(dòng)化和程序化更高，可以減少試驗(yàn)過(guò)程中人為和系統(tǒng)誤差，尤其適合于大量樣本的高通量檢測(cè)[17]。王世杰等[18]用11 對(duì)SSR 引物對(duì)50 份楊樹(shù)新品種進(jìn)行擴(kuò)增，并使用毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，11 對(duì)引物共擴(kuò)增出122 個(gè)DNA 片段，擴(kuò)增的等位重復(fù)序列數(shù)為4～17 個(gè)，平均每對(duì)引物11.091 個(gè)，不同引物PIC值的變化范圍是0.530～0.908，平均為0.803，同時(shí)對(duì)50 份樣品進(jìn)行了聚類(lèi)分析，證實(shí)了SSR 分子標(biāo)記可以有效的鑒別楊樹(shù)品種，并能很好的反映品種間的親緣關(guān)系。賈會(huì)霞等[12]采用GeXP 毛細(xì)管電泳對(duì)PCR 熒光產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，19對(duì)SSR 引物共擴(kuò)增出102 條條帶，多態(tài)性條帶占95.10%，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為2～11 個(gè)，平均每對(duì)引物5.37 個(gè)，并為24 份楊樹(shù)種質(zhì)構(gòu)建了指紋圖譜。本試驗(yàn)利用15 對(duì)SSR 引物對(duì)黑楊派3 個(gè)類(lèi)別的50 份種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，采用ABI3730 測(cè)序儀對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，共檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)187 個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為100%，平均每對(duì)引物檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為12.47 個(gè)，平均多態(tài)信息含量為0.79，說(shuō)明篩選的15 對(duì)引物具有高度的多態(tài)性。觀測(cè)雜合度是隨機(jī)抽取的2 個(gè)樣本的等位基因不相同的概率，能夠反映等位基因的豐富度的高低，雜合度越高，該位點(diǎn)處的基因型越多，遺傳變異越豐富[19]。本試驗(yàn)中平均期望雜合度和平均觀測(cè)雜合度分別為0.820 7 和0.739 1，相較于前人的研究具有較高的基因雜合性[19-21]，表明了50 份楊樹(shù)種質(zhì)具有較高的遺傳變異性，是遺傳基礎(chǔ)較為豐富的育種群體。

本研究中，有12 對(duì)引物在多個(gè)樣品中檢測(cè)到了特異性位點(diǎn)，共檢測(cè)到特異性位點(diǎn)36 個(gè)，說(shuō)明不同樣品之間遺傳差異較大。其中，N024、N018和N51 分別在5 對(duì)引物下都檢測(cè)到了特異性位點(diǎn)，N017 分別在3 對(duì)引物下都檢測(cè)到了特異性位點(diǎn)。通過(guò)聚類(lèi)分析，可以較好地表現(xiàn)各種質(zhì)的親緣關(guān)系。研究表明，50 份楊樹(shù)種質(zhì)相似系數(shù)在0.727 3～0.989 3 之間，平均0.804 5，表明參試種質(zhì)間存在較高的遺傳相似性，這與參試樣品均為黑楊類(lèi)遺傳背景有關(guān)。試驗(yàn)中遼寧楊♀、遼寧楊♂和蓋楊聚為1 個(gè)小類(lèi)，遼河楊♀、遼河楊♂和遼育3 號(hào)楊聚為1 個(gè)小類(lèi)，渤豐1 號(hào)楊、渤豐2 號(hào)楊和渤豐3 號(hào)楊聚為1 個(gè)小類(lèi)，以上幾組聚類(lèi)結(jié)果基本符合種質(zhì)的系譜關(guān)系；111 楊、遼豐1 號(hào)楊和014 楊3 份種質(zhì)外部形態(tài)特征及其相似，因此聚為1 個(gè)小類(lèi)，說(shuō)明了遺傳本質(zhì)差異對(duì)外部形態(tài)特征的對(duì)應(yīng)反映[22]。通過(guò)試驗(yàn)也證實(shí)了所選的15 對(duì)SSR 引物在可以有效地對(duì)50 份楊樹(shù)種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒別的同時(shí)，也可以較好地研究種質(zhì)間親緣關(guān)系，為楊樹(shù)種質(zhì)的分類(lèi)研究和核心育種群體的篩選工作提供分子基礎(chǔ)。本研究的試驗(yàn)材料中，美洲黑楊和歐洲黑楊的遺傳背景是根據(jù)材料來(lái)源及形態(tài)特征對(duì)其進(jìn)行的初步分類(lèi)，可能會(huì)存在個(gè)別種質(zhì)分類(lèi)不準(zhǔn)確，而綜合試驗(yàn)中特異性位點(diǎn)的檢測(cè)和聚類(lèi)分析的結(jié)果，初步判斷31 份美洲黑楊種質(zhì)中的N024、N018、N017、N009、YN 和47#可能不是純種美洲黑楊，7 份歐洲黑楊種質(zhì)中的N4 和N51 可能不是純種歐洲黑楊，還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前生產(chǎn)上主栽的楊樹(shù)新品種（系）遺傳基礎(chǔ)較狹窄，且生物學(xué)性狀受生長(zhǎng)發(fā)育階段和環(huán)境影響較大，單純以形態(tài)特征的差異作為品種區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)比較困難，而且不利于新品種權(quán)的保護(hù)[12,23]。本研究采用4 對(duì)SSR 引物構(gòu)建了14 份遼寧地區(qū)主栽楊樹(shù)種質(zhì)的指紋圖譜，能夠?qū)?4 份種質(zhì)進(jìn)行有效的鑒定，為楊樹(shù)新品種的鑒定和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供參考依據(jù)。

對(duì)北方型美洲黑楊和歐洲黑楊種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、種質(zhì)純度鑒定和遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，是本研究的重要研究?jī)?nèi)容。在此基礎(chǔ)上，對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行分類(lèi)，下一步將結(jié)合表型特征評(píng)價(jià)初步篩選核心育種群體，利用黑楊派樹(shù)種的速生、干直、抗病蟲(chóng)的特性，對(duì)遼寧省乃至東北地區(qū)的鄉(xiāng)土楊樹(shù)進(jìn)行遺傳改良，選育速生、抗逆性強(qiáng)的楊樹(shù)新品種，解決目前生產(chǎn)上栽培品種林分穩(wěn)定性差和缺乏更新?lián)Q代品種的問(wèn)題。