基于毛細作用的微藻固定化培養(yǎng)裝置設(shè)計及培養(yǎng)條件研究

楊婷 黃磊

（1.泉州師范學(xué)院交通與航海學(xué)院 福建泉州 362000；2.陸軍裝備部駐南京地區(qū)軍事代表局駐南京地區(qū)第二軍事代表室 江蘇南京 210003）

隨著人們環(huán)保意識的不斷加強與氣候變暖及能源枯竭帶來的影響越來越顯著，對于可再生能源的研究正在如火如荼地進行著。資料顯示，利用微藻作為原料，每公頃的產(chǎn)油量是玉米的348倍，是大豆的68倍[1]。吸附法是利用的是微藻在固體表面由表面靜電力與自身分泌的黏性物質(zhì)（Extracellularpolymericsubstances,EPS）的相互作用所產(chǎn)生的貼壁生長的效果，從而在固體載體表面產(chǎn)生生物膜，但由于這種吸附結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定，在吸附式的固定化培養(yǎng)過程中藻細胞很容易受到流動的培養(yǎng)液的沖刷而脫落。在微藻的培養(yǎng)過程中使用固定化技術(shù)，不僅可以增加微藻生物膜的產(chǎn)量，而且適當(dāng)改變與優(yōu)化一些培養(yǎng)條件后，微藻細胞中有高經(jīng)濟價值的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也會得到提升。

本實驗采用固定化培養(yǎng)模式，利用毛細作用的原理進行營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞。在垂直的空間內(nèi)構(gòu)建出培養(yǎng)載體，提供含水量少但較為濕潤的固體培養(yǎng)基為微藻細胞提供營養(yǎng)支持。此培養(yǎng)方法可以提高微藻細胞與碳源、光源的接觸面積，從而提高微藻的光合作用效率，使其達到快速生長的目的。本實驗運用毛細作用原理進行營養(yǎng)傳質(zhì)內(nèi)在機理的研究，針對固定化培養(yǎng)條件下微藻的生長特性以及空間光稀釋原理和太陽光在微藻固定化培養(yǎng)反應(yīng)器中的運用與實施分析，進行了微藻固定化光學(xué)反應(yīng)器的設(shè)計與搭建，并研究了微藻藻株的屬性不同，承載體材質(zhì)表面的粗糙度及材質(zhì)制作工藝的差異對微藻的生物質(zhì)產(chǎn)率和固定化率的影響。利用此反應(yīng)器對微藻藻種以及培養(yǎng)承載體進行篩選，以獲得最適合的培養(yǎng)藻種與培養(yǎng)載體。將不同材料的載體（人造棉、帆布、氨綸和紗布）與不同種類的藻株（Chlorella pyrenoidosa、Chlorella sp.、Scenedesmus dimorphus、Haematococcus pluvialis、Chlorella vulgaris）進行交叉培養(yǎng)研究，篩選出最優(yōu)的培養(yǎng)組合。利用所得組合進行復(fù)合載體與單一載體在營養(yǎng)傳質(zhì)效率，微藻生長空間等方面的研究。并且分析培養(yǎng)周期、接種密度等對生物質(zhì)產(chǎn)量的影響。

一、材料與方法

（一）藻種。本實驗選用五種帶有明顯差異性的藻種作為培養(yǎng)原料，其分別為雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis FACHB-712）、小球藻（Chlorellasp.FACHB-31）、二型柵藻（Scenedesmus dimorphus FACHB-496）、蛋 白 核 小 球 藻（Chlorellapyrenoidosa FACHB-9）、普通小球藻（Chlorella vulgarisFACHB-1072）。此部分藻種來自中國科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫淡水藻種庫。用于培育其生長的培養(yǎng)液為Modified Basal培養(yǎng)液，其配方見表1。按配方要求將培養(yǎng)液配置完成后需在高壓滅菌儀器中經(jīng)過121℃高溫滅菌15分鐘，經(jīng)滅菌后冷卻至室溫，利用1M的HCL和NaOH溶液將pH調(diào)至7即可。微藻育種培育所使用的容器為150mL錐形瓶，每一育種的錐形瓶內(nèi)需加入100mL左右的培養(yǎng)液，其后在無菌的環(huán)境下加入適量的藻液，放置于水平循環(huán)旋轉(zhuǎn)的搖床上，將時速設(shè)置為105rpm；利用日光燈為微藻提供生長所需的光源，光照強度為100μmol/m2/s，培養(yǎng)周期中每日光照時間為12h；環(huán)境溫度為25±2°C。

表1 Modified Basal培養(yǎng)液配方

（二）培養(yǎng)基與固定化載體材料。本實驗所選用的培養(yǎng)基與上文育種所使用的培養(yǎng)基一致都為Modified Basal培養(yǎng)液，具體成分見表1。

承載體選用四種多滲透孔隙親水材料作為備選，具體為氨綸、紗布、帆布以及棉布，實驗過程中將其裁剪為10cm×100cm的規(guī)格。

骨架材料選取了兩種高聚合物材料聚丙烯（Polypropylene）與聚四氟乙烯（PTEF）、一種金屬材料不銹鋼（Stainlesssteel）以及一種混合物材料玻璃（Glass）作為骨架部分的備選材料，在實驗過程中均裁剪為10cm×50cm的規(guī)格。

（三）儀器設(shè)備、藥品與收獲方式及測定方法。

1.實驗中用到的主要儀器見表2。

表2 主要實驗儀器

2.藥品來源。實驗中用到的主要藥品見表3。

表3 主要實驗試劑

3.收獲方式及測定方法。生物質(zhì)的收獲方式：相較于懸浮培養(yǎng)的方法，固定化微藻生物質(zhì)培養(yǎng)方式簡化了傳統(tǒng)采收后離心、過濾等步驟。由于微藻生物質(zhì)在固定化培養(yǎng)過程中，細胞是在承載體的表面進行生長。在收獲時，只需利用收獲刀片，按照相同頻率與相同力度的經(jīng)驗刮削方法將藻細胞刮入額定300mL的蒸餾水中。

生物質(zhì)濃度DW測量:將采收后的藻液搖勻，抽取適量（如10mL）藻液進行抽濾。所用的濾紙為預(yù)先烘干（95℃，4小時）且參數(shù)為直徑60mm、孔徑0.45μm的玻璃纖維濾紙。并且預(yù)先用濃度為0.65M的甲酸銨溶液洗去培養(yǎng)液中析出的結(jié)晶鹽，將抽濾后的帶有微藻生物質(zhì)膜的濾紙置于95℃的烘箱內(nèi)干燥4小時。將過濾后的濾紙重量減去過濾前的濾紙重量，其重量之差便是抽濾體積狀態(tài)下的微藻生物質(zhì)干重DW。

微藻的生物質(zhì)產(chǎn)率ABP與吸附率AR根據(jù)以下公式計算得出：

其中；DW2為從承載體表面收集的微藻生物質(zhì)濃度（g/L）；V2為微藻固定化培養(yǎng)收獲體積（L）；A為培養(yǎng)單元的占地面積（m2）；DW1為儲液槽中懸浮部分的微藻生物質(zhì)濃度（g/L）；V1為微藻懸浮培養(yǎng)體積（L）；CP為培養(yǎng)時間（day）。

4.提油及產(chǎn)油量測定。油脂提取與含油量計算：在進行提油前，需要對微藻進行破壁處理，利用珠磨破壁機配合0.5 mm玻璃珠破壁3min。加入與破壁藻液等體積的正己烷進行萃取，利用渦流振蕩器將兩者均勻混合，離心分層（4000 rpm，3 min），此后抽取收集懸浮自上層溶有油脂的正己烷，重復(fù)兩次。并將抽取收集的溶有油脂的正己烷溶液移至體積為50 mL的圓底燒瓶之中，燒瓶預(yù)先經(jīng)歷洗凈、95℃干燥1.5小時、置于干燥器冷卻、稱重的預(yù)處理。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在真空條件下38℃的水溫中將正己烷揮發(fā)，揮發(fā)后的正己烷經(jīng)冷凝管后回收。經(jīng)此步驟后，油脂將置于圓底燒瓶底部；將其移入95℃的干燥箱中干燥1.5小時，之后冷卻至室溫、稱重。含油量LC的計算公式如下：

其中：W1為油脂提取前空圓底燒瓶的重量（g）；W2為裝有油脂的圓底燒瓶重量（g）；DW為破壁微藻的生物質(zhì)溶度（L），V為破壁微藻的體積（L）。

（四）實驗設(shè)計原理及步驟。

1.微藻固定化培養(yǎng)反應(yīng)器設(shè)計。圖1所顯示的為本實驗方法設(shè)計的培養(yǎng)裝置。該反應(yīng)器的主要組成部分包括：密閉培養(yǎng)單元、培養(yǎng)載體單元、光源供給系統(tǒng)、CO2發(fā)生及供給裝置、流量監(jiān)測系統(tǒng)與通氣道。其中培養(yǎng)液的貯藏裝置為標準750mL的矩形容器組成。承載體豎直懸掛于矩形容器上方，并底部部分區(qū)域（豎直高度3-5cm）浸沒于培養(yǎng)液中，主要作為營養(yǎng)傳遞系統(tǒng)的起始端，利用液體的蒸騰作用作為驅(qū)動力，使得培養(yǎng)液在承載體的毛細管間隙中自下而上的運動。實驗中所采用的CO2供給系統(tǒng)為化學(xué)反應(yīng)式的發(fā)生裝置。結(jié)合培養(yǎng)區(qū)域容積及在培養(yǎng)環(huán)境中所需的CO2（5%）組成濃度，計算出所需的小蘇打與檸檬酸的具體用量通過化學(xué)反應(yīng)的形式產(chǎn)生，并且利用氣體的壓力將CO2氣體壓入培養(yǎng)單元。由于CO2氣體較空氣有著更大的密度，將進氣管道的輸出端布置于培養(yǎng)區(qū)域的上部。氣體發(fā)生系統(tǒng)與培養(yǎng)區(qū)域組成統(tǒng)一的整體，光源采用雙側(cè)光源的設(shè)計，每側(cè)光照強度在0-350μmol/m2/s。

圖1 固定化培養(yǎng)裝置的二維剖面圖

圖2顯示了復(fù)合載體培養(yǎng)系統(tǒng)的三維布置形式。該實驗裝置在上述培養(yǎng)裝置的基礎(chǔ)上進行改進優(yōu)化，將提供微藻生長所需空間的承載體貼附于固體骨架材料表面，組合成復(fù)合載體，其余部分與圖1所示裝置一致。

圖2 基于毛細作用的微藻固定化復(fù)合載體培養(yǎng)系統(tǒng)

2.毛細作用原理。毛細作用的主要驅(qū)動能來源于光能[2]，光能作用于承載體表面后，承載體內(nèi)部的液體吸收光能后產(chǎn)生熱量，并在承載體表面產(chǎn)生蒸騰作用，這部分的蒸騰作用將改變毛細作用內(nèi)部原來保持的力學(xué)平衡。如公式4及圖3所示，根據(jù)能量守恒定律可知，當(dāng)液體在上升的過程中，其吸收進入培養(yǎng)單元光能Iir的部分能量后將會轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w蒸發(fā)所需的能量ET。而這部分水量蒸發(fā)之后承載體內(nèi)部液體的壓力發(fā)生改變，導(dǎo)致儲液槽中的液體產(chǎn)生向上的動能，最終將轉(zhuǎn)換為液體上升的重力勢能EP。貼附于承載體表面的微藻細胞吸收光能部分能量，將其轉(zhuǎn)換為生物質(zhì)能EB。并且由于整個過程并不為完全的理想狀態(tài)，將會產(chǎn)生一部分的能量損失Qex。

圖3 毛細作用固定化培養(yǎng)方式原理圖

3.固定化藻種篩選實驗。利用如圖1所示反應(yīng)器，選取五株差異性明顯的藻種，在接種密度為10g/m2，雙側(cè)光照，每側(cè)光照條件為300μmol/m2/s（日光燈）；環(huán)境溫度為26±3℃，通入濃度為5%的CO2混合氣體，晝夜周期為12/12的條件下進行為期5天的微藻固定化培養(yǎng)實驗。培養(yǎng)初期儲液槽中加入500mL的Modifiedbasal培養(yǎng)液，每天為其補充損失的培養(yǎng)液補償消耗。以此探究不同藻種對本固定化培養(yǎng)方法的適應(yīng)性，并篩選出最適合固定化培養(yǎng)的藻種用于后續(xù)實驗，實驗分組如表4。

表4 藻種篩選實驗安排

4.固定化承載體篩選實驗。本實驗以微藻在培養(yǎng)周期內(nèi)的生物質(zhì)產(chǎn)量及固定化率為評判標準，利用上述實驗所得的最適宜固定化培養(yǎng)的微藻作為培養(yǎng)藻種，選取四種多滲透孔隙材料作為培養(yǎng)承載體，實驗條件與上述實驗條件相同。探究承載體材料的差異性對微藻生長所產(chǎn)生的影響，具體實驗分組如表5所示。

表5 承載體篩選實驗安排

5.骨架部分對承載體毛細作用的影響實驗。選取裁剪尺寸相同（10cm×100cm）的帆布、氨綸、以及紗布作為承載體材料，利用玻璃作為骨架材料進行骨架部分對承載體毛細作用的影響實驗。利用紅色墨水將培養(yǎng)液體槽中的Modified Basal培養(yǎng)液做標記，以便直觀地觀察到液體上升的最大高度。各組復(fù)合載體試樣垂直懸掛于儲液槽上方，并保持載體底部與染色培養(yǎng)液接觸，接觸高度約為3.5±0.1cm。將實驗組靜置一天，以液體的上升高度作為毛細作用效果的評判標準，具體實驗分組如表6：

表6 毛細作用差異實驗安排

6.固定化復(fù)合載體組合篩選實驗?；谇吧鲜鰧嶒炈玫漠a(chǎn)量與固定化效率最高的兩種承載體材料氨綸（Spandex）與帆布（canvas），將這兩種材料分別貼附于玻璃（Glass）、聚丙烯（Polypropylene）、聚四氟乙烯（PTEF）與不銹鋼（Stainless steel）組合成復(fù)合載體。利用小球藻（Chlorella sp.）作為藻種，進行為期五天的固定化培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與上述實驗相同，實驗安排如表7。

表7 復(fù)合載體篩選實驗安排

二、結(jié)果與分析

（一）藻株屬性不同對毛細作用固定化培養(yǎng)的影響。本次實驗藻種篩選結(jié)果如表8，五種預(yù)選藻種均可在承載體為氨綸的表面生長，將固定化產(chǎn)量與懸浮部分產(chǎn)量對比，生物膜的產(chǎn)量都有不同程度的提升（約為6.5至27g/m2/day）?？赡艿脑蚴俏⒃逶诠潭ɑd體表面生長，相對于懸浮培養(yǎng)其光能的傳輸與利用率得到了提升，并且增大了微藻與CO2的接觸表面，提高了微藻的光合作用。這與Ji等在研究中提出的固定化培養(yǎng)方式中微藻對于光照的利用對于懸浮培養(yǎng)更加恒定與高效，并消除了CO2經(jīng)培養(yǎng)液溶解轉(zhuǎn)換成HCO-3再轉(zhuǎn)換成CO2分子的步驟，使微藻可直接利用CO2分子提高了微藻的固碳效率的結(jié)論相同[3]。由于藻種屬性的差異導(dǎo)致其懸浮培養(yǎng)的生長情況也不盡相同，小球藻（Chlorellasp.）與核蛋白小球藻（C.pyrenoidosa）懸浮培養(yǎng)產(chǎn)量相近，但固定化培養(yǎng)差異明顯。小球藻（Chlorella sp.）高效的固碳效率在固定化培養(yǎng)中優(yōu)勢明顯，經(jīng)五天的培育生長其單位面積的固定化產(chǎn)量明顯要高于其余四種藻株的單位面積固定化產(chǎn)量，達到最大的30.65±1.050g/m2/day，與此同時固定化率也達到了80.972±2.169%。然而固定化率最高的藻種并非小球藻（Chlorellasp.）。雨生紅球藻（H.pluvialis）在固定化培養(yǎng)后達到了83.912±3.742%的固定化率。這是由于相較于其他微藻雨生紅球藻的體積較大，單獨個體所需的能量較體積較小的藻株個體要大，在懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下由于營養(yǎng)傳質(zhì)效率較低生長較為緩慢[4]，在懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下與其他藻株相比較其懸浮生長的產(chǎn)率較低。

表8 五類微藻毛細作用固定化培養(yǎng)生物膜產(chǎn)率及固定效率

（二）培養(yǎng)載體材料的不同對微藻生長的影響。研究表明，微藻可在某些固體表面生長，2010年Johnson and Wen研究發(fā)現(xiàn)小球藻（Chlorella sp.）在聚苯乙烯泡沫板的生長狀態(tài)要好于硬紙板、聚乙烯以及海綿[5]。2014年，Lee等利用污水進行微藻的固定化培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)使用尼龍是一種較為經(jīng)濟且效果突出的固定化培養(yǎng)載體[6]。近年，Zhang等利用富集靜電力的毛絨布料作為固定化載體也取得了60g/m2/day的生物膜產(chǎn)量[7]。

圖4（a）所示數(shù)據(jù)顯示，以帆布、氨綸、紗布和棉布這四種材料作為微藻的承載體，微藻均能在其表面生長。微藻生物質(zhì)的產(chǎn)量較懸浮培養(yǎng)方法有所提高。通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量最少的棉布承載體與其他三種材質(zhì)的承載體還是存在一些差距，可能原因是對比這四種材料，棉布的整體質(zhì)地較為纖細，在培養(yǎng)的過程中耐受性不強，影響了微藻的貼附以及毛細作用的營養(yǎng)傳質(zhì)，也反映出固定化承載體的材質(zhì)是微藻積累生物膜的一個重要影響因素。資料表明，材料表面的粗糙度，親水性及生物毒性等都會對微藻的生長產(chǎn)生影響[8-9]。在四種材料中，帆布的表面粗糙度最大，微藻在其表面遇到的阻力也最大，這便導(dǎo)致了微藻脫落率較低，使其微藻的固定化率達到最大值85.18±3.89%。但也是由于表面粗糙度較大，使微藻的生長擴張阻力較大，該承載體表面的生物膜產(chǎn)量并未達到最大值。相較帆布，氨綸的表面較為光滑，并且材質(zhì)有彈性。針織結(jié)構(gòu)中的松散間隙也促進了毛細作用的效果。在收獲時，由于氨綸表面較為光滑且材質(zhì)較為輕薄，最終獲得了最大的生物膜產(chǎn)量31.0±1.1g/m2/day。

圖4 微藻在不同培養(yǎng)承載體上的產(chǎn)率及固定化率

（三）骨架部分對承載體毛細作用的影響。圖5顯示了帆布，氨綸以及紗布貼附于玻璃骨架后液體上升高度所產(chǎn)生的變化程度。以帆布作為承載體的復(fù)合載體，液體所能上升的高度最高，可以達到38.672±0.778cm。而若單純使用承載體進行毛細作用，所達到的最低高度僅為18.906±0.444cm。將各承載體材料是否加入骨架部分液體上升的高度進行對比，發(fā)現(xiàn)帆布在加入骨架部分后液體上升的改變量最大，骨架部分的加入對帆布的影響效果最為明顯。可能的原因，帆布較其余兩種材料厚度較大，吸水量較多，并且表面凹凸較為明顯，與固體骨架玻璃接觸后吸力較強，對骨架的正壓力較大，提高了液體在復(fù)合載體表承托效果。

圖5 三種承載體貼附于玻璃骨架后與單一載體時所產(chǎn)生的毛細作用差異

從圖5所示，將不同的載體材料貼附于玻璃材質(zhì)的平板表面（作為骨架）后液體上升高度都有了一定的提升。承載體與骨架的接觸面存在較大的縫隙，這樣便在接觸表面產(chǎn)生二級的毛細管作用。隨著液體的高度不斷上升，縫隙間的液體使承載體與骨架產(chǎn)生橋接的作用[10]，并且由于此狀態(tài)下表面張力的方向并不豎直向上，產(chǎn)生面向骨架部分的分力將促使承載體向骨架材料貼附，導(dǎo)致了縫隙液體在上升的過程中所處的毛細孔徑不斷減小，孔徑的液體壓力不斷上升。研究表明，當(dāng)液體內(nèi)部壓力處于改變的狀態(tài)時，會產(chǎn)生沿改變方向的毛細作用力[11]，由此在一定程度上增強了復(fù)合載體的毛細作用效果。

（四）復(fù)合載體的組合方式對微藻生長所產(chǎn)生的影響。圖6中的A與B分別為采用氨綸與帆布貼附于4種固體骨架后的微藻生物膜產(chǎn)量與固定化效率的差異。從A與B中的數(shù)據(jù)可以看出，在不同的復(fù)合載體條件下，微藻生物質(zhì)的產(chǎn)量呈現(xiàn)在26.6±0.1g/m2/day到49.15±0.75g/m2/day的范圍，最大的產(chǎn)量發(fā)生在使用帆布作為承載體與聚丙烯作為骨架的復(fù)合載體，其經(jīng)五天培養(yǎng)后達到了245.75g/m2，并且微藻的固定化率也達到了最大值92.50±1.02%。對此微藻進行提油，微藻生物油產(chǎn)率分別為38.56%和18.95 g/m2/day。對比不同承載體材質(zhì)對微藻生長所產(chǎn)生的差異，微藻在帆布作為承載體的復(fù)合載體上的固定化產(chǎn)率要好于使用氨綸作為承載體的復(fù)合載體。可能的原因是帆布的厚度與其保水量要好于氨綸，并且與氨綸光滑的表面不同，帆布的表面較為凹凸，貼附于固體骨架后產(chǎn)生的毛細壓力較大，兩者貼附性較好，為微藻以及培養(yǎng)液的傳質(zhì)提供了較好的支撐作用。

圖6 骨架及承載體材料組合篩選

三、結(jié)論

基于毛細作用以空間光稀釋原理和太陽光能量利用為基礎(chǔ)設(shè)計并搭建的微藻固定化培養(yǎng)光生物反應(yīng)器在能源微藻產(chǎn)量的培養(yǎng)方面較傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)方式有較大的提高：基于毛細作用的微藻固定化培養(yǎng)方式具有可行性，可以達到營養(yǎng)傳質(zhì)與微藻生長的目的，相較懸浮培養(yǎng)方法，此固定化培養(yǎng)方法提高了土地的利用率增加了微藻單位面積的產(chǎn)量。在以氨綸為載體的微藻固定化生物反應(yīng)器的藻株篩選實驗中，不同藻株的藻種生物膜的產(chǎn)量都有不同程度的提升，小球藻（Chlorellasp.）高效的固碳效率在固定化培養(yǎng)中優(yōu)勢明顯，其固定化產(chǎn)量達到30.65±1.050g/m2/day，固定化率也達到了80.972±2.169%。而藻株細胞較大的雨生紅球藻（H.pluvialis）在固定化培養(yǎng)后達到了83.912±3.742%的固定化率。表面較為光滑且材質(zhì)較為輕薄的氨綸，收獲中的損失量較少，獲得了最大的生物膜產(chǎn)量31.0±1.1g/m2/day。表面粗糙度最大的帆布，其固定化率達到最大值85.18±3.89%。固體骨架有助于提高復(fù)合載體毛細作用的效果，適當(dāng)?shù)某休d體與骨架的組合可以增加營養(yǎng)液的傳質(zhì)效率，擴大培養(yǎng)區(qū)域的面積，提高微藻的產(chǎn)量。在不同的復(fù)合載體條件下，微藻生物質(zhì)的產(chǎn)量呈現(xiàn)在26.6±0.1g/m2/day到49.15±0.75g/m2/day的范圍，最大的產(chǎn)量發(fā)生在使用帆布作為承載體與聚丙烯作為骨架的復(fù)合載體，其經(jīng)五天培養(yǎng)后達到了245.75g/m2，并且微藻的固定化率也達到了最大值92.50±1.02%。對此微藻進行提油，微藻生物油產(chǎn)率和產(chǎn)量分別為38.56%和18.95g/m2/day。