韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌的化感作用

謝一琪 牛玉 劉子記 于仁波 韓旭

摘 ?要：為探究韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌的化感作用，本研究以‘山東雪韭6號(hào)’韭菜和苦瓜枯萎病菌為試驗(yàn)材料，水培法收集韭菜根系分泌物，采用菌絲生長(zhǎng)速率和孢子萌發(fā)法研究韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌的化感作用;利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）鑒定根系分泌物組成成分，篩選可能的主效化感物質(zhì)，進(jìn)一步通過體外抑菌試驗(yàn)驗(yàn)證其化感作用，明確主效化感物質(zhì)。結(jié)果表明，隨著韭菜根系分泌物濃度的升高，苦瓜枯萎病菌的菌落直徑和孢子萌發(fā)數(shù)均呈先降后升的趨勢(shì)，當(dāng)分泌物濃度為3.22 mg/mL時(shí)，抑制作用最大，滿足化感作用低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的特性。通過GC-MS鑒定出韭菜根系分泌物中的主要成分為酚類、酯類、烷烴類、醇類、烯類、芳香類，可能的化感物質(zhì)為鄰苯二甲酸二丁酯、2，4-二叔丁基苯酚、2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）。通過體外抑菌試驗(yàn)證實(shí)這3種物質(zhì)對(duì)苦瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)都有不同程度的化感抑制作用，且抑菌效果為2，4-二叔丁基苯酚>鄰苯二甲酸二丁酯>2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚），明確其為化感物質(zhì)。由此可知，韭菜根系分泌的主效化感物質(zhì)對(duì)苦瓜枯萎病菌有顯著的化感抑制作用，這為苦瓜間套輪作韭菜防控苦瓜枯萎病和研制植物源抑菌劑提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：韭菜根系分泌物;苦瓜枯萎病;尖孢鐮刀菌;化感作用;化感物質(zhì)

中圖分類號(hào)：S642.5 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Allelopathy of Chinese Chives Root Exudates on Fusarium Wilt of Bitter Gourd

XIE Yiqi1，2， NIU Yu2， LIU Ziji2， YU Renbo2， HAN Xu2*

1. College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Fusarium wilt of bitter gourd is a soil-borne disease caused by Fusarium oxysporum f. sp. momodicae， which seriously harms the yield and quality of bitter gourd. In traditional production， chemical pesticides mostly used to prevent and control Fusarium wilt of bitter gourd， but there are potential risks of environmental pollution and ecological damage. Although the method of grafting and replacing roots is also used in the production to control Fusarium wilt of bitter gourd， lack of high-resistance rootstock resources and high production costs have led to poor control effects and difficult to achieve. Therefore， there is an urgent need for an eco-environmental， green and effective method to prevent and control Fusarium wilt of bitter gourd. The cultivation patterns of intercropping relay intercropping and crop rotation are one of the effective methods to reduce soil-borne diseases. Bulb vegetable （Allium）， such as garlic， green garlic， and onions， are recognized as good previous crops， and the root exudates can effectively reduce the occurrence of soil-borne diseases by improving the soil micro-ecological environment， thereby alleviating continuous cropping obstacles. Studies have shown that the volatile and extract components of Chinese chives have the potential to resist fungal diseases. However， there are few studies on the Chinese chive root exudates， especially the allelopathy of Chinese chive root exudates on regulating resistance to Fusarium wilt of bitter gourd has not been reported. In order to explore the allelopathy of Chinese chive root exudates on Fusarium oxysporum f. sp. momdicae， the study used Chinese chive variety ‘Shandong Xuejiu No. 6’ and Fusarium oxysporum f. sp. momdicae as test materials， and Chinese chive root exudates were collected by hydroponics. The methods of mycelia growth rate and spore germination were used to study the allelopathy of Chinese chive root exudates on Fusarium oxysporum f. sp. momodicae. The components of root exudates were identified by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. According to the identification results of GC-MS， the possible main allelochemicals of root exudates were screened， and the allelopathy were further verified by in vitro antifungal test， then the main antifungal allelochemicals were clarified. With the increase of the concentration of Chinese chive root exudates， both the colony diameter and the number of spore germinations showed a trend of decreasing first and then increasing. When the concentration of Chinese chive root exudates was 3.22 mg/mL， the maximum inhibitory effect was achieved， the mycelia growth inhibition rate was 21.6%， and the spore germination inhibition rate was as high as 36.8%. This result satisfies the characteristics of the allelopathy which could promote antifungal effect at low concentration and inhibit antifungal effect at high concentration. The results of GC-MS indicated that the main components of Chinese chive root exudates were identified as phenols， esters， alkanes， alcohols， alkenes， and aromatics. According to the results of GC-MS identification and previous studies， the possible allelochemicals were dibutyl phthalate， 2，4-di-tert-butylphenol， 2，2-methylenebis-（4-methyl 6-tert-butylphenol）. The in vitro antifungal test confirmed that the three substances had varying degrees of allelopathic inhibition effects on the mycelia growth and spore germination of F. oxysporum f. sp. momodicae， and its antifungal effect was determined to be 2，4-di-tert-butylphenol>dibutyl phthalate> 2，2-methylenebis-（4-methyl-6-tert-butyl phenol）. Among them， the inhibitory effect of 2，4-di-tert-butylphenol on the mycelia growth and spore germination of Fusarium oxysporum f. sp. momdicae increased with the increase of concentration. The effect of dibutyl phthalate and 2，2-methylenebis-（4-methyl-6-tert-butylphenol） at different concentrations on the mycelia growth and spore germination of F. oxysporum f. sp. momdicae showed the allelopathic effect of promoting at low concentration and inhibiting at high concentration. 2，4-Di-tert-butylphenol had the best antifungal activity among them. When its concentration was 0.1 mmol/L， the inhibition rate of colony diameter reached 82.93%， and the inhibition rate of spore germination reached 77.59%. Both dibutyl phthalate and 2，2-methylenebis-（4-methyl-6-tert- butylphenol） reached the highest allelopathic inhibitory effect on F. oxysporum f. sp. momodicae at a concentration of 0.5 mmol/L. It can be seen that the main effect allelochemicals exudated by Chinese chive roots have a significant allelopathic inhibitory effect on F. oxysporum f. sp. momdicae. It is expected to provide theoretical basis and technology support for the study of prevention and control of Fusarium wilt of bitter gourd by using Chinese chives intercropping， relay intercropping and rotation with bitter gourd and development of plant-derived antifungal agents.

Keywords： Chinese chive root exudates; Fusarium wilt of bitter gourd; Fusarium oxysporum f. sp. momdicae; allelopathy; allelochemicals

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.01.022

苦瓜（Momordica charantia L.）屬葫蘆科苦瓜屬一年蔓生草本植物，又名涼瓜，起源于東印度，現(xiàn)熱帶、亞熱帶和溫帶區(qū)域?yàn)橹髟缘貐^(qū)，加勒比海和南美地區(qū)也有栽培[1]。與一些常見的蔬菜相比，苦瓜的營(yíng)養(yǎng)成分含量更高，富含多種維生素、礦物質(zhì)及纖維素[2-3]?？喙峡菸∈怯杉怄哏牭毒喙蠈；停‵usarium oxysporum f. sp. momodicae）引起的一種嚴(yán)重危害苦瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的土傳病害[4]，任何時(shí)期均可發(fā)病，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致整株死亡[5]。傳統(tǒng)生產(chǎn)上多采用化學(xué)農(nóng)藥防治苦瓜枯萎病的發(fā)生，但普遍存在污染環(huán)境和破壞生態(tài)的潛在風(fēng)險(xiǎn);雖然生產(chǎn)中也選用嫁接換根的方式防治苦瓜枯萎病，但高抗砧木資源的匱乏和較高的生產(chǎn)成本導(dǎo)致防效欠佳且難以實(shí)現(xiàn)。因此急需一種生態(tài)環(huán)保、綠色有效的方法來防控苦瓜枯萎病的發(fā)生。

化感作用這一概念是由奧地利科學(xué)家MOLISCH在1937年首次提出，主要是指植物之間相互作用的化學(xué)關(guān)系[6]。現(xiàn)被定義為一種植物通過向環(huán)境釋放化感物質(zhì)而對(duì)另外一種植物（或微生物）所產(chǎn)生的直接或間接的有害或有益的作用[7]?；凶饔檬侵参锿ㄟ^向環(huán)境釋放化感物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)的，化感物質(zhì)主要通過雨霧淋溶、自然揮發(fā)、根系分泌、植株分解4種途徑釋放到環(huán)境中。植物根系分泌的化感物質(zhì)對(duì)防治土壤線蟲、土傳真菌病害都具有重要作用[8-9]。間套輪作模式是減輕土傳病害的有效方法之一，寄主植物的根系分泌物能夠刺激尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)，因此與非寄主植物輪作能夠抑制寄主植物枯萎病的發(fā)生[5]。蔥蒜類作物是良好的前茬作物，也是公認(rèn)的化感作物，已廣泛應(yīng)用到間套輪作的栽培模式中。大蒜、蒜苗、洋蔥等蔥蒜類蔬菜作物的根系分泌物通過改善土壤微生態(tài)環(huán)境，能夠有效減少土傳病害的發(fā)生，從而緩解連作障礙[10-12]。

植物源殺菌劑對(duì)環(huán)境和人類健康的危害較小，長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是化學(xué)殺菌劑的理想替代品。韭菜（Allium tuberosum L.）也是主要的蔥蒜類蔬菜作物。韭菜提取物對(duì)多種植物致病菌的生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用，如甘藍(lán)枯萎病菌[13]、香蕉枯萎病菌[14]、蘋果輪紋病菌[15]、棉花黃萎病菌[16]、柑橘青霉病菌[17]、芒果蒂腐病菌[18]等。韭菜提取物通過影響孢子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝來抑制番茄尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. radicis- lycopersici）孢子的萌發(fā)[19]。香蕉和辣椒與韭菜間作可以有效控制香蕉枯萎病和辣椒疫病的發(fā)生，實(shí)現(xiàn)生態(tài)防控[20-21]。關(guān)于韭菜根系分泌物化感作用的研究較少，特別是研究韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌的化感作用尚未見報(bào)道。

本研究采用水培法收集韭菜根系分泌物，通過菌絲生長(zhǎng)速率和孢子萌發(fā)法研究韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌的化感作用，采用氣相質(zhì)譜-色譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）鑒定化合物組成成分，根據(jù)鑒定結(jié)果篩選韭菜根系分泌物中可能的有效化感物質(zhì)，進(jìn)一步通過菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)法驗(yàn)證其對(duì)苦瓜枯萎病菌的化感作用，明確主效化感物質(zhì)，以期為利用韭菜間套作苦瓜誘導(dǎo)枯萎病抗性的研究和研制植物源抑菌劑提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

韭菜品種：‘山東雪韭6號(hào)’。

供試病原菌：苦瓜枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. momodicae），由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所陳振東研究員提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?韭菜根系分泌物的收集 ?參考韓旭等[22]的方法，略有改動(dòng)。用蒸餾水洗凈韭菜根系，盡量保證不傷根系，置于水培裝置中;將配制好的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液注入水培裝置，用量以剛好沒過韭菜整個(gè)根部為宜，每5 d收集一次根系分泌物，并更換新的營(yíng)養(yǎng)液，共收集6次并混勻;最后一次收集根系分泌物后用蒸餾水沖洗韭菜根系，去除營(yíng)養(yǎng)液殘留，用濾紙拭干其表面多余水分并稱重。將已收集的根系分泌物通過0.45 μm的水系微孔濾膜抽濾，再減壓濃縮到0.5 g/mL（以韭菜鮮根重量計(jì)算），即為根系分泌物的母液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?苦瓜枯萎病菌菌落直徑的測(cè)定 ?采用菌絲生長(zhǎng)速率法[23]測(cè)定菌落直徑。待PDA培養(yǎng)基冷卻，將根系分泌物按不同比例加入PDA培養(yǎng)基中，配制終濃度為0 mg/mL（CK）、1.76 mg/mL（T1）、3.22 mg/mL（T2）、4.46 mg/mL（T3）、5.52 mg/mL（T4）的平板;用直徑為7 mm的滅菌打孔器在供試苦瓜枯萎病病原菌菌落邊緣打制大小一致的菌餅，將其接種在含有根系分泌物的各平板中央，每皿1個(gè)菌餅，每個(gè)處理3次重復(fù)，26℃恒溫培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑（cm），計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

1.2.3 ?苦瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的測(cè)定 ?采用田丹丹等[24]等方法測(cè)定孢子萌發(fā)率。將供試苦瓜枯萎病病原菌接種在PDB培養(yǎng)基中，120 r/min、26℃振蕩培養(yǎng)7 d，四層無菌紗布過濾，用無菌水將孢子懸浮液稀釋至103 CFU/mL。配制不同濃度PDA培養(yǎng)基（同1.2.2），取100 μL配制好的孢子懸浮液加至平板中，用涂布棒均勻涂抹，26℃恒溫培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理的孢子萌發(fā)個(gè)數(shù)，每個(gè)處理3次重復(fù)，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率（%）。

孢子萌發(fā)抑制率=（對(duì)照孢子萌發(fā)數(shù)-處理孢子萌發(fā)數(shù)）/對(duì)照孢子萌發(fā)數(shù)×100%

1.2.4 ?韭菜根系分泌物分離及GC-MS鑒定 ?采用萃取法[25]對(duì)韭菜根系分泌物進(jìn)行分離。取根系分泌物母液200 mL，按溶液極性依次用石油醚、正己烷、乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷5種有機(jī)溶劑按體積比1∶1的比例萃取后，將上述各組分分別經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，溶于5 mL色譜純甲醇中，用于GC-MS鑒定。

采用GC-MS鑒定（Agilent 7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀）韭菜根系分泌物的化合物組成。色譜條件：DB-5石英毛細(xì)管柱（30 m× 0.25 mm，膜厚度0.25 μm）;載氣He，流速1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度250℃;程序升溫：柱溫50℃（保持2 min），以6℃/min程序升溫至250℃（保持15 min）。質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃;四極桿溫度150℃;EI源（電子轟擊源），轟擊電壓70 eV;掃描范圍m/z 30～600 amu;1 μL進(jìn)樣，不分流，溶劑延遲時(shí)間為2.8 min。根據(jù)數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果，選擇相似度≥70%的化合物作為根系分泌物中可能的有效化感物質(zhì)。

1.2.5 ?韭菜根系分泌物主效化感物質(zhì)的驗(yàn)證 ?根據(jù)GC-MS鑒定結(jié)果，篩選韭菜根系分泌物可能的有效化感物質(zhì)為鄰苯二甲酸二丁酯（A）、2，4-二叔丁基苯酚（B）、2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯）（C）。將A溶于色譜純甲醇溶液中，配制成5、10、50、100 mmol/L母液，按1∶100的比例添加到已滅菌的PDA培養(yǎng)基中制成終濃度為0.05 mmol/L（A1）、0.1 mmol/L（A2）、0.5 mmol/L（A3）、1.0 mmol/L（A4）的平板待用;將B配制成0.5、1、5、10 mmol/L母液，同樣按1∶100的比例制成終濃度0.005 mmol/L（B1）、0.01 mmol/L（B2）、0.05 mmol/L（B3）、0.1 mmol/L（B4）的平板備用;將C溶于色譜純甲醇溶液中，配制成5、10、50、100 mmol/L母液，按1∶100的比例添加到已滅菌的PDA培養(yǎng)基中制成終濃度為0.05 mmol/L（C1）、0.1 mmol/L（C2）、0.5 mmol/L（C3）、1.0 mmol/L（C4）的平板待用。3種化感物質(zhì)的驗(yàn)證均以含有1%色譜純甲醇的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照（CK）。接種菌餅和涂布方法同1.2.3和1.2.4。

1. 3 ?數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同濃度韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌的化感作用

2.1.1 ?對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 ?由圖1可以看出，隨著根系分泌物濃度的增加，菌落直徑呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，T2處理達(dá)到最小值。培養(yǎng)7 d時(shí)，CK的菌落直徑為7.3 cm，T1、T2、T3、T4處理的菌落直徑分別為6.2、5.8、6.4、6.7 cm，均顯著低于CK（P<0.05），菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為15.45%、21.6%、12.4%、8.64%。表明韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，低濃度的根系分泌物抑制作用較強(qiáng)，隨著濃度增加，抑制作用反而降低。

2.1.2 ?對(duì)孢子萌發(fā)的影響 ?隨著韭菜根系分泌物濃度逐漸升高，孢子萌發(fā)數(shù)量呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)（圖2）。培養(yǎng)3 d后，CK孢子萌發(fā)個(gè)數(shù)達(dá)到146個(gè)，T1、T2、T3、T4處理的孢子萌發(fā)個(gè)數(shù)分別為126、92、95、119個(gè)，且各濃度處理均顯著低于對(duì)照（P<0.05），孢子萌發(fā)抑制率分別為13.50%、36.84%、35.01%、18.54%。T2處理孢子萌發(fā)數(shù)量最低，抑制率達(dá)最高（36.8%）。表明韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用，并表現(xiàn)為低濃度抑制作用強(qiáng)，高濃度反而弱。

2.2 ? 韭菜根系分泌物不同組分的化感物質(zhì)GC-MS鑒定

2.2.1 ? 石油醚組分鑒定結(jié)果 ?石油醚組分共檢測(cè)出113個(gè)化合物，相似度≥70%的化合物有7個(gè)（表1），分別為苯基甲氧基肟、十二烷、2，4-二叔丁基苯酚、3-十二烷基-2，5-呋喃二酮、2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）、異戌酸乙酯、γ-谷甾醇。此組分中可能的有效化感物質(zhì)為2，4-二叔丁基苯酚和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚），相似度分別為80.63%和87.77%。

2.2.2 ?正己烷組分鑒定結(jié)果 ?正己烷組分共檢測(cè)出133個(gè)化合物，相似度≥70%的化合物有7個(gè)（表2），分別為正辛烷、六甲基環(huán)三硅氧烷、對(duì)二甲苯、正十二烷、3，5-二叔丁基苯酚、2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）、鄰苯二甲酸二辛酯。此組分中可能的有效化感物質(zhì)為2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚），相似度為91.99%。

2.2.3 ?乙醚組分鑒定結(jié)果 ?乙醚組分共檢測(cè)出189個(gè)化合物，相似度≥70%的化合物有23個(gè)（表3）。其中烷烴類包括2-乙氧基-3-氯丁烷、正十二烷;酯類包括鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸-1-丁酯-2-異丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、棕櫚酸甲酯;醇類包括1，2-丁二醇、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、叔十六硫醇;酚類有3，5-二叔丁基苯酚;醛類有甘油縮甲醛，烯類包括（+）-長(zhǎng)葉環(huán)烯、異長(zhǎng)葉烯、長(zhǎng)葉烯，醚類有辛基縮水甘油醚。乙醚組分中可能的有效化感物質(zhì)有鄰苯二甲酸二丁酯，相似度為91.93%

2.2.4 ?乙酸乙酯組分鑒定結(jié)果 ?乙酸乙酯組分共檢測(cè)出160個(gè)化合物，相似度≥70%的化合物有4個(gè)（表4），分別為3-羥基-2-丁酮、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、3，5-二叔丁基苯酚、2，4-二叔丁基苯酚。此組分中可能的有效化感物質(zhì)為2，4-二叔丁基苯酚，相似度為76.92%。

2.2.5 ?三氯甲烷組分鑒定結(jié)果 ?三氯甲烷組分共檢測(cè)出129個(gè)化合物，相似度≥70%的化合物有4個(gè)（表5），分別為（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、間二甲苯、2，4-二叔丁基苯酚、2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）。此組分中可能的有效化感物質(zhì)為2，4-二叔丁基苯酚和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚），相似度分別為78.69%和74.24%。

2.3 ? 韭菜根系分泌物主效化感物質(zhì)的驗(yàn)證

根據(jù)GC-MS鑒定結(jié)果和前人研究結(jié)果[26-28]確定鄰苯二甲酸二丁酯、2，4-二叔丁基苯酚和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）為韭菜根系分泌物的主效化感物質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。3種主效化感物質(zhì)對(duì)苦瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有不同程度的抑制作用。

2.3.1 ?鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)苦瓜枯萎病菌的化感作用 ?由表6可知，隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的升高，苦瓜枯萎病菌菌落直徑和孢子萌發(fā)數(shù)整體呈先下降后上升的趨勢(shì)，且A3（0.5 mmol/L）處理的抑制作用最大，菌落直徑最小，孢子萌發(fā)個(gè)數(shù)最少，此時(shí)抑菌率為33.25%，孢子萌發(fā)抑制率為43.18%，且顯著低于對(duì)照（P<0.05），其余各濃度處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制作用也均達(dá)顯著水平（P<0.05）。

2.3.2 ?2，4-二叔丁基苯酚對(duì)苦瓜枯萎病菌的化感作用 ?隨著2，4-二叔丁基苯酚濃度增加，對(duì)苦瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)抑制作用越來越強(qiáng)，各處理菌落直徑和孢子萌發(fā)數(shù)逐漸降低。即CK>B1>B2>B3>B4，除B1（0.005 mmol/L）處理外，其他各處理均顯著低于對(duì)照（P<0.05），B4（0.1 mmol/L）處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率最高，達(dá)82.93%，對(duì)孢子萌發(fā)抑制率也達(dá)最高，為77.59%（表7）。

2.3.3 ?2，2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）對(duì)苦瓜枯萎病菌的化感作用 ?隨著2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）濃度的升高，菌落直徑先減后增，各處理均顯著低于對(duì)照（P<0.05），且在C3（0.5 mmol/L）處理時(shí)菌落直徑達(dá)到最小，此時(shí)菌落直徑為4.2 cm，抑菌率達(dá)到30.96%。C3（0.5 mmol/L）處理的孢子萌發(fā)數(shù)顯著低于對(duì)照（P<0.05），孢子萌發(fā)抑制率達(dá)21.48%，其他各處理孢子萌發(fā)數(shù)雖均低于對(duì)照，但無顯著差異（P>0.05）（表8）。

3 ?討論

植物在生長(zhǎng)過程中常常受到病原微生物，尤其是病原真菌的危害。近年來，植物根系分泌物在防治真菌病害上深受關(guān)注。植物根系是各種土傳病害的發(fā)生場(chǎng)所。面對(duì)病原菌的侵染，植物通過根系分泌的化感物質(zhì)抑制病原菌，進(jìn)行化學(xué)防御。

韭菜揮發(fā)物和提取物對(duì)植物病害的調(diào)控具有十分重要的作用，如韭菜揮發(fā)物和浸提液均能抑制香蕉枯萎病菌的生長(zhǎng)[29]。香蕉與韭菜間作能夠降低香蕉枯萎病的發(fā)病率[30-31]，韭菜提取液處理蘋果枝條和果實(shí)能夠抑制蘋果輪紋病的發(fā)生[15]。姚琴等[32]研究發(fā)現(xiàn)水培韭菜根系分泌物對(duì)棉花大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。在本研究中，水培韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)菌具有顯著的化感抑制作用。本研究結(jié)果與姚琴等的研究結(jié)果類似，均證明水培韭菜根系分泌物對(duì)植物致病菌具有抑制作用。韭菜和大蒜同屬于蔥蒜類作物，已有研究證實(shí)大蒜根系分泌物對(duì)黃瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌均有顯著的化感作用[33]，因此韭菜根系分泌物對(duì)蔬菜作物致病菌同樣應(yīng)該具有化感作用，本研究發(fā)現(xiàn)韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病致病菌具有顯著的抑制作用，且隨著濃度的升高，抑制作用表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，滿足化感作用低濃度促進(jìn)，高濃度抑制的作用規(guī)律，由此證實(shí)了韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌具有顯著的化感作用，本研究結(jié)果與其一致。廉法卓等[29]采用菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)法研究發(fā)現(xiàn)，韭菜浸提液可抑制香蕉枯萎病菌的生長(zhǎng)，雖然本研究選用的是韭菜根系分泌物和苦瓜枯萎病菌為研究對(duì)象，但是研究結(jié)果也與其相同。前人研究發(fā)現(xiàn)，大蔥根系分泌物對(duì)黃瓜枯萎病病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制作用隨著分泌物濃度的升高而逐漸增強(qiáng)[34]，本研究抑制作用規(guī)律與其不一致，可能是因?yàn)椴煌参锔捣置谖镏餍Щ形镔|(zhì)的種類與含量存在差異，導(dǎo)致對(duì)致病菌的抑制作用規(guī)律也不同，但一致的是，二者均對(duì)枯萎病致病菌有明顯的抑制作用。

RICE[7]將化感物質(zhì)分為15類，分別為簡(jiǎn)單的水溶性有機(jī)酸、直鏈醇、脂肪醇、脂肪族醛和酮;簡(jiǎn)單的不飽和內(nèi)酯;長(zhǎng)鏈脂肪酸和多炔;醌類;簡(jiǎn)單的酚、苯甲酸及其衍生物;肉桂酸及其行生物;香豆素類;黃酮類;單寧;萜類和甾族化合物;氨基酸和多肽;生物堿和氰醇;糖苷硫氰酸酯;嘌呤和核酸和。本研究通過對(duì)韭菜根系分泌物的GC-MS鑒定分析表明，其主要成分為酚類、酯類、烷烴類、醇類、烯類、芳香族，均屬于化感物質(zhì)范疇。吳曉婷等[35]通過GC-MS鑒定水培收集的大蒜根系分泌物，主要成分只有酚類和脂類，本研究鑒定結(jié)果也包含酚類和酯類，但其他組分不同。李敏等[36]鑒定出大蒜連作土壤中的根系分泌物主要有烷烴類、醇類、酯類、苯類等，本研究鑒定結(jié)果與其基本一致。劉素慧[37]鑒定組培大蒜根系分泌物，主要成分有酚類、酸類、酯類和硫化物。周艷麗[38]鑒定水培大蒜主要成分有酚類、酯類、烷烴類、醇類、烯類、芳香族和硫化物。除硫化物外，本研究鑒定結(jié)果與前人的基本一致，可能是蔬菜種類、培養(yǎng)分離條件不同等導(dǎo)致蔬菜生理代謝不同，產(chǎn)生的根系分泌物也不同。

根據(jù)GC-MS鑒定和前人研究結(jié)果，篩選確定韭菜根系分泌物可能的主效化感物質(zhì)為2，4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸二丁酯和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）。鄰苯二甲酸二丁酯已被證實(shí)為大豆、辣椒和馬鈴薯根系分泌物中的主效化感物質(zhì)[39-41]，2，4-二叔丁基苯酚被證實(shí)為蘭州百合根系分泌物中的化感物質(zhì)[42]。2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）廣泛存在于多種植物的根系分泌物中，例如大蒜[43]、核桃[44]、大蔥[45]、蘭州百合[46]。因此，本研究將進(jìn)一步驗(yàn)證這3種化感物質(zhì)對(duì)苦瓜枯萎病菌的化感作用。

通過驗(yàn)證2，4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸二丁酯和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）對(duì)苦瓜枯萎病菌的化感作用，明確其抑菌效果強(qiáng)弱順序?yàn)?，4-二叔丁基苯酚>鄰苯二甲酸二丁酯>2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚），且隨著2，4-二叔丁基苯酚濃度的增加抑菌效果逐漸增加，不同濃度的鄰苯二甲酸二丁酯和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）對(duì)苦瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制的化感作用規(guī)律。鄰苯二甲酸二丁酯可以有效控制雜草[47]和土傳病害[48-49]，能抑制茄子根際黃萎菌的增殖，有效控制茄子土傳病害黃萎病的發(fā)生[48];施用外源鄰苯二甲酸二丁酯能夠有效降低西瓜枯萎病的發(fā)病率[49];大蒜根系分泌物的有效化感物質(zhì)為鄰苯二甲酸二丁酯，分別對(duì)煙草枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑菌作用[26]，本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果一致。2，4-二叔丁基苯酚可以延緩雜草的生長(zhǎng)發(fā)育[27]、影響幼苗生長(zhǎng)發(fā)育和光合作用[50-52]。不僅如此，2，4-二叔丁基苯酚對(duì)秀麗隱桿線蟲和朱砂葉螨有較好的毒殺作用[53-54]。黃煒[55]研究得出百合根系分泌物中的化感物質(zhì)2，4-二叔丁基苯酚與致病鐮刀菌對(duì)百合枯萎病的發(fā)生具有協(xié)同作用，0.05～0.2 mmol/L的2，4-二叔丁基苯酚還能夠促進(jìn)致病鐮刀菌的產(chǎn)孢量，本研究結(jié)果與其不一致，本研究證實(shí)隨著2，4-二叔丁基苯酚濃度的增加，對(duì)苦瓜枯萎病菌的抑制作用不斷增加，0.1 mmol/L處理的孢子萌發(fā)抑制率高達(dá)77.59%，造成不同結(jié)果的原因可能是供試菌種不同導(dǎo)致達(dá)到抑菌作用的濃度不同。已有研究表明2，2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）是野生果實(shí)刺梨（Rosa roxburghii）揮發(fā)油中的主要成分，對(duì)4株多藥耐藥金黃色葡萄球菌均有抑菌活性，并具有抗腫瘤的功效[28， 56]，但其在對(duì)植物病害的抑制作用方面尚未見報(bào)道。本研究證實(shí)2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）對(duì)苦瓜枯萎病菌具有一定的化感抑制作用，且滿足低濃度促進(jìn)，高濃度抑制的化感作用規(guī)律，可將其研發(fā)成植物源殺菌劑防治苦瓜枯萎病。

本研究證實(shí)在體外抑菌試驗(yàn)中，韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌有較強(qiáng)的化感抑制作用，為生產(chǎn)上利用間套輪作韭菜以防控苦瓜枯萎病奠定基礎(chǔ)和提供技術(shù)支撐。通過主效化感物質(zhì)驗(yàn)證試驗(yàn)得出韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌的抑制作用與鄰苯二甲酸二丁酯、2，4-二叔丁基苯酚和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）3種物質(zhì)有關(guān)，為研制植物源殺菌劑防控苦瓜枯萎病提供理論依據(jù)，但關(guān)于韭菜根系分泌物調(diào)控苦瓜枯萎病致病菌的分子機(jī)制和化感作用機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

4 ?結(jié)論

本研究通過體外抑菌試驗(yàn)證實(shí)，水培收集的韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌具有化感作用;通過GC-MS鑒定分析，明確鄰苯二甲酸二丁酯、2，4-二叔丁基苯酚和2，2-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）可能是導(dǎo)致韭菜根系分泌物對(duì)苦瓜枯萎病菌化感抑制作用的主效化感物質(zhì)，進(jìn)一步選用這3種物質(zhì)的外源化學(xué)品驗(yàn)證了其對(duì)枯萎病菌的化感抑制作用，進(jìn)而明確了這3種物質(zhì)均為韭菜根系分泌物發(fā)揮化感作用調(diào)控苦瓜枯萎病菌的主效化感物質(zhì)。

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